一株可降解三乙胺的索氏菌、選育方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株可降解三乙胺的索氏菌、選育方法及應(yīng)用。從南京市某污水處理廠長(zhǎng)期處理含三乙胺廢水的二沉池污泥中分離、篩選得到了三乙胺特效降解菌株T12，經(jīng)鑒定為索氏菌（Thaurea?sp.），命名為（Thaurea?sp.）T12，GenBank登陸號(hào)為KF019186，菌株已于2013年10月17日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號(hào)為CCTCC?NO:M2013477。該菌株為國內(nèi)外第一株可用于三乙胺廢水處理的索式菌，和其他三乙胺降解菌株相比，該菌株具有高效的三乙胺降解能力、很好的適應(yīng)能力及耐受性能，在高濃度三乙胺廢水的處理中具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】—株可降解三乙胺的索氏菌、選育方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境有機(jī)污染物生物處理【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株降解三乙胺的細(xì)菌、選育方法及其在廢水生物處理和環(huán)境污染修復(fù)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]三乙胺(TEA)有廣泛的用途，在化工行業(yè)中被用作溶劑和催化劑，在有機(jī)合成材料中作為原料，三乙胺有毒并具有強(qiáng)烈的氨臭味。在一些工業(yè)廢水中三乙胺含量很高，嚴(yán)重威脅環(huán)境和人類的健康。因此，將三乙胺從環(huán)境中去除是非常重要的。目前，三乙胺的去除方法主要分為三類:物理法、化學(xué)法和生物降解法。但由于物理化學(xué)法處理三乙胺廢水成本高，通常會(huì)有二次污染。因此，一般更傾向于用生物降解法處理三乙胺。
[0003]生物降解法是一種有效去除有機(jī)物的方法，因?yàn)槌杀镜汀⒂型耆到獾目赡苄?。目前，用生物法處理三乙胺的研究少之甚少，能降解三乙胺的純菌株包括假單胞菌屬RA1，分支桿菌屬RA2和節(jié)桿菌屬R4，它們能以三乙胺作為唯一的碳源和氮源。然而，至今并未出現(xiàn)關(guān)于索氏菌sp.)降解三乙胺的報(bào)道。此外，目前已報(bào)道的大部分三乙胺降解菌對(duì)三乙胺的耐受濃度低(小于100mg/L)，降解速率慢，難以滿足實(shí)際工程應(yīng)用的要求。降解效率高、對(duì)三乙胺耐受濃度高、能適應(yīng)真實(shí)環(huán)境的的新型、高效降解菌的篩選具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對(duì)目前三乙胺降解菌株對(duì)三乙胺耐受濃度低、處理效率低、菌株種類較為單一等不足，提供一株可高效降解三乙胺的新型菌株sp.) T12。
`[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供一株可高效降解三乙胺的新型菌株{Thaurea sp.)T12的選育方法。
[0006]本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供(Saarea sp.) T12在含三乙胺廢水處理領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0007]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的技術(shù)解決方案是:本發(fā)明從南京市某污水處理廠長(zhǎng)期處理含三乙胺廢水的二沉池污泥中分離、篩選得到了三乙胺特效降解菌株T12，經(jīng)鑒定為索氏菌(.Thaurea sp.)，命名為(Jhaurea sp.)T12，GenBank 登陸號(hào)為 KF019186，菌株已于 2013 年10月17日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2013477。該菌株為國內(nèi)外第一株可用于三乙胺廢水處理的索式菌。
[0008]一株可高效降解三乙胺的新型菌株(Saareasp.)T12的選育方法，包括以下步驟:
