植物轉(zhuǎn)錄因子dst在調(diào)控植物結(jié)實率及提高植物抗高溫能力中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了水稻轉(zhuǎn)錄因子dst在調(diào)控高溫下植物結(jié)實率以及植物抗高溫能力中的應(yīng)用，其中，所述轉(zhuǎn)錄因子dst包括含有如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還公開了水稻轉(zhuǎn)錄因子dst調(diào)控高溫下植物結(jié)實率的方法以及提高植物抗高溫能力的方法。本發(fā)明克隆得到一個調(diào)控水稻高溫脅迫下結(jié)實率和提高植物耐高溫能力的主效基因。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域特別是提高作物對高溫的耐受性和提高作物結(jié)實率方面具有重要的應(yīng)用前景。
【專利說明】植物轉(zhuǎn)錄因子dst在調(diào)控植物結(jié)實率及提高植物抗高溫能力中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物學及功能基因組學領(lǐng)域，尤其涉及一種水稻轉(zhuǎn)錄因子DST作為一種負調(diào)控因子，在提高高溫情況下的水稻結(jié)實率以及抗高溫能力的方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在全球氣候變暖的大環(huán)境下，極端天氣頻繁發(fā)生，高溫已經(jīng)成為制約水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素之一。2013年許多地區(qū)的溫度和保持高溫的天數(shù)均創(chuàng)歷史新高，嚴重影響了稻米產(chǎn)量與品質(zhì)。然而要尋求在日益飆高的溫度下水稻產(chǎn)量受到較小的威脅，培育耐高溫的水稻品種是防止高溫熱害最簡便有效的途徑，現(xiàn)代分子技術(shù)的發(fā)展和水稻功能基因組研究的深入，為水稻耐高溫遺傳機制的剖析提供了有效手段，而水稻耐熱性機制的闡明和耐熱相關(guān)基因的克隆、鑒定及功能解析是水稻耐熱育種的重要基礎(chǔ)。
[0003]水稻熱害形成是由多種因素共同作用的結(jié)果，其中氣候因子是造成水稻高溫熱害的最主要原因之一，在水稻營養(yǎng)生長期和生殖生長期，外界溫度高于其最適生長溫度一定范圍，就可能造成熱害。在水稻生殖生長期受到熱害造成產(chǎn)量的損失要遠大于營養(yǎng)生長期，其中又以水稻開花期受到高溫影響最大，籽粒灌漿期次之。大量的研究表明高溫脅迫影響水稻的生長發(fā)育、產(chǎn)量、品質(zhì)以及生理生化特性。
[0004]在水稻耐熱性遺傳研究方面，早期研究發(fā)現(xiàn)遺傳因素是決定水稻品種間耐熱性差異的主要原因之一。近年來，隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，出現(xiàn)了一些利用分子標記對水稻耐熱性進行數(shù)量性狀基因定位研究的報道。曹立勇等對水稻秈粳交IR64XAZucena的DH群體以高溫處理后的結(jié)實率與大田結(jié)實率差值為指標，定位了開花結(jié)實期6個耐熱性主效QTL，在8條染色體間還檢測到8對上位性QTL。Zhu etal.(Zhu CL，Xiao YHiWang C M，et al.Mapping QTL for heat2tolerance at grain filling stage inrice [J].Rice Science，2005，12 (I):33-38.)利用98個回交重組自交群體，以適溫粒重與高溫粒重差值除以適溫粒重的百分比作為水稻耐熱性指標，在第1、4、7號染色體上共定位到3個灌衆(zhòng)期耐熱性的主效QTL、8對上位性QTL。Craufurd etal.(Craufurd PQ, JagadishSV, Wheeler TR, et al.Heat tolerance at flowering[C].Abstract, an internationalworkshop on“cool rice for a warmerwold”, 2007.)在用 Bala 與 Azucena 為親本構(gòu)建的186個RILs中，共定位到6個水稻耐熱性QTL和I個細胞膜熱穩(wěn)定性QTL。陳慶全利用人工氣候室模擬自然高溫條件，在水稻開花期對水稻秈秈交202個重組自交系群體進行了耐熱性鑒定，共檢測到7個抽穗開花期耐熱性主效應(yīng)QTL以及7對上位性QTL。在不同時期處理和采用不同鑒定指標進行的這些研究中，檢測的耐熱位點在第1、2、4、5和8染色體上分布較多，但這些研究定位QTLs的圖譜精確性不強，貢獻率不高，因此有待于進一步研究驗證其結(jié)果。另外檢測的耐熱位點在12條染色體上均有分布，耐熱QTL的區(qū)間較大，多個區(qū)間的上位性效應(yīng)也影響水稻的耐熱性，且定位的耐熱位點對表型性狀的解釋率也有很大的差異，說明水稻耐熱性的遺傳基礎(chǔ)非常復(fù)雜。因此要開展分子標記輔助選擇分子育種尚需對這些區(qū)域進行精確定位。
