一種膨潤(rùn)土單層剝離納米片組裝酶及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，公開(kāi)了一種膨潤(rùn)土單層剝離納米片組裝酶及其制備方法，利用超聲和攪拌將層狀膨潤(rùn)土剝離成單片的納米膠體溶液，通過(guò)調(diào)節(jié)酶和膨潤(rùn)土薄片端面的表面電荷，使酶分子吸附在帶負(fù)電的膨潤(rùn)土納米片層表面，同時(shí)利用膨潤(rùn)土帶負(fù)電的片層表面和帶正電的端面之間的靜電吸引，組裝成“卡片屋”型的固定化酶。本發(fā)明利用酶分子與膨潤(rùn)土納米片層表面的陽(yáng)離子之間的離子交換，使酶分子分散的固定在原有的陽(yáng)離子點(diǎn)位上，有效避免了酶固定化過(guò)程中的聚集問(wèn)題，大大提高了酶分子的負(fù)載量，本方法得到的固定化酶的催化活性得到顯著提高，克服了一般固定化酶在水相中的催化活性要低于游離酶的缺點(diǎn)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了生物酶的多批次穩(wěn)定化操作。
【專利說(shuō)明】一種膨潤(rùn)土單層剝離納米片組裝酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及了一種膨潤(rùn)土單層剝離納米片組裝酶及其制備方法。
【背景技術(shù)】 [0002]生物酶是一種高效專一的催化劑，具有反應(yīng)條件溫和、能耗低、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于化學(xué)產(chǎn)品(中間體)的制備、紡織印染、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域。但是由于酶容易失活、穩(wěn)定性差、難以回收利用等致命弱點(diǎn)，再加上酶制劑高昂的價(jià)格，極大的限制了其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。酶的固定化是一種提高催化穩(wěn)定性、實(shí)現(xiàn)酶循環(huán)利用行之有效的方法。但生物酶在固定化過(guò)程中，由于載體對(duì)酶空間構(gòu)象產(chǎn)生影響，以及包括空間位阻和傳質(zhì)阻力等影響，其催化活性往往會(huì)有所下降。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在合適的條件下，以水滑石、磷酸鋯等層狀無(wú)機(jī)材料為載體負(fù)載生物酶蛋白分子可以制備得到高效穩(wěn)定、具有層狀結(jié)構(gòu)的固定化酶。如An等先將層間插入乳酸分子的水滑石剝離，然后將脂肪酶結(jié)合到剝離的水滑石片層上，利用水滑石的“記憶功能”，組裝成具有層狀結(jié)構(gòu)的固定化脂肪酶(AICHE J.2010，56:2677-2686)。中國(guó)專利CN1884515A公開(kāi)了一種納米片狀氧化鈦組裝酶的方法，該方法利用有機(jī)胺剝離層狀鈦酸鹽，得到的納米片吸附血紅蛋白，然后自組裝成具有層狀結(jié)構(gòu)的固定化酶。另外，氧化還原酶、肌紅蛋白等也能通過(guò)類似的方法插入到磷酸鋯等層狀結(jié)構(gòu)中，制備得到催化活性較高、具有層狀結(jié)構(gòu)的固定化酶(J.Am.Chem.Soc.2000，122:830-837;J.Am.Chem.Soc.2004，126:14346-14347;Langmuir, 2004，20:10231-10237; J.Mater.Chem.2005，15:3838-3843)。但是上述制備過(guò)程中，都加入了諸如有機(jī)胺、乳酸、氨丙基三乙氧基硅烷等有機(jī)化合物，有些還加入強(qiáng)酸強(qiáng)堿，這些對(duì)酶蛋白和環(huán)境都會(huì)產(chǎn)生不利影響。