(I)菌株的馴化:取10 mL長(zhǎng)期用來處理三乙胺的污泥水與200 mLMSM無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基混合，放入500 mL錐形瓶中，150轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速、30°C搖床培養(yǎng)6h，過濾棄去沉淀，將濾液按接種量5%轉(zhuǎn)接到含100 mg/L三乙胺的MSM無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，150轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速、30°C培養(yǎng)48h后，重復(fù)該過程直至三乙胺基本去除，然后再以7 d為一個(gè)馴化周期，三乙胺按100mg/L濃度差遞增，馴化4個(gè)周期后得到菌懸液；
(2)菌株的分離:將所得的菌懸液用無菌水按10倍逐級(jí)稀釋到IO6-1O9倍，涂布于以三乙胺為唯一碳氮源的MSM無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上,放入培養(yǎng)箱中30°C倒置培養(yǎng),隨時(shí)觀察菌株的生長(zhǎng)情況，72h后挑取單菌落，在含400 mg/L三乙胺的MSM無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線分離純化，重復(fù)數(shù)次，得到單菌落，并進(jìn)行斜面保存；
(3)菌株的篩選:挑取分離所得到的單菌落，分別接種于含400mg/L三乙胺的MSM無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)56 h，測(cè)定培養(yǎng)基中三乙胺濃度變化，并選取培養(yǎng)基中三乙胺濃度顯著降低的單菌落。
[0009]一株可降解三乙胺的索氏菌的應(yīng)用，將上述培養(yǎng)得到的菌株T12制備成種子液，用于三乙胺的廢水處理中，廢水pH值為7-8，廢水中三乙胺濃度不大于400mg/L。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明所提供的(raa?rmSp.)T12，可以以三乙胺為唯一碳源、氮源進(jìn)行生長(zhǎng)。本發(fā)明直接采用以三乙胺為唯一碳源和氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行三乙胺降解菌的富集，并采用以三乙胺為唯一碳源、氮源的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行分離，篩選過程迅速快捷，在該培養(yǎng)基上雜菌較少，減少了復(fù)篩的工作量。
[0011]三乙胺廢水的應(yīng)用研究表明，篩選得到的(Saareasp.)Τ12，可在56h內(nèi)實(shí)現(xiàn)濃度為400mg/L的三乙胺廢水的處理，三乙胺降解率分別達(dá)到100%。在三乙胺濃度為0_400mg/L的范圍內(nèi)，(Saareasp.)T12可正常生長(zhǎng)并實(shí)現(xiàn)三乙胺的完全降解。在pH為7.0-8.0的范圍內(nèi)，(.Thaureas\>.) T12對(duì)三乙胺有較好的降解。低濃度(200mg/L)易降解碳源乙酸鈉的加入可對(duì)三乙胺降解起促進(jìn)作用。和其他三乙胺降解菌株相比，該菌株具有高效的三乙胺降解能力、很好的適應(yīng)能力及耐受性能，在高濃度三乙胺廢水的處理中具有良好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是本發(fā)明菌株的掃描電鏡照片(a 8000倍，b20000倍)。
[0013]圖2是本發(fā)明菌株似sp.)T12的生長(zhǎng)曲線、對(duì)三乙胺的降解曲線、降解過程中氨氮的釋放的變化情況。
[0014]圖3是本發(fā)明廢水中三乙胺濃度對(duì)菌株(Saaraa sp.)Τ12的生長(zhǎng)和三乙胺降解的影響。
[0015]圖4是本發(fā)明廢水pH對(duì)三乙胺降解的影響。
[0016]圖5是本發(fā)明廢水中易降解碳源的存在對(duì)三乙胺降解的影響。
[0017]圖6為本發(fā)明菌株(TXatfreasp.) T12的16S rDNA序列表。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0019]實(shí)施例1:三乙胺降解菌(Saara3sp.)T12的馴化、篩選分離及其對(duì)三乙胺的降解性能