[0005]近年來隨著植物中一些熱脅迫相關(guān)突變體的獲得和轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灥倪M展，人們對植物耐熱性有了更加深入和全面的了解。從植物中獲得了一些與耐熱相關(guān)基因，其中以熱激蛋白基因與熱激轉(zhuǎn)錄因子基因為多。
[0006]熱激蛋白(Hsp)是一個大的基因家族，包括HsplOO、Hsp90、Hsp70 (Dnak)、Hsp60 (GroE)和 Hsp20 或 sHsp 等成員(Nover L, Bharti K, D □ ring P, et al.Arabidopsisand the Hsf world:How many heat stress transcription factors do we need ?[J]Cell Stress Chaperones，2001，6:177-189.)，多數(shù)參與生物體正常的生長發(fā)育過程(Satyal et al, 1998) 0蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)，水稻耐熱品種N22在38°C高溫脅迫下Hsp的表達量很高，其中Hsp20或sHsp在高溫脅迫下表達量最高，表明其在細胞抵抗熱脅迫中發(fā)揮重要的作用(Sanieev K B, Kwan Y C, Markus F, et al.Heat stress responsein plants:a complex game with chaperones and more than twenty heat stresstranscription factors [J].J.Biosc1.2004,29(4):471-487 ；Port M，Tripp J,ZielinskiD, et al.Role of Hspl7.4-CII as coregulator and cytoplasmic retention factorof tomato heat stress transcription factor HsfA2[J].PlantPhysiol.2004,135:1457-1470)。Hong等報道擬南芥HSPlOl的一個突變系表現(xiàn)為熱敏感，將HSPlOl的反義鏈轉(zhuǎn)入擬南芥后檢測到HSP101的表達量下降，植株耐熱性喪失；過表達HSP101的植株對極端高溫的耐受性明顯高于野生型，對玉米HSP101突變體的研究也得到了與擬南芥相似的結(jié)果。通過半定量RT-PCR分析了水稻中9個熱激蛋白基因的表達模式，它們在不同的組織中存在各自不同的表達方式。所有的9個OsHSP基因受熱處理強烈誘導，不受到冷處理誘導。現(xiàn)有研究表明 熱應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子(Hsfs)是熱脅迫防御響應(yīng)中的中心調(diào)節(jié)子。Liu等(Jin-GeLiu, Qiu-1in Qin, Zhen Zhang, R1-He Peng, A1-sheng Xiong, Jian-Min Chen, Quan-HongYa0.0sHSF7 gene in rice, Oryza sativa L., encodes a transcription factor thatfunctions as a high temperature receptive and responsive factor[J].BMB reports,2009,42(1):16-21)利用酵母雜交的方法從水稻中克隆到3個A類熱激轉(zhuǎn)錄因子基因，其中0sHSF7被發(fā)現(xiàn)其表達水平對溫度迅速響應(yīng)，過量表達0sHSF7的單子葉轉(zhuǎn)基因植物，能夠在熱處理時上調(diào)保護作用的基因如熱休克蛋白。Yamanouchi等通過圖位克隆定位水稻斑點葉基因Spl7的候選基因時在第5染色體上發(fā)現(xiàn)I個ORF和熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子高度相似，編碼HSF蛋白。秈粳稻基因組中至少共存在25個Hsf基因，其中0sHsfA2a，OsHsfA2c，OsHsfA2e, OsHsfA4a，OsHsfB2b, OsSHFClb專一性地受熱脅迫誘導表達。根據(jù)OsHsfs蛋白的結(jié)構(gòu)將Hsf分為HsfA，B, C三個家族，熱脅迫下A類Hsfs比B，C兩類有更高的表達。水稻中已經(jīng)鑒定克隆19種Hsf，擬南芥中有21種，但對Hsf功能了解尚淺。
