檢測沉默gpc-3基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法。通過1）針對靶基因共有序列設計并合成4對miRNA寡聚單鏈DNA,再合成相應dsDNA，將dsDNA插入載體構(gòu)建4種重組質(zhì)粒，并通過熒光定量PCR挑選出干擾效率最高的一種重組質(zhì)粒；2）將上述干擾效率最高的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HepG2細胞中構(gòu)建轉(zhuǎn)染HepG2細胞，并對其進行篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細胞;3）將上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細胞接種裸鼠皮下構(gòu)建人肝癌細胞荷瘤裸鼠模型；4）而后測定上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細胞在人肝癌細胞荷瘤裸鼠模型中生長情況。通過以上方法來檢測沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力，可以用于GPC-3對移植瘤的研究。
【專利說明】檢測沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及GPC-3相關基因技術，特別涉及一種檢測沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法。
【背景技術】
[0002]磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3，GPC-3)作為一種細胞表面蛋白，在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中特異性高表達,被認為是肝癌早期診斷及特異性治療的潛在靶點。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (GPC-3)屬于糖基磷脂酰肌醇錨定的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族。GPC-3基因定位于人染色體X26.10，因為該分子的突變或者異常表達常與疾病相關，所以受到廣泛關注。現(xiàn)有技術當中，基于沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌裸鼠移植瘤研究沒有簡單高效的手段，沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄對肝癌裸鼠移植瘤的能力的驗證不夠簡便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于，提供一種檢測沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，方法包括如下步驟:
[0004]I)針對靶基因human GPC3, Gene ID:2719的4個轉(zhuǎn)錄本的共有序列設計并合成4對miRNA寡聚單鏈DNA，再合成相應dsDNA，將dsDNA插入載體構(gòu)建4種GPC-3-miRNA重組質(zhì)粒，并通過熒光定量PCR挑選出干擾效率最高的一種GPC-3-miRNA重組質(zhì)粒；
[0005]2)將上述干擾效率最高的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至IfepG2細胞中構(gòu)建轉(zhuǎn)染IfepG2細胞，并對其進行篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染H印G2細胞；
[0006]3)將上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細胞接種裸鼠皮下構(gòu)建人肝癌細胞荷瘤裸鼠模型；
[0007]4)而后測定上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細胞在人肝癌細胞荷瘤裸鼠模型中生長情況。
[0008]在一些實施方式中，4種的GPC-3-miRNA重組質(zhì)粒分別為:
[0009]p-CMV-GPC-3-miRNA-l ；
[0010]p-CMV-GPC-3-miRNA-2 ；
[0011 ] p-CMV-GPC-3-miRNA-3 ；
[0012]p-CMV-GPC-3-miRNA-4;
[0013]p-CMV-GPC-3-miRNA-l插入序列正、反義鏈(5’ -3’ )分別為
[0014]F: 5-TGCTGTGMTTAGTTCCCTTCTTCGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCGMGMGMCTMTTCA-3
[0015]R: 5-CCTGTGMTTAGTTCTTCTTCGGGTCAGTCAGTGGCCAAMCCCGMGMGGGMCTMTTCAC-3
[0016]p-CMV-GPC-3-miRNA-2插入序列正、反義鏈(5’ -3’ )分別為
[0017]F: 5-TGCTGTMTTTGACTGACCACTGGCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGCCAGTGCAGTCAMTTA-3
[0018]R: 5-CCTGTMTTTGACTGCACTGGCTGTCAGTCAGTGGCCAAMCAGCCAGTGGTCAGTCAMTTAC-3
[0019]p-CMV-GPC-3-miRNA-3插入序列正、反義鏈(5’ -3’ )分別為
[0020]F: 5-TGCTGTTCATTAGCTGGGTATAGATGGTTTTGGCCACTGACTGACCATCTATACAGCTMTGM-3[0021 ] R: 5-CCTGTTCATTAGCTGTATAGATGGTCAGTCAGTGGCCAAMCCATCTATACCCAGCTMTGMC-3