[0003]膨潤(rùn)土作為一種無(wú)機(jī)層狀礦物材料，具有儲(chǔ)量豐富、價(jià)格低廉、機(jī)械強(qiáng)度高、比表面積大、生物相容性好、結(jié)構(gòu)和功能可調(diào)等特點(diǎn)，其層狀結(jié)構(gòu)由長(zhǎng)、寬和高分別約為lOOnm、IOOnm和Inm的納米薄片堆積排列而成，片層之間的層間距約為1.2nm左右。中國(guó)專利CN1286719C、CN101823722A和CN101049941A等公開(kāi)了幾種將膨潤(rùn)土層狀結(jié)構(gòu)剝離制備無(wú)機(jī)凝膠的方法，這些方法大都分為離心分離、制漿、改性和膠化等步驟，制備工藝相對(duì)比較復(fù)雜，主要用于制備應(yīng)用在石油化工、涂料、造紙和紡織等行業(yè)，具有高純度、高粘度的膨潤(rùn)土無(wú)機(jī)凝膠。迄今為止，將膨潤(rùn)土剝離用于負(fù)載生物酶大分子還未有報(bào)道。
[0004]目前，膨潤(rùn)土負(fù)載生物酶的方法主要有層間插入和外表面吸附兩種。Lin等利用聚氧丙烯二胺(POP)等高分子化合物插入到鈉基膨潤(rùn)土將其層間距撐開(kāi)，然后將牛血清白蛋白、a -糜蛋白酶等生物大分子插入層間制備固定化酶(Langmuir，2007, 23:1995-1999; J.Phys.Chem.B, 2007, 111:10275-10280;Bioconjugate Chem.2008，19:138-144)。由于該方法加入了大量的聚合物，對(duì)酶蛋白在負(fù)載過(guò)程中容易產(chǎn)生擠壓、干擾以及空間位阻，從而導(dǎo)致酶催化活性的下降。而且，該方法由于無(wú)法實(shí)現(xiàn)酶分子在載體層間和外表面的可控結(jié)合，部分結(jié)合在膨潤(rùn)土外表面的酶蛋白很容易脫落，影響酶的催化穩(wěn)定性。其他已報(bào)道的以膨潤(rùn)土為載體制備固定化酶的方法主要是將酶分子直接吸附在膨潤(rùn)土外表面(如圖1所不)(Process Biochem.2005，40:2155_2159;Appl.Clay Sc1.2008, 43:289-295;Appl.Clay Sc1.2008,43:308-316;Mater.Sc1.Eng.B-Adv.2009, 165:173-177;Bioresour.Technol.2010, 101:1587-1594)。在此過(guò)程中，有部分生物酶的氨基酸殘基通過(guò)靜電吸引、疏水和氫鍵作用力進(jìn)入了膨潤(rùn)土層間，但是整個(gè)酶分子由于體積太大，無(wú)論是鈉基膨潤(rùn)土還是有機(jī)改性膨潤(rùn)土的層間都無(wú)法容納酶分子進(jìn)入層間。利用這些方法制備得到的固定化酶，其酶分子大部分吸附在膨潤(rùn)土外表面，直接暴露在反應(yīng)介質(zhì)中，而且生物酶與載體之間的疏水、氫鍵等作用力相對(duì)較弱，酶分子之間容易發(fā)生聚集和重疊吸附，因此固定化酶催化性能的提高也非常有限。此外，由于生物酶基本沒(méi)有接觸到表面積更大的膨潤(rùn)土片層表面，因此載體對(duì)酶的負(fù)載量也比較低，造成載體使用效率的低下。本發(fā)明人也曾對(duì)膨潤(rùn)土及改性膨潤(rùn)土外表面吸附脂肪酶進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該固定化酶的載酶量不高(最大負(fù)載量約為80mg/g載體)，在水相中的催化活性也遠(yuǎn)低于游離酶，而且隨著負(fù)載量的增加固定化酶的催化活性也急劇下 降。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供了一種載酶量和穩(wěn)定性高，同時(shí)也能保持高催化活性的膨潤(rùn)土單層剝離納米片組裝酶及其制備方法。
[0006]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案得以解決:
[0007]—種膨潤(rùn)土單層剝離納米片組裝酶的制備方法，包括以下步驟:
[0008]步驟(1):在pH4_6的緩沖液中加入電解質(zhì)，然后加入膨潤(rùn)土制成膨潤(rùn)土懸浮液，室溫下，將膨潤(rùn)土懸浮液置于超聲儀中超聲處理，同時(shí)攪拌l_5h，制得膨潤(rùn)土單層納米薄片膠體溶液；
[0009]步驟(2):取步驟(1)制得的膠體溶液，加入生物酶與膠體溶液進(jìn)行混合，在25°C下振蕩10-24h，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行離心得到沉淀，該沉淀用去離子水潤(rùn)洗至中性，冷凍干燥后得到產(chǎn)物固定化酶。本發(fā)明方法通過(guò)超聲和攪拌將膨潤(rùn)土層狀材料剝離成比表面積大的單層納米薄片，分散在含有一定量的電解質(zhì)的緩沖體系中制成膠體溶液，通過(guò)控制納米片層的表面和端面電荷、酶分子的表面電荷，使酶分子通過(guò)離子交換吸附在帶負(fù)電的單層納米片表面，憑借納米片層帶正電的端面和帶負(fù)電的表面之間的靜電吸引組裝成固定化酶。上述制備過(guò)程中沒(méi)有加入任何有機(jī)溶劑和有機(jī)化合物，條件溫和，真正實(shí)現(xiàn)了固定化酶的綠色制備。
[0010]作為優(yōu)選，所述的步驟(1)中的電解質(zhì)選取NaCl、Na2C03、Na2S04中任一種，電解質(zhì)的加入能夠減弱膨潤(rùn)土層間正負(fù)離子之間的吸引，使原來(lái)致密的層間結(jié)構(gòu)變得蓬松，從而促進(jìn)膨潤(rùn)土的剝離。
[0011 ] 作為優(yōu)選，所述的步驟(1)中的膨潤(rùn)土采用鈉基膨潤(rùn)土、鈣基膨潤(rùn)土中任一種。膨潤(rùn)土片層較高的機(jī)械強(qiáng)度，以及片層端面與表面之間的靜電吸引使大部分的酶分子被保護(hù)在載體中，有效的減少了催化過(guò)程中酶分子的脫落問(wèn)題，提高了固定化酶的催化穩(wěn)定性。
[0012]作為優(yōu)選，所述的步驟(1)超聲處理頻率為20-60KHZ，經(jīng)合適頻率的超聲波沖擊和空化作用，有效破壞膨潤(rùn)土的層間結(jié)合力，使膨潤(rùn)土單層薄片易于剝離。
[0013]作為優(yōu)選，所述的步驟(2)中生物酶的加入量為膨潤(rùn)土質(zhì)量的1-5倍(生物酶/膨潤(rùn)土為1:1-1:5, w/w)0生物酶分子與單層薄片上的鈉離子的離子交換使酶分子能分散的固定在片層表面原來(lái)的鈉離子點(diǎn)位上，既實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)酶蛋白分子的濃縮(去除了酶制劑中電負(fù)性不同、或帶電量弱的雜蛋白)，同時(shí)又有效的避免了酶分子在催化過(guò)程中的聚集，使酶催化活性得到顯著增強(qiáng)。
[0014]作為優(yōu)選，所述的步驟(2)中離心速率為10000-15000rpm。由于是納米型固定化酶，離心速率過(guò)低的話，離心效果較差，離心速率過(guò)高的話，對(duì)設(shè)備和能耗的要求過(guò)大。
[0015]作為優(yōu)選，所述的膨潤(rùn)土的濃度為0.1%-1.0%。
[0016]作為優(yōu)選，所述的電解質(zhì)的濃度為0.1%-1.0%。電解質(zhì)濃度過(guò)大會(huì)影響材料的結(jié)構(gòu)和性能，以及固定化酶的催化活性。
[0017]作為優(yōu)選，所述的生物酶為蛋白酶、脂肪酶、酯酶等酶催化劑中的其中一種。不同的酶負(fù)載后，負(fù)載量和催化活性有所差別，但都有不同程度的提高。
[0018]本發(fā)明利用酶分子與膨潤(rùn)土納米片層表面的陽(yáng)離子(Na+、Ca2+)之間的離子交換，使酶分子分散的固定在原有的陽(yáng)離子點(diǎn)位上，不僅有效避免了酶固定化過(guò)程中的聚集問(wèn)題，而且大大提高了酶分子的負(fù)載量(可以實(shí)現(xiàn)每g載體3.5g酶蛋白的最高負(fù)載量)。
[0019]本發(fā)明還提供了一種利用上述方法制得的膨潤(rùn)土單層剝離納米片組裝酶(如圖2所示)。