[0007]當熱脅迫發(fā)生時植物體內(nèi)的活性氧含量在較短時間內(nèi)(約15min)上升并超過其閾值，這一信號可被組氨酸激酶和熱激轉(zhuǎn)錄因子所感受，熱激轉(zhuǎn)錄因子中感受H2O2信號主要是HsfA4a，HsfA5對該通路起到負調(diào)控的功能，當活性氧信號減弱，HsfA5與HsfA4a形成異聚體，阻止HsfA4a形成有活性的同源三聚體，將調(diào)控通路中止。Hsfs可將信號通過促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信號通路傳遞到下游的轉(zhuǎn)錄因子，主要包括鋅指蛋白Zat家族、WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族、MBFlcjP NADPH過氧化物酶(Rboh)。已有報道鋅指蛋白Zat家族成員中對熱脅迫響應(yīng)的主要是Zat7、ZatlO和Zatl2。其中Zatl2是APX調(diào)控通路所必需的，并且控制了下游42個脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因。Zatl2對Zat7的表達起到直接的調(diào)控作用。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族中WRKY25對氧化脅迫進行響應(yīng)，并且該響應(yīng)依賴Zatl2的協(xié)助。MBFlc是高度保守的轉(zhuǎn)錄輔激活物，在熱脅迫下表達量提高。將MBFlc基因敲除的植株表現(xiàn)出熱敏感性，并且不能積累SA和海藻糖，表明MBFlc位于SA和海藻糖熱脅迫響應(yīng)通路的上游，對其起到調(diào)控作用。
[0008]AP2/ERF家族是植物中存在的一類特殊轉(zhuǎn)錄因子，擁有共同的保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且多個成員在植物逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，其中，DREB家族成員可在脅迫條件下激活脅迫響應(yīng)基因的表達，而DREB2類調(diào)節(jié)因子主要響應(yīng)熱脅迫，DREB2轉(zhuǎn)錄因子包括DREB2A和DREB2B兩類。在在水稻中起主要作用的是0sDREB2B基因編碼的蛋白，并且該基因具有選擇性剪接的功能。在正常生長條件下，該基因則剪接形成終止密碼子，產(chǎn)生無功能的蛋白，在熱脅迫條件下，該基因編碼產(chǎn)生全長蛋白，調(diào)控下游熱脅迫響應(yīng)基因。
[0009]同時，一些研究者開展了高溫脅迫下水稻花器相關(guān)性狀的基因定位研究，涉及到花藥發(fā)育過程、花藥裂藥的基因控制及逆境條件下與花粉發(fā)育密切相關(guān)的基因，以期調(diào)控花期，減少或避免高溫對水稻花器的傷害，提高水稻結(jié)實率。Zhu等在粳稻品種日本晴的花藥不開裂突變體中發(fā)現(xiàn)了一個控制花藥開裂的基因aidl，此基因存在于葉和穗中，是一個能編碼一個262個氨基酸的蛋白，目前該基因已被定位于水稻第六染色體上。已有的研究發(fā)現(xiàn)控制花藥開裂的基因可能有多個，表明水稻開花裂藥是一個非常復(fù)雜的過程，需要進一步的研究來揭示其分子機理。
[0010]目前，有關(guān)DST作為鋅指轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能的報道僅來自兩個方面:Huang等研究發(fā)現(xiàn)在水稻中DST功能的缺失增加氣孔關(guān)閉的程度，減少了葉片氣孔的密度，從而提高水稻的耐鹽性和抗干旱的能力，并認為這一過程是通過調(diào)控體內(nèi)H2O2的穩(wěn)態(tài)而實現(xiàn)的(Xinyuan Huang, Daiyin Chao, Jiping Gao, et al.A previously unknown zinc fingerprotein, DST, regulat es drought and salt tolerance in rice via stomatal aperturecontrol [J].GENES & DEVELOPMENT，2009，23:1805-1817)。