[0022]p-CMV-GPC-3-miRNA-4插入序列正、反義鏈(5’ -3’ )分別為
[0023]F: 5-TGCTGMTACTTTCAGGTCACGTCTTGTTTTGGCCACTGACTGACMGACGTGCTGAMGTATT-3
[0024]R: 5-CCTGMTACTTTCAGCACGTCTTGTCAGTCAGTGGCCAAMCMGACGTGACCTGAMGTATTC-3
[0025]在一些實施方式中，干擾效率最高的重組質(zhì)粒為:
[0026]p-CMV-GPC-3-miRNA-l。
[0027]在一些實施方式中，載體為pcDNA?6.2-GW/EmGFP-miR。
[0028]在一些實施方式中，干擾效率最高的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至!fepG2細胞中構(gòu)建轉(zhuǎn)染HepG2細胞中使用GenjetTM轉(zhuǎn)染試劑，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細胞使用的篩選用試劑為殺稻
瘟菌素。
[0029]在一些實施方式中，步驟(3)中轉(zhuǎn)染H印G2細胞接種裸鼠皮下構(gòu)建人肝癌細胞荷瘤裸鼠模型的方法為:收集對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染HepG2細胞，以2X 107 / (0.2ml.只)接種于裸鼠右肩胛部皮下，形成直徑4mm左右的皮下隆起。
[0030]在一些實施方式中，測定轉(zhuǎn)染HepG2細胞生長情況的方法為為測腫瘤生長曲線和免疫組織化學分析。
[0031]在一些實施方 式中，測腫瘤生長曲線方法為:
[0032]接種后，每天觀察裸鼠的生存狀況、注射部位有無感染和破潰、腫瘤生長后有無自然消退并記錄每組腫瘤長出時間；待腫瘤出現(xiàn)后，每周用游標卡尺測量腫瘤長、短徑，根據(jù)公式:腫瘤體積V(mm3) =0.5XaXb2 (a=長徑，b=短徑)，計算腫瘤體積，并根據(jù)體積的均數(shù)值繪制腫瘤生長曲線。于接種后35天用頸椎脫白法處死裸鼠，大體觀察移植瘤的生長狀況及周圍臟器受累情況；剝離腫瘤用生理鹽水沖洗、擦干，拍照；將標本浸入4%多聚甲醛內(nèi)固定24h，備用；
[0033]免疫組織化學分析方法為:
[0034]將上述測腫瘤生長曲線方法中備用的標本脫蠟，水化，雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，高壓加熱法修復抗原，正常動物血清封閉非特異性結(jié)合；分別滴加GPC-3、β -catenin、p-GSK3 β及cyclinDl抗體，4°C過夜,PBS漂洗；滴加生物素標記的第二抗體，室溫孵育lOmin，PBS漂洗；滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶，室溫孵育lOmin，PBS沖洗；滴加新鮮配制的四鹽酸二氨基聯(lián)苯胺溶液，室溫顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素復染，無水乙醇脫水透明、封片；光學顯微鏡觀察、攝像；以0.01 mol/L PBS(pH=7.5)替代第一抗體、第二抗體作陰性對照。
[0035]在一些實施方式中，針對4種GPC-3-miRNA重組質(zhì)粒設計p-CMV-NegniRNA質(zhì)粒作為對照；
[0036]p-CMV-Neg-miRNA插入序列正、反義鏈(5，_3’)分別為:
[0037]F;5-tgctgAMTGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3
[0038]R: 5-cctgAMTGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAMCGTCTCCACGCGCAGTACATTTc-3
[0039]本發(fā)明專利申請的方法可以用于沉默GPC-3對移植瘤的研究。
[0040]本發(fā)明專利申請的方法能夠檢測沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力。
[0041]可以得出如下結(jié)果:
[0042]沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄延長人肝癌細胞荷瘤裸鼠模型潛伏期。[0043]沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄延緩肝癌裸鼠移植瘤生長速度。
[0044]沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄明顯肝癌裸鼠移植瘤。
[0045]沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄使肝癌裸鼠移植瘤中GPC-3、β -catenin、p_GSK3 β、cyclinDl表達水平低于空白對照組。
[0046]并且本發(fā)明專利申請的方法簡單高效，明確的表明了沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄對抑制肝癌裸鼠移植瘤有著明顯能力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0047]圖1為本發(fā)明一實施方式的測定人肝癌細胞荷瘤裸鼠模型潛伏期的比較圖；
[0048]圖2為本發(fā)明一實施方式的測定皮下移植瘤生長曲線；
[0049]圖3為本發(fā)明一實施方式的檢測肝癌察移植瘤抑制效果比較圖；
[0050]圖4為本發(fā)明一實施方式的免疫組化檢測瘤組織Wnt信號通路相關蛋白表達圖。
【具體實施方式】
[0051]實施例
[0052]1.1材料的準備:
[0053]人H印G2細胞株購自中科院上海細胞所；胎牛血清、胰蛋白酶溶液及磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Invitrogen公司；二甲基亞砜及殺稻痕菌素購自美國Sigma公司；GenJetTM DNA In Vitro Transfection Reagent購自美國 SignaGen公司；鼠抗人GPC-3抗體購自美國Abcam公司；β-catenin、p_GSK3 β、cyclinDl及β-actin兔抗人抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔及羊抗鼠IgG抗體購自英國Everest Biotech公司。
[0054]1.2實驗動物的準備:
[0055]18只BALB/c裸鼠由(南通大學實驗動物中心提供)，鼠齡4?6周，體重18?20g,雌雄各半，隨機分對照組(untreated組)、miRNA陰性組(miRNA-neg組)和miRNA干擾組(GPC-3-miRNA組)，每組6只，于SPF條件下飼養(yǎng)。
[0056]1.3HepG2細胞的培養(yǎng)
[0057]人肝癌細胞株H印G2用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37°C、5% C02孵箱中貼壁培養(yǎng)，待細胞融合度> 80%時傳代。
[0058]在前期準備完成的條件下，具體采用以下步驟檢測沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力:
[0059]2.1四種GPC-3-miRNA重組質(zhì)粒設計與合成
[0060]針對靶基因human GPC3, Gene ID: 2719的4個轉(zhuǎn)錄本的共有序列，利用Invitrogen miRNA設計系統(tǒng)軟件設計4對miRNA寡聚單鏈DNA及陰性對照序列寡聚單鏈DNA，序列見表I。
[0061]將4對miRNA寡聚單鏈DNA及陰性對照序列寡聚單鏈DNA分別用雙蒸水溶解成100 μ Μ，互補單鏈各取5 μ L混合，10X退火緩沖液2 μ L，雙蒸水補齊至20 μ L，95 V加熱5min,室溫冷卻20min,形成相應dsDNA。
[0062]將相應退火的dsDNA繼續(xù)稀釋成ΙΟηΜ，取4 μ L，載體pcDNA?6.2-GW/EmGFP-miR2 μ L，5 X連接緩沖液4 μ L，T4DNA連接酶I μ L，雙蒸水補齊至20 μ L，室溫連接30min，獲得5種連接產(chǎn)物。
[0063]分別取10 μ I連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100 μ I感受態(tài)細胞DH5 α，后接種到LB/壯觀霉素平板培養(yǎng)基上，37°C孵箱中培養(yǎng)過夜，長出的菌落即為陽性菌落，挑出菌落擴增，提取重組質(zhì)粒，測序鑒定。四種GPC-3-miRNA重組質(zhì)粒分別為:p-CMV-GPC-3-miRNA-l、p-CMV-GPC-3-miRNA-2、p-CMV-GPC-3-miRNA-3 和 p-CMV-GPC-3-miRNA_4，GPC-3-miRNA 重組質(zhì)粒的陰性對照為p-CMV-Neg-miRNA，序列見表1。
[0064]將構(gòu)建的4種重組質(zhì)粒，通過熒光定量PCR篩選干擾效率最好的一對，即p-CMV-GPC-3-miRNA-lo
[0065]表lGPC-3-miRNA載體質(zhì)粒名稱及序列
【權利要求】
1.檢測沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，該方法包括如下步驟: 1)針對靶基因humanGPC3, Gene ID:2719的4個轉(zhuǎn)錄本的共有序列設計并合成4對miRNA寡聚單鏈 DNA，再合成相應dsDNA，將dsDNA插入載體構(gòu)建4種GPC-3-miRNA重組質(zhì)粒，并通過熒光定量PCR挑選出干擾效率最高的一種GPC-3-miRNA重組質(zhì)粒； 2)將上述干擾效率最高的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至IfepG2細胞中構(gòu)建轉(zhuǎn)染IfepG2細胞，并對其進行篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染H印G2細胞； 3)將上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細胞接種裸鼠皮下構(gòu)建人肝癌細胞荷瘤裸鼠模型； 4)而后測定上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細胞在人肝癌細胞荷瘤裸鼠模型中生長情況。
2.根據(jù)權利要求1所述一種檢測沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，4種所述GPC-3-miRNA重組質(zhì)粒分別為: p-CMV-GPC-3-miRNA-l、 p-CMV-GPC-3-miRNA_2、 p-CMV-GPC-3-miRNA-3 和p-CMV-GPC-3-miRNA-4; p-CMV-GPC-3-miRNA-l插入序列正、反義鏈(5’ _3’)分別為 F:5-TGCTGTGAATTAGTTCCCTTCTTCGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCGAAGAAGAACTAATTCA-3 R:5-CCTGTGAATTAGTTCTTCTTCGGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCCGAAGAAGGGAACTAATTCAC-3 p-CMV-GPC-3-miRNA-2插入序列正、反義鏈(5’ -3’ )分別為 F:5-TGCTGTAATTTGACTGACCACTGGCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGCCAGTGCAGTCAAATTA-3 R:5-CCTGTAATTTGACTGCACTGGCTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGCCAGTGGTCAGTCAAATTAC-3 p-CMV-GPC-3-miRNA-3插入序列正、反義鏈(5’ -3’ )分別為 F:5-TGCTGTTCATTAGCTGGGTATAGATGGTTTTGGCCACTGACTGACCATCTATACAGCTAATGAA-3 R:5-CCTGTTCATTAGCTGTATAGATGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCATCTATACCCAGCTAATGAAC-3 p-CMV-GPC-3-miRNA-4插入序列正、反義鏈(5’ -3’ )分別為 F:5-TGCTGAATACTTTCAGGTCACGTCTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAGACGTGCTGAAAGTATT-3 R:5-CCTGAATACTTTCAGCACGTCTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAAGACGTGACCTGAAAGTATTC-3 。
3.根據(jù)權利要求2所述一種檢測沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，所述干擾效率最高的GPC-3-miRNA重組質(zhì)粒為p-CMV-GPC-3-miRNA-l。
4.根據(jù)權利要求1所述一種檢測沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，所述載體為 pcDNA?6.2-GW/EmGFP-miR。
5.根據(jù)權利要求1所述一種檢測沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法， 所述干擾效率最高的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H印G2細胞中構(gòu)建轉(zhuǎn)染H印G2細胞中使用Gen jet?轉(zhuǎn)染試劑，所述得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染H印G2細胞使用的篩選用試劑為殺稻瘟菌素。
6.根據(jù)權利要求1所述一種檢測沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，所述步驟(3)中轉(zhuǎn)染H印G2細胞接種裸鼠皮下構(gòu)建人肝癌細胞荷瘤裸鼠模型的方法為:收集對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染IfepG2細胞，以2X 14O7 / (0.2ml.只)接種于裸鼠右肩胛部皮下，形成直徑4_左右的皮下隆起。
7.根據(jù)權利要求2所述一種基于沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌裸鼠移植瘤的方法，所述測定轉(zhuǎn)染HepG2細胞生長情況的方法為測腫瘤生長曲線和免疫組織化學分析。
8.根據(jù)權利要求7所述一種檢測沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法， 所述測腫瘤生長曲線方法為: 接種后，每天觀察裸鼠的生存狀況、注射部位有無感染和破潰、腫瘤生長后有無自然消退并記錄每組腫瘤長出時間；待腫瘤出現(xiàn)后，每周用游標卡尺測量腫瘤長、短徑，根據(jù)公式:腫瘤體積V(mm3)=0.5XaXb2(a=長徑，b=短徑)，計算腫瘤體積，并根據(jù)體積的均數(shù)值繪制腫瘤生長曲線；于接種后35天用頸椎脫白法處死裸鼠，大體觀察移植瘤的生長狀況及周圍臟器受累情況；剝離腫瘤用生理鹽水沖洗、擦干，拍照；將標本浸入4%多聚甲醛內(nèi)固定24h，備用； 所述免疫組織化學分析方法為: 將上述固定過的標本脫蠟，水化，雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，高壓加熱法修復抗原，正常動物血清封閉非特異性結(jié)合；分別滴加GPC-3、β -catenin、p_GSK3 β及cyclinDl抗體，4°C過夜，PBS漂洗；滴加生物素標記的第二抗體，室溫孵育10min，PBS漂洗；滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶，室溫孵育lOmin，PBS沖洗；滴加新鮮配制的四鹽酸二氨基聯(lián)苯胺溶液，室溫顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素復染，無水乙醇脫水透明、封片；光學顯微鏡觀察、攝像；以0.01 mo I/L PBS(pH=7.5)替代第一抗體、第二抗體作陰性對照。
9.根據(jù)權利要求1所述一種檢測沉默GPC-3基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，針對4種所述的GPC-3-miRNA重組質(zhì)粒設計p-CMV-Neg_miRNA質(zhì)粒作為對照； p-CMV-Neg-miRNA插入序列正、反義鏈(5’ -3’)分別為:
F;5-tgctgAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3
R:5-cctgAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTc-3 。
【文檔編號】C12N15/85GK103743902SQ201310601573
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月25日 優(yōu)先權日:2013年11月25日
【發(fā)明者】姚登福, 陳潔, 姚敏, 王理 申請人:南通大學附屬醫(yī)院