⑴菌株的馴化分離取10 mL污泥水(取自于南京市某污水處理廠用于長(zhǎng)期處理三乙胺廢水的污泥)與200mL MSM無機(jī)鹽培養(yǎng)基混合，放入500 mL錐形瓶中，150 rpm轉(zhuǎn)速、30°C搖床培養(yǎng)6h，過濾棄去沉淀。將濾液(接種量5%)轉(zhuǎn)接到三乙胺濃度為100 mg/L的MSM無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，150轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速、30°C培養(yǎng)48h后，三乙胺基本去除，然后重復(fù)該過程2次。以7 d為一個(gè)馴化周期，三乙胺以100 mg/L濃度差從100 mg/L遞增至400 mg/L，馴化4個(gè)周期后，直至三乙胺幾乎去除后，將所得的菌懸液用無菌水以數(shù)量級(jí)10倍逐級(jí)稀釋IO6-1O9倍，涂布于以三乙胺為唯一碳氮源的MSM無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上,放入培養(yǎng)箱中30°C倒置培養(yǎng),隨時(shí)觀察菌株的生長(zhǎng)情況，72h后挑取單菌落，在三乙胺濃度為400 mg/L的MSM無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線分離純化(重復(fù)4次)，得到單菌落，并進(jìn)行斜面保存。
[0020]MSM無機(jī)鹽培養(yǎng)基的組成如下:0.76g KH2PO4, 3.06g Na2HPO4.12H20，0.05g CaCl2,
0.2g MgSO4.7H20, IOmL 微量元素溶液 YK-1, 1000mL 蒸餾水。
[0021]其中微量元素溶液YK-1 為:0.2g/L FeSO4.7H20,0.5g/L EDTA,0.0OlgZnSO4.7Η20，0.003g MnCl2.4Η20，0.03g H3BO4,0.02g CoCl2.7Η20，0.0Olg CuCl2.2H20,
0.002g NiCl2.6H20，0.003g Na2MoO4.2H20, 1000mL 蒸餾水
(2)菌株的篩選
挑取分離所得到的單菌落，分別接種于三乙胺濃度為400mg/L、以三乙胺為唯一碳源和氮源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)56 h ;測(cè)定培養(yǎng)基中三乙胺濃度變化，如果培養(yǎng)基中三乙胺濃度顯著降低，即可表明三乙胺發(fā)生了降解。在分離得到的單菌落中，命名為T12的菌株降解性能最為優(yōu)異，因此選取該菌株作后續(xù)的鑒定。
[0022]⑶菌株的鑒定
對(duì)細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化測(cè)試。測(cè)定菌株的16S rDNA序列，將菌株的16S rDNA基因序列與國際GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行網(wǎng)上同源性比較，最終從分子水平上確定該菌的種屬。
[0023]-X形態(tài)、生化特征:T12菌落呈白色，圓形，邊緣整齊，光滑濕潤。該菌株細(xì)胞呈短桿狀，表面光滑，長(zhǎng)度約2.5-3.6 um。T12為革蘭氏陰性菌。好氧，最適降解pH范圍為
7.0-8.0，最適生長(zhǎng)溫度為30-35°C。圖1中為T12的掃描電鏡照片。
[0024]f分子生物學(xué)鑒定:以T12菌的核DNA為模板，以16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增的通用引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)定其全序列，T12的16S rDNA基因序列見圖6所示的序列表。將菌株的16S rDNA基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(GenBank登陸號(hào)為KF019186)，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行網(wǎng)上同源性比較，結(jié)果表明，?\2與Thaurea sp.PIV-1、Thaurea sp.Sgz-1和TXaareasp.R-25071等菌株的同源性最高,序列相似度高達(dá)99%以上。
[0025]根據(jù)T12的形態(tài)學(xué)、生化測(cè)試以及分子生物學(xué)分析，T12鑒定為索氏菌{Th蕭冊(cè)sp.),命名為 ijhaurea sp.) T12。
