一種乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種乙型肝炎病毒(HBV)的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管，操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、靈敏度高，還公開(kāi)了該種乙型肝炎病毒(HBV)的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管的使用方法。本發(fā)明采用直通式定量PCR技術(shù)，將以納米磁珠為主的核酸自動(dòng)化提取與熒光定量PCR反應(yīng)有機(jī)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)核酸的全封閉全自動(dòng)快速檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)便易行，反應(yīng)迅速，靈敏度高，操作環(huán)境相對(duì)寬松，無(wú)需建立專門的PCR實(shí)驗(yàn)室，節(jié)省人力物力等優(yōu)勢(shì)。
【專利說(shuō)明】—種乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種乙型肝炎病毒(HBV)的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管，還涉及該種乙型肝炎病毒(HBV)的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管的使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乙型肝炎病毒(hepatitisB virus, HBV)屬嗜肝 DNA 病毒科(hepadnaviridae)，主要侵犯肝細(xì)胞，在肝細(xì)胞內(nèi)定居復(fù)制并損害肝細(xì)胞，引起肝細(xì)胞炎癥、壞死、纖維化。我國(guó)目前乙肝病毒攜帶率為7.18%，其中約三分之一有反復(fù)肝損害，表現(xiàn)為活動(dòng)性的乙型肝炎或者肝硬化。乙型肝炎病毒基因組長(zhǎng)約3.2kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA，共有四個(gè)開(kāi)放讀框，分別編碼病毒的Core核衣殼蛋白和S包膜蛋白，病毒復(fù)制酶(聚合酶)及一種與病毒基因表達(dá)有關(guān)的蛋白質(zhì)X。
[0003]乙型肝炎病毒基因檢查的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依賴于血清特異性抗原抗體(ELISA)檢測(cè)和基因(DNA)檢測(cè)。ELISA方法是臨床診斷HBV感染的傳統(tǒng)手段，反映機(jī)體HBV感染的免疫狀態(tài)。而乙型肝炎病毒基因(DNA)檢測(cè)則是采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，特異性擴(kuò)增乙肝病毒基因組片段，以近于2n的指數(shù)(n為循環(huán)次數(shù))，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可將極微量的乙肝病毒基因(DNA)特定的分子 片斷擴(kuò)增至IX IO7~IX IO8倍，大大提高了乙型肝炎病毒的檢出率，PCR技術(shù)相對(duì)于ELISA方法，靈敏度高，特異性強(qiáng)，而且不受免疫學(xué)方法的“窗口期”限制影響，為臨床診斷HBV感染提供了一種強(qiáng)有力的手段。
[0004]然而，隨著PCR等分子診斷技術(shù)在臨床檢驗(yàn)方面的推廣應(yīng)用，其局限性也日益顯現(xiàn)。主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是由于常規(guī)PCR技術(shù)的高靈敏度，極易因微量樣品污染產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，因此常規(guī)PCR檢測(cè)對(duì)操作人員的素質(zhì)和操作環(huán)境都要求較高，按照衛(wèi)生部的標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)醫(yī)院如在臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目上開(kāi)展運(yùn)用常規(guī)PCR技術(shù)，必須建立專用的PCR實(shí)驗(yàn)室，并對(duì)操作人員進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)后才能進(jìn)行，這必然提高了 PCR檢測(cè)的使用成本。