[0020]本發(fā)明由于采用了以上技術(shù)方案，具有顯著的技術(shù)效果:
[0021](1)制備過(guò)程中沒(méi)有加入任何有機(jī)溶劑和有機(jī)化合物，條件溫和，真正實(shí)現(xiàn)固定化酶的綠色制備。
[0022](2)剝離出來(lái)的膨潤(rùn)土單層納米薄片較大的比表面積能實(shí)現(xiàn)Ig載體負(fù)載最高達(dá)
3.5g生物酶的載酶量，提高了載體的利用效率。
[0023](3)生物酶分子與單層薄片上的鈉離子的離子交換使酶分子能分散的固定在片層表面原來(lái)的鈉離子點(diǎn)位上，既實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)酶蛋白分子的濃縮(去除了酶制劑中電負(fù)性不同、或帶電量弱的雜蛋白)，同時(shí)又有效的避免了酶分子在催化過(guò)程中的聚集，使酶催化活性得到顯著增強(qiáng)。
[0024](4)膨潤(rùn)土片層較高的機(jī)械強(qiáng)度，以及片層端面與表面之間的靜電吸引使大部分的酶分子被保護(hù)在載體中，有效的減少了催化過(guò)程中酶分子的脫落問(wèn)題，提高了固定化酶的催化穩(wěn)定性。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1生物酶負(fù)載在膨潤(rùn)土外表面的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0026]圖2生物酶負(fù)載在膨潤(rùn)土納米薄片組裝酶的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0027]圖3膨潤(rùn)土納米片組裝酶的制備工藝流程圖。
[0028]圖4實(shí)施例1中膨潤(rùn)土未負(fù)載脂肪酶(a)的X-射線衍射圖。
[0029]圖5實(shí)施例1中負(fù)載脂肪酶后(b)的X-射線衍射圖。
[0030]圖6實(shí)施例2中固定化脂肪酶的TEM圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合附圖1至附 圖6與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述:[0032]實(shí)施例1
[0033]稱取NaC14.5g溶于500mLpH4.0的醋酸鹽緩沖溶液中，加入鈉基膨潤(rùn)土 5g制成濃度為1%的膨潤(rùn)土懸液。室溫下，將該懸液置于超聲儀中超聲處理(頻率為40KHz)，同時(shí)開(kāi)啟攪拌機(jī)在3000rpm下攪拌,每超聲Ih后停止20min。連續(xù)處理4h后，3000rpm下離心IOmin棄去沉淀，加PH4.0醋酸鹽緩沖液稀釋得到lmg/mL的膨潤(rùn)土剝離納米薄片膠體溶液。取IOOmL該膠體溶液，加入IOOmg牛胰脂肪酶混合，混合液在25°C、200rpm下振蕩20h。結(jié)束后，將該混合液在15000rpm下離心lOmin，得到沉淀。用去離子水洗滌沉淀數(shù)次至中性，冷凍干燥12h后得到固定化脂肪酶固體。將上清液和洗滌液合并，利用Bradford法測(cè)定合并溶液中的剩余蛋白量為Omg，得到脂肪酶在載體上的負(fù)載量為lOOmg，負(fù)載的脂肪酶蛋白與載體的質(zhì)量比為1:1。以脂肪酶水解對(duì)硝基苯棕櫚酸酯為模式反應(yīng)，測(cè)定不同脂肪酶負(fù)載量下固定化脂肪酶的催化活性，發(fā)現(xiàn)固定化酶最高催化活性為游離酶的5倍。每批反應(yīng)結(jié)束，將固定化酶離心后用于下一批反應(yīng)，考察固定化酶的重復(fù)利用性能。發(fā)現(xiàn)反應(yīng)10批之后，固定化酶的催化活性仍保持為初始活性的85%以上，顯示出良好的操作穩(wěn)定性。