[0026](4)菌株對(duì)三乙胺的降解及在三乙胺廢水處理中的應(yīng)用
將三乙胺降解菌株T12接種至添加已滅菌的LB培養(yǎng)基中，30°C條件下以150轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)，進(jìn)行T12的富集培養(yǎng)，待菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期(約48h)，將所得菌體用5000Xg的轉(zhuǎn)速離心分離10分鐘，撇去上清液，采用渦旋震蕩的方法將菌體重新懸浮于無菌液體MSM，離心。重復(fù)洗滌過程三次后，將菌體重新懸浮于無菌液體MSM無機(jī)鹽培養(yǎng)基中(調(diào)節(jié)加入的MSM量，控制菌懸浮液OD6tltl約為0.5)，得到種子液。
[0027]配制加入300mg/L三乙胺的液體MSM作為模擬廢水，將上述種子液加入模擬三乙胺廢水中，30°C條件下以150轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)，觀測(cè)降解過程中廢水中三乙胺濃度、氨氮濃度以及細(xì)菌生長(zhǎng)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，300mg/L三乙胺可于40h內(nèi)幾乎完全降解；伴隨著三乙胺的降解，細(xì)菌生物量顯著增長(zhǎng)，三乙胺降解過程中，三乙胺結(jié)構(gòu)中的氮以氨氮的形式釋放出來，最終濃度達(dá)到35.41mg/L,是理論氨氮釋放值的85.9%,
本實(shí)施例說明分離得到的sp.) T12可以利用三乙胺為唯一碳源和氮源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，并可實(shí)現(xiàn)三乙胺的礦化。
[0028]實(shí)施例2:廢水中三乙胺濃度對(duì)三乙胺降解性能的影響
配制MSM無機(jī)鹽液體培養(yǎng)中含三乙胺濃度分別為50、75、100、200、300、400和500 mg/L的溶液作為模擬廢水，將(Saarea sp.) T12種子液以4%的接種量接入模擬廢水。由圖mOJhaurea sp.) T12可實(shí)現(xiàn)三乙胺濃度高達(dá)400mg/L的模擬廢水中三乙胺的完全降解。在三乙胺濃度分別為50、75、100、200、300和400 mg/L時(shí)，分別在16h、20h、28h、36h、40h和56h內(nèi)實(shí)現(xiàn)模擬廢水中三乙胺的完全去除。伴隨三乙胺的降解，細(xì)菌濃度同步增長(zhǎng)。由于三乙胺的毒性和難降解特性，在高濃度條件下，盡管可以實(shí)現(xiàn)三乙胺的完全降解，其降解速率顯著下降。
[0029]本實(shí)施例說明雖然sp.) T12可實(shí)現(xiàn)高濃度三乙胺的完全降解,但處理效率有待改進(jìn)。
[0030]實(shí)施例3:廢水pH值對(duì)三乙胺降解性能的影響
配制MSM無機(jī)鹽液體培養(yǎng)中三乙胺濃度為300mg/L，初始pH為5.0,6.0,6.5,7.0,7.5、
`8.0和9.0的溶液作為模擬廢水，將{Thaurea sp.) T12種子液以4%的接種量接入模擬廢水。由圖4所示，在初始pH為7.0-8.0的條件下，{Thaurea sp.) T12可實(shí)現(xiàn)三乙胺的高效率降解；在初始pH為9.0-10.0的條件下，三乙胺的降解比較緩慢，而在pH為5.0-6.0的條件下，三乙胺降解更為緩慢，延遲期較長(zhǎng)。
[0031]本實(shí)施例說明sp.) T12的降解三乙胺的最佳pH值條件為中性至弱堿性；在PH為7.0-8.0的范圍內(nèi)，三乙胺降解速率相對(duì)較高；較高或較低pH條件則不利于三乙胺的降解。
[0032]實(shí)施例4:廢水中易降解碳源的存在對(duì)三乙胺降解性能的影響
配制MSM無機(jī)鹽液體培養(yǎng)中含三乙胺濃度為300mg/L，外加乙酸鈉濃度分別為200、500和1000mg/L的溶液為模擬廢水，將(Jhmrea sp.) T12種子液以4%的接種量接入模擬廢水。由圖5所示，200mg/L葡萄糖的加入有助于提升三乙胺的降解速率；500mg/L、1000mg/L乙酸鈉的加入則延緩了三乙胺的降解，且隨著外加乙酸鈉濃度的增高，延緩作用加劇。
[0033]本實(shí)施例說明低濃度的易降解碳源的存在有利于{Thaurea sp.) T12的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)了三乙胺的降解過程；高濃度的易降解碳源的存在消耗了氧氣和營養(yǎng)元素，對(duì)三乙胺的降解產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制。