二是目前在做PCR反應(yīng)檢測(cè)之前，仍需依靠傳統(tǒng)的手工方式將臨床樣本中的核酸提取純化，然后再與PCR試劑混合進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)，程序繁瑣，耗時(shí)耗力，這在一定程度上限制了 PCR檢測(cè)在臨床診斷方面，特別是對(duì)大批量樣本檢測(cè)時(shí)的普及運(yùn)用。
[0005]針對(duì)常規(guī)PCR技術(shù)的局限性，近年來(lái)出現(xiàn)了運(yùn)用新興的納米核酸磁珠技術(shù)自動(dòng)化提取生物樣本中的核酸，并聯(lián)機(jī)熒光定量PCR反應(yīng)儀，實(shí)現(xiàn)從核酸提取到PCR反應(yīng)的全自動(dòng)核酸提取擴(kuò)增系統(tǒng)。目前已有Roche、Cepheid、IQuum等公司出一管式全自動(dòng)核酸提取擴(kuò)增儀器，利用這些儀器平臺(tái)的全自動(dòng)病原體核酸檢測(cè)技術(shù)能夠?qū)⒑怂崽崛〉絇CR反應(yīng)的過(guò)程在一根檢測(cè)管內(nèi)的全自動(dòng)完成，極大地提高工作效率，有效地消除了假陽(yáng)性污染風(fēng)險(xiǎn)，日益成為醫(yī)學(xué)分子診斷領(lǐng)域新的發(fā)展方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題就是提供一種操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、靈敏度高的乙型肝炎病毒(HBV)的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供該種乙型肝炎病毒(HBV)的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管的使用方法。
[0008]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:一種乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管，包括用于裝入待測(cè)血清標(biāo)本的待測(cè)血清標(biāo)本腔及檢測(cè)試劑腔，所述檢測(cè)試劑腔包括:
[0009]用于裝入裂解緩沖液的裂解緩沖液腔，
[0010]用于裝入核酸提取磁珠的核酸提取磁珠腔，
[0011]用于裝入核酸提取洗滌液的核酸提取洗滌液腔，
[0012]用于裝入核酸提取洗脫液的核酸提取洗脫液腔，
[0013]用于裝入熒光定量PCR反應(yīng)液的熒光定量PCR反應(yīng)液腔，
[0014]以及用于裝入PCR反應(yīng)引物和探針的PCR反應(yīng)引物和探針腔；
[0015]所述PCR反應(yīng)引物的序列為:
[0016]HBVl:5’-CGCACCTCTCTTT ACG-3，；
[0017]HBV2:5，-GGTGAAGCGAAGTGC-3，；
[0018]所述探針的序列為:
[0019]HBV-P:5’-CCGTCTGTGCCTTCTCATCT-3，。
[0020]優(yōu)選的，所述裂解緩沖液為含有異硫氰酸胍的緩沖液。
[0021]優(yōu)選的，所述裂解緩沖液包括以下組分:濃度為2mol/L的異硫氰酸胍、濃度為20X 10^3mol/L的檸檬酸鈉、濃度為0.lmol/L的P -巰基乙醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的十二烷基肌酸鈉、PH值為5.5的Tris-HCl緩沖液和濃度為IOX 10_3mol/L的溶劑。其中，溶劑為生理鹽水或其他適于配制裂解緩沖液的溶劑。
[0022]優(yōu)選的，所述核酸提取磁珠為含有磁性納米微球的溶液。