[0034]利用XRD測(cè)定膨潤(rùn)土單層薄片負(fù)載和未負(fù)載脂肪酶情況下的層間距變化，發(fā)現(xiàn)未負(fù)載脂肪酶的膨潤(rùn)土薄片經(jīng)干燥后，在原來(lái)的位置上仍然出現(xiàn)了晶體衍射峰，說(shuō)明該載體恢復(fù)成一定的層間結(jié)構(gòu)；而單層薄片負(fù)載脂肪酶后，其晶體衍射峰完全消失，說(shuō)明膨潤(rùn)土單層納米薄片經(jīng)脂肪酶負(fù)載后變成了無(wú)定型的結(jié)構(gòu)。由于在PH4.0條件下，膨潤(rùn)土納米薄片的端面帶正電，表面帶負(fù)電，通過(guò)靜電吸引將端面和表面連接起來(lái)，使固定化酶形成了“卡片屋”式的結(jié)構(gòu)。
[0035]實(shí)施例2
[0036]稱取Na2S043g溶于500mLpH4.0的醋酸鹽緩沖溶液中，加入鈉基膨潤(rùn)土 5g制成濃度為1%的膨潤(rùn)土懸液。室溫下，將該懸液置于超聲儀中超聲處理(頻率為50KHz)，同時(shí)開(kāi)啟攪拌機(jī)在2500rpm下攪 拌,每超聲Ih后停止20min。連續(xù)處理3h后,3000rpm下離心IOmin棄去沉淀,加pH4.0醋酸鹽緩沖液稀釋得到2mg/mL的膨潤(rùn)土剝離納米薄片膠體溶液。取該溶液 IOOmL,加入脂肪酶 YLL (Yarrawia lipolytica lipase) 400mg,混合后在 25°C、200rpm下振蕩24h。結(jié)束后,將混合液在15000rpm下離心IOmin,得到沉淀。用去離子水洗滌沉淀數(shù)次至中性，冷凍干燥12h后得到固定化脂肪酶固體。合并上清液和洗滌液，利用Bradford法測(cè)定合并溶液中的蛋白量為42mg，得到脂肪酶在載體上的負(fù)載量為358mg，負(fù)載的脂肪酶蛋白與載體的質(zhì)量比為3.58:1。以脂肪酶水解對(duì)硝基苯棕櫚酸酯為模式反應(yīng)，測(cè)定不同脂肪酶負(fù)載量下固定化脂肪酶的催化活性，發(fā)現(xiàn)固定化酶最高催化活性為游離酶的3.5倍。每批反應(yīng)結(jié)束，將固定化酶離心后用于下一批反應(yīng)，考察固定化酶的重復(fù)利用性能。發(fā)現(xiàn)反應(yīng)10批之后，固定化酶的催化活性仍保持為初始活性的90%以上，顯示出良好的操作穩(wěn)定性。利用XRD測(cè)定發(fā)現(xiàn)，固定化脂肪酶固體也沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的衍射峰(圖略)，說(shuō)明膨潤(rùn)土載體原有的層間結(jié)構(gòu)不復(fù)存在，推測(cè)固定化酶形成了“卡片屋”式的結(jié)構(gòu)。同時(shí)，該固定化酶的TEM (磷鎢酸負(fù)染法)圖(如圖6所示)顯示，酶蛋白負(fù)載量得到提高的同時(shí)，酶分子都很分散的固定在載體材料上，因此能保持高催化活性。
[0037]實(shí)施例3
[0038]稱取NaC14.5g溶于500mLpH6.0的磷酸鹽緩沖溶液中，加入鈣基膨潤(rùn)土 2.5g制成濃度為0.5%的膨潤(rùn)土懸液。室溫下，將該懸液置于超聲儀中超聲處理(頻率為60KHz)，同時(shí)開(kāi)啟攪拌機(jī)在3000rpm下攪拌,每超聲Ih后停止20min。連續(xù)處理5h后,3000rpm下離心IOmin棄去沉淀,加入pH6.0磷酸鹽緩沖液稀釋得到0.5mg/mL的膨潤(rùn)土剝離納米薄片膠體溶液。取該溶液IOOmL,加入180mg胰蛋白酶，在25°C、200rpm下振蕩24h。結(jié)束后，將該反應(yīng)液在15000rpm下離心IOmin,得到沉淀。用去離子水洗漆沉淀數(shù)次至中性,冷凍干燥12h后得到固定化胰蛋白酶固體。合并上清液和洗滌液，利用Bradford法測(cè)定合并溶液中的蛋白量為30mg，得到蛋白酶在載體上的負(fù)載量為150mg，負(fù)載的胰蛋白酶與載體的質(zhì)量比為3:1。以蛋白酶水解BAEE為模式反應(yīng)，測(cè)定不同蛋白酶負(fù)載量下固定化胰蛋白酶的催化活性，發(fā)現(xiàn)固定化酶最高催化活性為游離酶的2.8倍。每批反應(yīng)結(jié)束，將固定化酶離心后用于下一批反應(yīng)，考察固定化酶的重復(fù)利用性能。發(fā)現(xiàn)反應(yīng)6批之后，固定化酶的催化活性仍保持為初始活性的85%以上，顯示出良好的操作穩(wěn)定性。利用XRD測(cè)定發(fā)現(xiàn)，固定化胰蛋白酶固體沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的衍射峰(圖略)，說(shuō)明膨潤(rùn)土載體原有的層間結(jié)構(gòu)不復(fù)存在，推測(cè)固定化酶形成了 “卡片屋”式的結(jié)構(gòu)。