Yuan 等發(fā)現(xiàn) DST 作為轉(zhuǎn)錄因子通過直接調(diào)控水稻體內(nèi)細胞分裂素氧化酶基因0sCKX2的表達，影響內(nèi)源細胞分裂素的合成，來增加水稻的結(jié)實率(Shuyu Li, Bingran Zhao, Dingyang Yuan, et al.Ricezinc finger protein DST enhances grain production through controlling GnIa/0sCKX2expression [J].PNAS, 2013,110:3167-3172)。在其它方面的功能研究均未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明目的是提供一種轉(zhuǎn)錄因子dst的新功能及新用途，即所述轉(zhuǎn)錄因子dst調(diào)控高溫下植物結(jié)實率的用途以及所述轉(zhuǎn)錄因子dst調(diào)控提高植物抗高溫能力的用途。
[0012]本發(fā)明提供了一種分離的轉(zhuǎn)錄因子dst基因，該基因至少含有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；其為一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明轉(zhuǎn)錄因子dst基因可以根據(jù)無性系突變體庫中篩選得到。
[0013]本發(fā)明中，所述轉(zhuǎn)錄因子dst基因還可以是含有如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的高同源性的核苷酸序列，其中，所述高同源性是指同源性> 60%;較佳地，同源性> 80%;更佳地，同源性> 90%或更高。
[0014]本發(fā)明還提出一種轉(zhuǎn)錄因子dst突變體的重組表達載體的構(gòu)建方法，具體步驟為通過數(shù)據(jù)庫中已報道的DST基因的序列設(shè)計引物，通過使用KOD高保真PCR酶克隆得到該基因全長(包括啟動子區(qū)域)為3966bp，利用pCAMBIA1300構(gòu)建該基因的回復(fù)表達載體，測序正確后將載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)中，通過農(nóng)桿菌介導法將基因?qū)氲酵蛔凅w愈傷組織中，再通過抗生素的篩選、分化和鑒定獲得轉(zhuǎn)基因植株。觀察花期高溫處理下回復(fù)材料的結(jié)實率及發(fā)育狀況，明確目的基因與耐高溫表型的相關(guān)性。
[0015]本發(fā)明轉(zhuǎn)錄因子dst可作為在花期高溫情況下的負調(diào)控因子，對高溫脅迫起到負調(diào)控作用，其突變體在40°C 15d的花期處理條件下結(jié)實率明顯優(yōu)于野生型，證明該基因在花期高溫情況下可作為負調(diào)控因子，對高溫脅迫起到負調(diào)控作用。
[0016]本發(fā)明還提出了轉(zhuǎn)錄因子dst在調(diào)控高溫下植物結(jié)實率中的應(yīng)用。所述植物為水稻。
[0017]本發(fā)明還提供了一種調(diào)控高溫下植物結(jié)實率中的方法，分別選取突變體和野生型各300顆飽滿的種子，破休眠誘導生芽生根后，在營養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，在抽穗前一天進行380C，7d，40°C，7d和40°C，15d的高溫處理，每個處理條件選取50個株系。處理結(jié)束后繼續(xù)進行正常培養(yǎng)直至成熟，分別統(tǒng)計處理的和正常培養(yǎng)植株的首穗的結(jié)實率。其結(jié)實率比野生型分別高將近10%、20%和30%。而在40°C 15d的高溫處理條件下野生型(ZHll)結(jié)實率為O。表明該突變體在高溫脅迫條件下，在結(jié)實率方面具有明顯的優(yōu)勢。
[0018]本發(fā)明還提出了轉(zhuǎn)錄因子dst在提高植物抗高溫能力中的應(yīng)用。所述植物為水稻。
[0019]本發(fā)明還提出了一種調(diào)控提高植物抗高溫能力的方法，分別選取突變體和野生型各300顆飽滿的種子，破休眠誘導生芽生根后，在營養(yǎng)液中培養(yǎng)到18天，高溫(day/night:42/37°C,13h/llh ；Rh30% )處理幼苗3天，然后移至正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)15天，統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體存活率明顯高于野生型。
·[0020]本發(fā)明還提出一種所述轉(zhuǎn)錄因子dst的回復(fù)表達載體，該載體為pCAMBIA1300-dst。