[0023]優(yōu)選的，所述核酸提取洗滌液包括以下組分:濃度為0.lmol/L的甘氨酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的ProCl in300系列防腐劑、pH值為5.5的Tri s-HCl緩沖液和濃度為IOX 10_3mol/L的溶劑。ProClin系列防腐劑的活性成分主要是2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MCI)和5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(CMCI)。這兩種成分抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)以及促使細(xì)胞凋亡的原理相同?；钚猿煞衷谂c細(xì)胞膜接觸幾分鐘后，立即可以滲透到膜內(nèi)并抑制細(xì)胞內(nèi)酶的活性。
[0024]優(yōu)選的，所述核酸提取洗脫液包括以下組分:濃度為150X10_3mol/L的氯化鎂水溶液、濃度為50g/L的牛血清白蛋白(BSA)、pH值為8.5的Tris-HCl緩沖液和濃度為10Xl(T3mol/L 的溶劑。
[0025]優(yōu)選的，所述熒光定量PCR反應(yīng)液包括以下組分:含有2.5U的PCR反應(yīng)Taq酶的4倍濃度PCR反應(yīng)緩沖液。
[0026]優(yōu)選的，所述裂解緩沖液腔內(nèi)裝有100 U L的裂解緩沖液，
[0027]核酸提取磁珠腔內(nèi)裝有10 y L的核酸提取磁珠，
[0028]核酸提取洗滌液腔內(nèi)裝有300 U L的核酸提取洗滌液，
[0029]核酸提取洗脫液腔內(nèi)裝有20 y L的核酸提取洗脫液，
[0030]熒光定量PCR反應(yīng)液腔內(nèi)裝有10 ii L的熒光定量PCR反應(yīng)液，[0031]PCR反應(yīng)引物和探針腔內(nèi)裝有IOii L的PCR反應(yīng)引物和探針，
[0032]其中，PCR反應(yīng)引物和探針的濃度分別為0.8 ii mol/L和0.4 ii mol/L。
[0033]優(yōu)選的，所述每個(gè)腔之間通過(guò)105°C熱封閉分離。
[0034]該種乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管的使用方法，依次包括以下步驟:
[0035]步驟一、全自動(dòng)快速乙型肝炎病毒核酸提取純化程序:
[0036]將50~100 ii L的待測(cè)血清標(biāo)本裝入待測(cè)血清標(biāo)本腔，將全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管放入全自動(dòng)核酸檢測(cè)儀；
[0037]所述待測(cè)血清標(biāo)本與裂解緩沖液腔內(nèi)的裂解緩沖液混合均勻，樣本血清釋放核酸，時(shí)間30秒，得到混合液A ;
[0038]然后混合液A與核酸提取磁珠腔內(nèi)的核酸提取磁珠混合均勻，核酸與磁珠結(jié)合，時(shí)間30秒，得到混合液B ；
[0039]全自動(dòng)核酸檢測(cè)儀步進(jìn)電機(jī)擠壓混合液B移去裂解液雜質(zhì)，結(jié)合核酸的磁珠與核酸提取洗滌液腔內(nèi)的核酸提取洗滌液混合均勻，洗滌純化核酸，時(shí)間40秒，得到混合液C ；
[0040]全自動(dòng)核酸檢測(cè)儀步進(jìn)電機(jī)擠壓混合液C移去洗滌液，結(jié)合核酸的磁珠與核酸提取洗脫液腔內(nèi)的核酸提取洗脫液混合均勻，核酸自磁珠上分離至核酸提取洗脫液中，時(shí)間20秒，得到混合液D ;
[0041]步驟二、乙型肝炎 病毒快速熒光定量PCR反應(yīng)程序:
[0042]通過(guò)全自動(dòng)核酸檢測(cè)儀步進(jìn)電機(jī)的擠壓，將含有混合液D與熒光定量PCR反應(yīng)液腔內(nèi)的熒光定量PCR反應(yīng)液、PCR反應(yīng)引物和探針腔內(nèi)的PCR反應(yīng)引物和探針混合均勻，實(shí)施快速熒光定量PCR反應(yīng)，控制溫度在95°C下2分鐘，進(jìn)行預(yù)變性，再進(jìn)行40個(gè)循環(huán)變溫過(guò)程:先控制溫度在95°C下4秒，再控制溫度在60°C下8秒，此為一個(gè)循環(huán)變溫過(guò)程；其中單個(gè)循環(huán)升、降溫時(shí)間均為4秒。
[0043]本發(fā)明采用直通式定量PCR技術(shù)，將以納米磁珠為主的核酸自動(dòng)化提取與熒光定量PCR反應(yīng)有機(jī)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)核酸的全封閉全自動(dòng)快速檢測(cè)，主要優(yōu)點(diǎn)如下:
[0044](I).操作簡(jiǎn)便易行，將用于檢測(cè)乙型肝炎病毒(HBV)的核酸提取試劑與熒光定量PCR反應(yīng)試劑預(yù)裝入檢測(cè)試劑管，操作時(shí)只需一次性加入待檢樣品即可一管式完成全部反應(yīng)，自動(dòng)化程度高，消除了潛在的假陽(yáng)性污染風(fēng)險(xiǎn)。
[0045](2).反應(yīng)迅速，乙型肝炎病毒(HBV)核酸樣本抽提和定量PCR反應(yīng)全部過(guò)程控制在20分鐘內(nèi)完成，比現(xiàn)行的2~3小時(shí)反應(yīng)時(shí)間大大縮短。
[0046](3).靈敏度高，目前的常規(guī)檢測(cè)方式只能從待測(cè)樣本核酸中吸取1/20~1/10量進(jìn)行PCR反應(yīng)(如從100 u L樣本核酸中取5~10 ii L)，而本發(fā)明中通過(guò)全自動(dòng)化提取的待測(cè)樣本核酸將全部用于熒光定量PCR反應(yīng)，靈敏度比現(xiàn)行方式提高10~20倍。
[0047](4).由于檢測(cè)方式實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化反應(yīng)，操作環(huán)境相對(duì)寬松，無(wú)需建立專門的PCR實(shí)驗(yàn)室，節(jié)省人力物力。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0048]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述:[0049]圖1為本發(fā)明乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0050]圖2為本發(fā)明乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管的使用方法流程示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0051]實(shí)施例1
[0052]如圖1、2所示，為本發(fā)明一種乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管，包括用于裝入待測(cè)血清標(biāo)本的待測(cè)血清標(biāo)本腔1及檢測(cè)試劑腔，所述檢測(cè)試劑腔包括:
[0053]用于裝入裂解緩沖液的裂解緩沖液腔2，
[0054]用于裝入核酸提取磁珠的核酸提取磁珠腔4，
[0055]用于裝入核酸提取洗滌液的核酸提取洗滌液腔3，
[0056]用于裝入核酸提取洗脫液的核酸提取洗脫液腔5，
[0057]用于裝入熒光定量PCR反應(yīng)液的熒光定量PCR反應(yīng)液腔6，
[0058]以及用于裝入PCR反應(yīng)引物和探針的PCR反應(yīng)引物和探針腔7 ；
[0059]所述PCR反應(yīng)引物的序列為:
[0060]HBVl:5’-CGCACCTCTCTTTACG-3，；
[0061 ] HBV2:5，-GGTGAAGCGAAGTGC-3，；
[0062]所述探針的序列為:
[0063]HBV-P:5’-CCGTCTGTGCCTTCTCATCT-3，。
[0064]所述裂解緩沖液腔2內(nèi)裝有100 u L的裂解緩沖液，裂解緩沖液為含有蛋白質(zhì)變性劑異硫氰酸胍的用于裂解細(xì)胞的緩沖液，具體包括以下組分:濃度為2mol/L的異硫氰酸胍、濃度為20X 10_3mol/L的檸檬酸鈉、濃度為0.lmol/L的P -巰基乙醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的十二烷基肌酸鈉、pH值為5.5的Tris-HCl緩沖液和濃度為IOX 10_3mol/L的溶劑。
[0065]所述核酸提取磁珠腔4內(nèi)裝有10 uL的核酸提取磁珠，核酸提取磁珠為含有磁性納米微球的用于提取吸附RNA和DNA的溶液。
[0066]所述核酸提取洗滌液腔3內(nèi)裝有300uL的核酸提取洗滌液，核酸提取洗滌液為用于洗滌磁珠表面雜質(zhì)的溶液，具體包括以下組分:濃度為0.lmol/L的甘氨酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的ProClin300系列防腐劑、pH值為5.5的Tris-HCl緩沖液和濃度為1OX l0-3mol/L的溶劑。其中，溶劑為生理鹽水或其他適于配制裂解緩沖液的溶劑。