[0039]實(shí)施例4
[0040]稱取Na2C032.5g溶于500mLpH5.0的醋酸鹽緩沖溶液中，加入鈣基膨潤(rùn)土 3g制成濃度為0.6%的膨潤(rùn)土懸液。室溫下，將該懸液置于超聲儀中超聲處理(頻率為40KHz)，同時(shí)開(kāi)啟攪拌機(jī)在3000rpm下攪拌,每超聲Ih后停止20min。連續(xù)處理5h后,3000rpm下離心IOmin棄去沉淀,加入pH5.0醋酸鹽緩沖液稀釋得到lmg/mL的膨潤(rùn)土剝離納米薄片膠體溶液。取IOOmL該膠體溶液，加入200mg糜蛋白酶，在25°C、200rpm下振蕩24h。結(jié)束后，將該反應(yīng)液在15000rpm下離心IOmin,得到沉淀。用去離子水洗漆沉淀數(shù)次至中性,冷凍干燥12h后得到固定化糜蛋白酶固體。合并上清液和洗滌液，利用Bradford法測(cè)定合并溶液中的蛋白量為35mg，得到蛋白酶在載體上的負(fù)載量為165mg，負(fù)載的糜蛋白酶與載體的質(zhì)量比為1.65:1。以蛋白酶水解BAEE為模式反應(yīng)，測(cè)定不同糜蛋白酶負(fù)載量下固定化糜蛋白酶的催化活性，發(fā)現(xiàn)固定化酶最高催化活性為游離酶的5倍。利用XRD測(cè)定發(fā)現(xiàn)，固定化糜蛋白酶固體沒(méi)有相應(yīng)的衍射峰( 圖略)，說(shuō)明膨潤(rùn)土載體原有層間結(jié)構(gòu)不復(fù)存在，推測(cè)固定化酶形成了“卡片屋”式的結(jié)構(gòu)。
[0041]實(shí)施例5
[0042]稱取NaC13g溶于500mLpH4.0的醋酸鹽緩沖溶液中，加入鈉基膨潤(rùn)土 5g制成濃度為1%的膨潤(rùn)土懸液。室溫下，將該懸液置于超聲儀中超聲處理(頻率為40KHz)，同時(shí)開(kāi)啟攪拌機(jī)在3000rpm下攪拌,每超聲Ih后停止20min。連續(xù)處理4h后，3000rpm下離心IOmin棄去沉淀，加入PH4.0醋酸鹽緩沖液稀釋得到0.5mg/mL的膨潤(rùn)土剝離納米薄片膠體溶液。取IOOmL該膠體溶液，加入200mg牛血清白蛋白，在25°C、200rpm下振蕩24h。結(jié)束后，將該反應(yīng)液在15000rpm下離心IOmin,得到沉淀。用去離子水洗漆沉淀數(shù)次至中性,冷凍干燥12h后得到固定化牛血清白蛋白固體。合并上清液和洗滌液，利用Bradford法測(cè)定合并溶液中的蛋白量為25mg，得到蛋白酶在載體上的負(fù)載量為175mg，負(fù)載的牛血清白蛋白與載體的質(zhì)量比為3.5:1。利用XRD測(cè)定發(fā)現(xiàn)，固定化牛血清白蛋白固體沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的衍射峰(圖略)，說(shuō)明膨潤(rùn)土載體原有層間結(jié)構(gòu)不復(fù)存在，推測(cè)固定化牛血清白蛋白形成了“卡片屋”式的結(jié)構(gòu)。
[0043]本發(fā)明利用酶分子與膨潤(rùn)土納米片層表面的陽(yáng)離子(Na+、Ca2+)之間的離子交換，使酶分子分散的固定在原有的陽(yáng)離子點(diǎn)位上，不僅有效避免了酶固定化過(guò)程中的聚集問(wèn)題，而且大大提高了酶分子的負(fù)載量(可以實(shí)現(xiàn)每g載體3.5g酶蛋白的最高負(fù)載量)。該制備方法無(wú)需加入任何有機(jī)溶劑和有機(jī)化合物，與大部分酶固定化過(guò)程中要加入有機(jī)溶劑和有機(jī)化合物相比，本方法真正實(shí)現(xiàn)了酶催化劑的綠色制備。本發(fā)明制備得到的固定化酶的催化活性得到顯著提高(水相中的催化活性最高為游離酶的5倍)，克服了一般固定化酶在水相中的催化活性要低于游離酶的缺點(diǎn)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了生物酶的多批次穩(wěn)定化操作。