[0021]本發(fā)明還提出了一種遺傳工程化的宿主細胞，其含有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列或所述的載體。
[0022]本發(fā)明有益效果包括:可以提高作物在高溫脅迫條件下的結(jié)實率，并且可以提高植物對高溫的耐受能力。本發(fā)明可應(yīng)用于植物培育中，選育出具有特定品質(zhì)性狀的優(yōu)良品種。本發(fā)明克隆得到調(diào)控水稻高溫脅迫下結(jié)實率和提高植物耐高溫能力的主效基因。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域特別是提高作物對高溫的耐受性和提高作物結(jié)實率方面具有重要的應(yīng)用前
旦
-5^ O
[0023]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1表示3d高溫處理，15d回復(fù)培養(yǎng)后野生型和突變體的生長情況。
[0025]圖2表示ZHll和hst在40°C 15d和正常條件下的結(jié)實率。
[0026]圖3表示ZHll和hst在40°C 15d和正常條件下的結(jié)實情況。
[0027]圖4表示F2代處理和未處理后的結(jié)實情況。[0028]圖5表示部分分子標記聚丙烯酰胺凝膠電泳情況和分子標記發(fā)生交換的比率?！揪唧w實施方式】
[0029]結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以下實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人,分子克隆:實驗室指南(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。實施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。
[0030]本發(fā)明經(jīng)過深入研究，首次提出轉(zhuǎn)錄因子dst可作為在花期高溫情況下的負調(diào)控因子，對高溫脅迫起到負調(diào)控作用，其突變體在40°C 15d的花期處理條件下結(jié)實率明顯優(yōu)于野生型，證明該基因在花期高溫情況下可作為負調(diào)控因子，對高溫脅迫起到負調(diào)控作用。例如，本發(fā)明中，在高溫(day/night:42/37°C, 13h/llh ；Rh30% )條件下處理第18天的突變體幼苗3天，然后移至正常培養(yǎng)條件下生長15天，統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體存活率明顯高于野生型。本發(fā)明中，對該突變體植株在花期進行高溫(40°C，15d，每天6小時)處理，結(jié)果顯示突變體結(jié)實率達30%，而野生型結(jié)實率為O。
[0031]本發(fā)明中，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
[0032]本發(fā)明中，宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有:大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞等。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體和宿主細胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。
[0033]本發(fā)明中，轉(zhuǎn)化植物可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如噴灑法、葉盤法、水稻幼胚轉(zhuǎn)化法等。對于轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得高溫下結(jié)實率或抗高溫能力發(fā)生改變的植物。制備轉(zhuǎn)基因植物的方法可以是:將攜帶啟動子序列和目的基因(可操作地連接)的表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌再將含啟動子和目的基因的載體片段整合到植物的染色體上。涉及的轉(zhuǎn)基因受體植物例如是水稻、小麥、大麥和玉米。
[0034]本發(fā)明中，轉(zhuǎn)錄因子dst多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。重組表達載體指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