【權(quán)利要求】
1.一株可降解三乙胺的索氏菌，其特征在于它于2013年10月17日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC保藏，保藏單位地址為中國湖北省武漢市武漢大學(xué)保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2013477，命名為索氏菌T12，其分類命名為iThaurea sp.)，GenBank登陸號(hào)為 KF019186。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解三乙胺的索氏菌，其特征在于所述的索氏菌菌落特征為:呈白色，圓形，邊緣整齊，光滑濕潤，該菌株細(xì)胞呈短桿狀，表面光滑，長(zhǎng)度為2.5-3.6um，革蘭氏陰性。
3.一株可降解三乙胺的索氏菌的選育方法，其特征在于包括以下步驟: (1)菌株的馴化:取10mL長(zhǎng)期用來處理三乙胺的污泥水與200 mL MSM無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基混合，放入500 mL錐形瓶中，150轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速、30°C搖床培養(yǎng)6h，過濾棄去沉淀，將濾液按接種量5%轉(zhuǎn)接到含100 mg/L三乙胺的MSM無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，150轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速、30°C培養(yǎng)48h后，重復(fù)該過程直至三乙胺基本去除，然后再以7d為一個(gè)馴化周期，三乙胺按IOOmg/L濃度差遞增，馴化4個(gè)周期后得到菌懸液； (2)菌株的分離:將所得的菌懸液用無菌水按10倍逐級(jí)稀釋到IO6-1O9倍，涂布于以三乙胺為唯一碳氮源的MSM無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上,放入培養(yǎng)箱中30°C倒置培養(yǎng),隨時(shí)觀察菌株的生長(zhǎng)情況，72h后挑取單菌落，在含400 mg/L三乙胺的MSM無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線分離純化，重復(fù)數(shù)次，得到單菌落，并進(jìn)行斜面保存； (3)菌株的篩選:挑取分離所得到的單菌落，分別接種于含400mg/L三乙胺的MSM無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)56 h，測(cè)定培養(yǎng)基中三乙胺濃度變化，并選取培養(yǎng)基中三乙胺濃度顯著降低的單菌落。
4.如權(quán)利要求3所述的可降解三乙胺的索氏菌的選育方法，其特征在于所述的MSM無機(jī)鹽培養(yǎng)基組分組成如 下:0.76g KH2PO4,3.06g Na2HPO4.12Η20、0.05g CaCl2,0.2gMgSO4.7H20、IOmL微量元素溶液YK-1、1000mL蒸餾水，其中微量元素溶液YK-1為:0.2g/L FeSO4.7Η20、0.5g/L EDTA、0.0Olg ZnSO4.7Η20、0.003g MnCl2.4Η20、0.03g Η3Β04、0.02gCoCl2.7Η20、0.0Olg CuCl2.2Η20、0.002g NiCl2.6Η20、0.003g Na2MoO4.2Η20、1000mL 蒸餾水。
5.一種利用權(quán)利要求1所述的可降解三乙胺的索氏菌在三乙胺廢水治理中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的可降解三乙胺的索氏菌在三乙胺廢水治理中的應(yīng)用，其特征在于將索氏菌Τ12制備成種子液，用于三乙胺的廢水處理中，廢水pH值為7-8，廢水中三乙胺濃度不大于400mg/L。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103602619SQ201310594079
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】張晉華, 于昆, 張春艷, 朱曉萌 申請(qǐng)人:南京理工大學(xué)