[0067]所述核酸提取洗脫液腔5內(nèi)裝有20 y L的核酸提取洗脫液，核酸提取洗脫液用于洗脫吸附于磁珠表面的核酸，具體包括以下組分:濃度為150X10_3mOl/L的氯化鎂水溶液、濃度為50g/L的牛血清白蛋白、pH值為8.5的Tris-HCl緩沖液和濃度為1OX 10_3mol/L的溶劑。
[0068]所述熒光定量PCR反應(yīng)液腔6內(nèi)裝有10 i L的熒光定量PCR反應(yīng)液，熒光定量PCR反應(yīng)液包括以下組分:含有2.5U的PCR反應(yīng)Taq酶的4倍濃度PCR反應(yīng)緩沖液。
[0069]所述PCR反應(yīng)引物和探針腔7內(nèi)裝有1OiL的PCR反應(yīng)引物和探針，PCR反應(yīng)引物和探針的濃度分別為0.8 umol/L和0.4 umol/L。
[0070]所述每個(gè)腔之間通過(guò)105°C熱封閉分離。并將本發(fā)明的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管長(zhǎng)期保存于4°C環(huán)境下。[0071]如圖2所示，為該種乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管的使用方法，依次包括以下步驟:
[0072]步驟一、全自動(dòng)快速乙型肝炎病毒核酸提取純化程序:
[0073]將50~100 ii L的待測(cè)血清標(biāo)本裝入待測(cè)血清標(biāo)本腔，將全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管放入全自動(dòng)核酸檢測(cè)儀；
[0074]所述待測(cè)血清標(biāo)本與裂解緩沖液腔2內(nèi)的裂解緩沖液混合均勻，樣本血清釋放核酸，時(shí)間30秒，得到混合液A ;
[0075]然后混合液A與核酸提取磁珠腔4內(nèi)的核酸提取磁珠混合均勻，核酸與磁珠結(jié)合，時(shí)間30秒，得到混合液B ；
[0076]全自動(dòng)核酸檢測(cè)儀步進(jìn)電機(jī)擠壓混合液B移去裂解液雜質(zhì)，結(jié)合核酸的磁珠與核酸提取洗滌液腔3內(nèi)的核酸提取洗滌液混合均勻，洗滌純化核酸，時(shí)間40秒，得到混合液C ；
[0077]全自動(dòng)核酸檢測(cè)儀步進(jìn)電機(jī)擠壓混合液C移去洗滌液，結(jié)合核酸的磁珠與核酸提取洗脫液腔5內(nèi)的核酸提取洗脫液混合均勻，核酸自磁珠上分離至核酸提取洗脫液中，時(shí)間20秒，得到混合液D ;
[0078]步驟二、乙型肝炎病毒快速熒光定量PCR反應(yīng)程序:
[0079]通過(guò)全自動(dòng)核酸檢測(cè)儀步進(jìn)電機(jī)的擠壓，將含有混合液D與熒光定量PCR反應(yīng)液腔6內(nèi)的熒光定量PCR反應(yīng)液、PCR反應(yīng)引物和探針腔7內(nèi)的PCR反應(yīng)引物和探針混合均勻，實(shí)施快速熒光定量PCR反應(yīng)，控制溫度在95 °C下2分鐘，進(jìn)行預(yù)變性，再進(jìn)行40個(gè)循環(huán)變溫過(guò)程:先控制溫度在95°C下4秒，再控制溫度在60°C下8秒，此為一個(gè)循環(huán)變溫過(guò)程；其中單個(gè)循環(huán)升、降溫時(shí)間均為4秒。全部PCR反應(yīng)時(shí)間13分鐘完成。
[0080]實(shí)施例2
[0081]將本發(fā)明實(shí)施例1中的乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管用于檢測(cè)含有乙型肝炎病毒DNA的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。
[0082]將50 ii L含有乙型肝炎病毒DNA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的大腸桿菌液，加入本發(fā)明實(shí)施例1中的乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管，然后將檢測(cè)試劑管放入一管式全自動(dòng)核酸提取擴(kuò)增儀，按照實(shí)施例1中的使用方法設(shè)定反應(yīng)程序，裂解30秒；磁珠結(jié)合30秒；洗滌40秒；洗脫20秒；快速熒光定量PCR反應(yīng)，95 0C 2分鐘預(yù)變性，進(jìn)行40個(gè)變溫循環(huán)，單個(gè)變溫循環(huán)包括95°C 4秒和60°C 8秒，全部反應(yīng)時(shí)間約20分鐘完成。