[0044]總之，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所作的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明專利的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種膨潤(rùn)土單層剝離納米片組裝酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟(1):在PH4-6的緩沖液中加入電解質(zhì)，然后加入膨潤(rùn)土制成膨潤(rùn)土懸浮液，室溫下，將膨潤(rùn)土懸浮液置于超聲儀中超聲處理，同時(shí)攪拌l_5h，制得膨潤(rùn)土單層納米薄片膠體溶液；步驟(2):取步驟(1)制得的膠體溶液，加入生物酶與膠體溶液進(jìn)行混合，在25°C下振蕩10-24h，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行離心得到沉淀，該沉淀用去離子水潤(rùn)洗至中性，冷凍干燥后得到產(chǎn)物固定化酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膨潤(rùn)土單層剝離納米片組裝酶的制備方法，其特征在于:所述的步驟(1)中的電解質(zhì)選取NaCl、Na2CO3^ Na2SO4中任一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膨潤(rùn)土單層剝離納米片組裝酶的制備方法，其特征在于:所述的步驟(1)中的膨潤(rùn)土采用鈉基膨潤(rùn)土、鈣基膨潤(rùn)土中任一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膨潤(rùn)土單層剝離納米片組裝酶的制備方法，其特征在于:所述的步驟(1)超聲處理頻率為20-60KHZ。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膨潤(rùn)土單層剝離納米片組裝酶的制備方法，其特征在于:所述的步驟(2)中生物酶的加入量為膨潤(rùn)土質(zhì)量的1-5倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膨潤(rùn)土單層剝離納米片組裝酶的制備方法，其特征在于:所述的步驟(2)中離心速率為10000-15000rpm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膨潤(rùn)土單層剝離納米片組裝酶的制備方法，其特征在于:所述的膨潤(rùn)土的濃度為0.1%-1.0%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述`的膨潤(rùn)土單層剝離納米片組裝酶的制備方法，其特征在于:所述的電解質(zhì)的濃度為0.1%-1.0%。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的膨潤(rùn)土單層剝離納米片組裝酶的制備方法，其特征在于:所述的生物酶為蛋白酶或脂肪酶。
10.一種利用所述權(quán)利要求1-9任一方法制得的膨潤(rùn)土單層剝離納米片組裝酶。
【文檔編號(hào)】C12N11/14GK103627694SQ201310606938
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月25日
【發(fā)明者】董華平, 李益民, 李建法, 盛國(guó)棟, 吳夢(mèng)琪, 徐丹紅 申請(qǐng)人:紹興文理學(xué)院