[0035]本發(fā)明還涉及一種 改良植物的方法，該方法包括調(diào)節(jié)所述植物中轉(zhuǎn)錄因子dst的表達。
[0036]本發(fā)明還包括利用前述任一種方法獲得的植物，所述的植物包括:轉(zhuǎn)入了轉(zhuǎn)錄因子dst或其同源基因的轉(zhuǎn)基因植物等。[0037]本發(fā)明還涉及利用轉(zhuǎn)錄因子dst及其表達蛋白作為一種基因轉(zhuǎn)化植株后代的追蹤標記?；?qū)⑵渥鳛榉肿訕擞?，通過檢測植物中轉(zhuǎn)錄因子dst及其表達蛋白的表達情況，鑒定禾本科植物在高溫下的結(jié)實率或抗高溫能力的提高。還可利用將其作為雜交制種過程中真雜種的指示標記。
[0038]本發(fā)明還提供篩選可提高在高溫下的植物結(jié)實率或提高植物抗高溫能力的物質(zhì)的方法，可以采用本領(lǐng)域熟知的多種方法來篩選調(diào)節(jié)高溫下的植物結(jié)實率及抗高溫能力的潛在物質(zhì)。所述的方法包括:將候選物質(zhì)與表達轉(zhuǎn)錄因子dst的體系接觸，檢測候選物質(zhì)對轉(zhuǎn)錄因子dst的表達的影響；若所述候選物質(zhì)可提高或降低轉(zhuǎn)錄因子dst的表達，或促進或抑制轉(zhuǎn)錄因子dst的活性，則表明其是可用于調(diào)節(jié)植物在高溫下的植物結(jié)實率及抗高溫能力。這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個篩選庫，以便于人們最終可以從中篩選出能夠?qū)τ谡{(diào)節(jié)植物高溫下的結(jié)實率及抗高溫能力有用的物質(zhì)。本發(fā)明還提供依所述篩選方法獲得的物質(zhì)。
[0039]實施例1轉(zhuǎn)錄因子dst的重組表達載體的構(gòu)建
[0040]通過數(shù)據(jù)庫中已報道的DST基因的序列設(shè)計引物，通過使用KOD高保真PCR酶克隆得到該基因全長(包括啟動子區(qū)域)為3966bp，利用pCAMBIA1300構(gòu)建該基因的回復(fù)表達載體，測序正確后將載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)中，通過農(nóng)桿菌介導法將基因?qū)氲酵蛔凅w愈傷組織中，再通過抗生素的篩選、分化和鑒定獲得轉(zhuǎn)基因植株。觀察花期高溫處理下回復(fù)材料的結(jié)實率及發(fā)育狀況，明確目的基因與耐高溫表型的相關(guān)性。
[0041]回復(fù)引物:
[0042]ACGCGTCGACtcgttttatccccttgcact(SEQ ID N0.2) [0043]ACGCGTCGACctagaggctcaagttgaggtcgag(SEQ ID N0.3)
[0044]克隆序列(包括啟動子區(qū)域)，如SEQ ID N0.4所示。
[0045]實施例2
[0046]分別選取突變體和野生型各300顆飽滿的種子，破休眠誘導生芽生根后，在營養(yǎng)液中培養(yǎng)到18天，高溫(day/night:42/37°C，13h/lIh ；Rh30% )處理幼苗3天，然后移至正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)15天，統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體存活率明顯高于野生型。如圖1所以，表明DST基因失活可提高水稻苗期對高溫的抵抗能力，提高存活率。
[0047]本實施例中，突變體為本實驗室篩選得到，遺傳背景為常規(guī)粳稻品種中花11，在DST基因編碼區(qū)第194個堿基處有四個堿基的插入造成移碼突變。
[0048]本實施例中，野生型為本實驗保留水稻品種，常規(guī)粳稻品種中花11。
[0049]實施例3
[0050]從常規(guī)粳稻ZHll的無性系突變體庫中篩選出一份突變體材料，將其與野生型ZHll同時進行38°C，7d，40°C，7d和40°C，15d的高溫處理，其結(jié)實率比野生型分別高將近10%、20%和30%。而在40°C 15d的高溫處理條件下ZHll幾乎不結(jié)實。因此將該突變體命名為hst。并且處理條件采用40°C 15d的高溫處理條件。實驗結(jié)果如圖2所示，表明在40°C，15d的處理條件下，突變體在結(jié)實率方面比野生型有明顯優(yōu)勢，而在正常生長條件下兩個品種的結(jié)實率差距不大，也表明DST基因失活條件下可提高水稻花期對高溫的抵抗能力，并提高結(jié)實率。如圖3的結(jié)實情況照片也可表明DST作為一種負調(diào)控因子，在失活情況下可提高水稻的結(jié)實率。[0051]本實施例中，正常溫室的條件為:白天:28°C 13h ;夜晚:23°C Ilh0高溫處理條件為(模擬自然條件下的高溫情況):白天:30°C 3h ；40°C 6h ；30°C 4h。夜晚:23°C Ilh0