[0083]將實(shí)施例2的檢測(cè)數(shù)據(jù)與以下對(duì)比實(shí)驗(yàn)一、二進(jìn)行對(duì)比。每組實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，乙型肝炎病毒DNA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的突光定量PCR反應(yīng)Ct值檢測(cè)數(shù)據(jù)如表1所示。
[0084]對(duì)比實(shí)驗(yàn)一，使用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA抽提試劑盒從50 y L大腸桿菌液中提取乙型肝炎病毒DNA質(zhì)粒，終體積20 ii L，將20 ii L DNA質(zhì)粒加入預(yù)裝有熒光定量PCR反應(yīng)液PCR反應(yīng)引物和探針的檢測(cè)試劑管，然后將檢測(cè)試劑管放入一管式全自動(dòng)核酸提取擴(kuò)增儀，設(shè)定快速熒光定量PCR反應(yīng)程序，950C 2分鐘預(yù)變性，進(jìn)行40個(gè)變溫循環(huán)，單個(gè)變溫循環(huán)包括95°C 4秒和60°C 8秒，全部反應(yīng)時(shí)間約13分鐘完成。
[0085]對(duì)比實(shí)驗(yàn)二，使用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA抽提試劑盒從50 y L大腸桿菌液中提取乙型肝炎病毒DNA質(zhì)粒，終體積20 ii L，取2 ii L DNA質(zhì)粒與18 y L的熒光定量PCR反應(yīng)液在0.2mL常規(guī)PCR反應(yīng)管中混勻，該P(yáng)C·R反應(yīng)液成份比例與本發(fā)明檢測(cè)試劑管中的熒光定量PCR反應(yīng)液PCR反應(yīng)引物和探針相同，然后將PCR反應(yīng)管放入常規(guī)熒光定量PCR反應(yīng)儀中，設(shè)定熒光定量PCR反應(yīng)程序，950C 2分鐘預(yù)變性，進(jìn)行40個(gè)變溫循環(huán)，單個(gè)變溫循環(huán)包括95°C 10秒和60°C 40秒，全部反應(yīng)時(shí)間約75分鐘完成。
[0086]表1
[0087]
【權(quán)利要求】
1.一種乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管，其特征在于:包括用于裝入待測(cè)血清標(biāo)本的待測(cè)血清標(biāo)本腔(I)及檢測(cè)試劑腔，所述檢測(cè)試劑腔包括: 用于裝入裂解緩沖液的裂解緩沖液腔(2)， 用于裝入核酸提取磁珠的核酸提取磁珠腔(4 )， 用于裝入核酸提取洗滌液的核酸提取洗滌液腔(3 )， 用于裝入核酸提取洗脫液的核酸提取洗脫液腔(5 )， 用于裝入熒光定量PCR反應(yīng)液的熒光定量PCR反應(yīng)液腔(6)， 以及用于裝入PCR反應(yīng)引物和探針的PCR反應(yīng)引物和探針腔(7)； 所述PCR反應(yīng)引物的序列為:
HBVl:5’-CGCACCTCTCTTTACG-3’ ；
HBV2:5，-GGTGAAGCGAAGTGC-3，； 所述探針的序列為:
HBV-P:5’-CCGTCTGTGCCTTCTCATCT-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管，其特征在于:所述裂解緩沖液為含有異硫氰酸胍的緩沖液。`
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管，其特征在于:所述裂解緩沖液包括以下組分:濃度為2mol/L的異硫氰酸胍、濃度為20X 10_3mol/L的檸檬酸鈉、濃度為0.lmol/L的P -巰基乙醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的十二烷基肌酸鈉、pH值為5.5的Tris-HCl緩沖液和濃度為IOX 10_3mOl/L的溶劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管，其特征在于:所述核酸提取磁珠為含有磁性納米微球的溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管，其特征在于:所述核酸提取洗滌液包括以下組分:濃度為0.lmol/L的甘氨酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的ProClin300系列防腐劑、pH值為5.5的Tris-HCl緩沖液和濃度為IOX 