[0052]本實施例中，突變體為本實驗室篩選得到，遺傳背景為常規(guī)粳稻品種中花11，在DST基因編碼區(qū)第194個堿基處有四個堿基的插入造成移碼突變。
[0053]本實施例中，野生型為本實驗保留水稻品種，常規(guī)粳稻品種中花11。
[0054]實施例4
[0055]將突變體作為母本，常規(guī)秈稻IR29作為父本，雜交獲得Fl代，進行自交獲得F2代。選取260顆F2代飽滿的種子進行催根催芽，在溫室條件下進行營養(yǎng)液培養(yǎng)直至開花前l(fā)d，將F2代中130株移入40°C的高溫處理15d，然后將處理后的材料移入正常溫室下進行繼續(xù)生長，待灌漿結(jié)束統(tǒng)計結(jié)實率。實驗結(jié)果如圖4所示，表明有40株經(jīng)過處理的F2代植株有不同程度的結(jié)實，部分結(jié)實率達到40%。而在正常條件下培育的F2代植株結(jié)實正常。
[0056]本實施例中，突變體為本實驗室篩選得到，遺傳背景為常規(guī)粳稻品種中花11，在DST基因編碼區(qū)第194個堿基處有四個堿基的插入造成移碼突變。
[0057]本實施例中，IR29從中國農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所獲得，為常規(guī)秈稻品種。
[0058]實施例5基因的定位
[0059]提取40°C 15d處理后有結(jié)實的F2代40個單株的DNA。從數(shù)據(jù)庫和已報道的材料中在不同染色體上挑選了大量的分子標記，使用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳在親本IR29和hst中進行分子標記多態(tài)性的篩選。用具有多態(tài)性的分子標記對從F2代中篩選出的植株進行定位，最終將目的基因定位在RM6970這個分子標記附近(圖5為部分分子標記聚丙烯酰胺凝膠電泳情況和分子標記發(fā)·生交換的比率)。通過數(shù)據(jù)庫篩選，發(fā)現(xiàn)在該區(qū)域存在一個已報道的轉(zhuǎn)錄因子dst基因。該基因?qū)}脅迫和干旱脅迫起到一定的調(diào)控作用，可能與熱脅迫具有一定的相關(guān)性。因此，對突變體中的該基因進行了測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體中該基因在編碼區(qū)第194個堿基處有四個堿基的出入造成了移碼突變，并且該突變位點位于dst的鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域，該區(qū)域是dst正常功能所必需，造成了 dst基因功能的缺失。
[0060]分子標記
[0061]RM6970Type Forward primer(5; -3/ ):TCGCTTGTGTTTTCTGGGTC(SEQ ID N0.5)
[0062]Reverse primer(5; -3/ ):TGGAGAATTTGGAGGCTGC(SEQ ID N0.6)
[0063]實施例6 hst突變體的回復(fù)
[0064]提取水稻基因組DNA，設(shè)計引物克隆得到包括上游啟動子區(qū)域和完整的DST基因序列共3966bp，連接到表達載體pCAMBIA1300上，通過農(nóng)桿菌介導法將構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)到突變體hst的愈傷組織中，獲得轉(zhuǎn)基因株系TO代。將TO代的種子選取三個株系在溫室條件下培養(yǎng)得到Fl代植株，到開花前一天一半進行高溫處理15d，另一半繼續(xù)進行正常培養(yǎng)。15d后將處理的材料然后移到正常生長條件下培養(yǎng)，直至灌漿結(jié)束。統(tǒng)計結(jié)實率。
[0065]實驗結(jié)果:高溫處理后，回復(fù)材料結(jié)實率為0%，與野生型中花11的結(jié)實率相近。而正常生長條件下結(jié)實率為60% -80%。
[0066]結(jié)果表明:將高溫處理條件下具有30%結(jié)實率的突變體經(jīng)過回復(fù)后，回復(fù)材料的處理后的結(jié)實率為0%，而正常生長條件下的突變體的回復(fù)材料的結(jié)實率正常。高溫情況下，突變體中該基因失活，結(jié)實率達到30%，突變體的回復(fù)材料結(jié)實率為0%。但在正常條件下，突變體和突變體回復(fù)材料的結(jié)實率均為60% -80%之間。表明hst突變體為單基因隱性突變體，并且該基因為熱脅迫條件下結(jié)實性狀的重要的負調(diào)控因子。