10_3mol/L的溶劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管，其特征在于:所述核酸提取洗脫液包括以下組分:濃度為150X10_3mol/L的氯化鎂水溶液、濃度為50g/L的牛血清白蛋白、pH值為8.5的Tris-HCl緩沖液和濃度為10X10_3mol/L的溶劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管，其特征在于:所述熒光定量PCR反應(yīng)液包括以下組分:含有2.5U的PCR反應(yīng)Taq酶的4倍濃度PCR反應(yīng)緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管，其特征在于:所述裂解緩沖液腔(2)內(nèi)裝有IOOy L的裂解緩沖液， 核酸提取磁珠腔(4)內(nèi)裝有IOy L的核酸提取磁珠， 核酸提取洗滌液腔(3)內(nèi)裝有300 y L的核酸提取洗滌液， 核酸提取洗脫液腔(5)內(nèi)裝有20 y L的核酸提取洗脫液， 熒光定量PCR反應(yīng)液腔(6)內(nèi)裝有10 ii L的熒光定量PCR反應(yīng)液， PCR反應(yīng)引物和探針腔(7)內(nèi)裝有IOiiL的PCR反應(yīng)引物和探針， 其中，PCR反應(yīng)引物和探針的濃度分別為0.8 ii mo I/L和0.4 y mol/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任意一項(xiàng)所述一種乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管，其特征在于:所述每個(gè)腔之間通過(guò)105°C熱封閉分離。
10.權(quán)利要求1所述一種乙型肝炎病毒的全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管的使用方法，其特征在于:依次包括以下步驟: 步驟一、全自動(dòng)快速乙型肝炎病毒核酸提取純化程序: 將50~100 ii L的待測(cè)血清標(biāo)本裝入待測(cè)血清標(biāo)本腔，將全自動(dòng)快速核酸檢測(cè)試劑管放入全自動(dòng)核酸檢測(cè)儀； 所述待測(cè)血清標(biāo)本與裂解緩沖液腔(2)內(nèi)的裂解緩沖液混合均勻，樣本血清釋放核酸，時(shí)間30秒，得到混合液A ； 然后混合液A與核酸提取磁珠腔(4)內(nèi)的核酸提取磁珠混合均勻，核酸與磁珠結(jié)合，時(shí)間30秒，得到混合液B ;全自動(dòng)核酸檢測(cè)儀步進(jìn)電機(jī)擠壓混合液B移去裂解液雜質(zhì)，結(jié)合核酸的磁珠與核酸提取洗滌液腔(3)內(nèi)的核酸提取洗滌液混合均勻，洗滌純化核酸，時(shí)間40秒，得到混合液C ；全自動(dòng)核酸檢測(cè)儀步進(jìn)電機(jī)擠壓混合液C移去洗滌液，結(jié)合核酸的磁珠與核酸提取洗脫液腔(5)內(nèi)的核酸提取洗脫液混合均勻，核酸自磁珠上分離至核酸提取洗脫液中，時(shí)間20秒，得到混合液D ; 步驟二、乙型肝炎病毒快速熒光定量PCR反應(yīng)程序: 通過(guò)全自動(dòng)核 酸檢測(cè)儀步進(jìn)電機(jī)的擠壓，將含有混合液D與熒光定量PCR反應(yīng)液腔(6)內(nèi)的熒光定量PCR反應(yīng)液、PCR反應(yīng)引物和探針腔(7)內(nèi)的PCR反應(yīng)引物和探針混合均勻，實(shí)施快速熒光定量PCR反應(yīng)，控制溫度在95°C下2分鐘，進(jìn)行預(yù)變性，再進(jìn)行40個(gè)循環(huán)變溫過(guò)程:先控制溫度在95°C下4秒，再控制溫度在60°C下8秒，此為一個(gè)循環(huán)變溫過(guò)程；其中單個(gè)循環(huán)升、降溫時(shí)間均為4秒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103627820SQ201310608556
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】夏放 申請(qǐng)人:