[0067]回復(fù)到耐熱突變體內(nèi)的基因序列，如SEQ ID N0.7所示。
[0068]實施例7野生型中花11中DST基因的干涉材料的獲得
[0069]使用Gateway的方法構(gòu)建干涉載體:在DST基因的⑶S區(qū)域選取一段205bp大小的基因片段，從兩端設(shè)計引物，在正向引物的5'端加入CACC四個堿基序列，作為與入門載體配對連接的位點。進行PCR擴展，瓊脂糖凝膠電泳和割膠回收純化目的片段。通過TOPO反應(yīng)將205bp大小的片段連接到Invitrogen公司的pET Directional TOPO入門載體上，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)到E.coli感受態(tài)中。采用菌落PCR的方法來鑒定陽性菌。把鑒定得到的陽性菌提取質(zhì)粒，與終載體PH7GWIWIG2 (實驗室內(nèi)部構(gòu)建)進行LR融合反應(yīng)，將目的片段以一段正向序列和一段反向序列的形式連接到終載體上。通過農(nóng)桿菌介導法將終載體轉(zhuǎn)到野生型中花11的愈傷組織中，獲得中花11的干涉株系TO代。將獲得的TO代的種子水培獲得Fl代的植株，在培養(yǎng)到開花前一天一部分正常培養(yǎng)，一部分進行40°C，15d的處理，處理結(jié)束恢復(fù)正常培養(yǎng)直至灌漿結(jié)束，統(tǒng)計結(jié)實率。
[0070]實驗結(jié)果:中花11干涉材料正常培養(yǎng)的結(jié)實正常，經(jīng)過熱脅迫后結(jié)實率在中花11和突變體結(jié)實率之間。
[0071]分析:突變體中由于四個堿基的插入導致移碼突變，造成DST基因功能的完全喪失。通過Gateway方法獲得的中花11干涉材料只能達到DST基因功能的部分喪失，所以表型介于中花11和突變 體之間。但也能夠充分說明，DST基因為熱脅迫條件下結(jié)實性狀的重要的負調(diào)控因子。
[0072]干涉序列如SEQ ID N0.8所示
[0073]gactccccgtcgcctatggcggcgcaggcggccgacctgtcgctgacgctggcgccgtcgggagggggtggtgggggaggaggaggcggcggcggtggtgggtcgtcgtcggcgtgcatcgacggcaaggacgtgcggctgttcccgtgcttgttctgcaacaagaagttcttgaagtcgcaggcgctgggcgggcaccagaacg
[0074]正向引物:CACCgactccccgtcgcctatggc (SEQ ID N0.9)
[0075]反向引物:cgttctggtgcccgcccagcgcct(SEQ ID N0.10) 0
【權(quán)利要求】
1.轉(zhuǎn)錄因子dst在調(diào)控高溫下植物結(jié)實率中的應(yīng)用，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄因子dst包括含有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.轉(zhuǎn)錄因子dst在調(diào)控提高植物抗高溫能力的應(yīng)用，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄因子dst包括含有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為水稻。
4.一種調(diào)控提高植物抗高溫能力的方法，其特征在于，所述方法包括:使所述轉(zhuǎn)錄因子dst失活來提高植物抗高溫能力。
5.一種調(diào)控高溫下植物結(jié)實率中的方法，其特征在于，所述方法包括:使所述轉(zhuǎn)錄因子dst失活來提高在高溫下的植物結(jié)實率。
6.一種含有如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄因子dst的重組載體。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，其含有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列或如權(quán)利要求6 所述的載體。
【文檔編號】C12N1/21GK103789322SQ201310597833
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】朱誠, 曲愛麗, 丁艷菲, 江瓊, 王飛娟, 易可可 申請人:中國計量學院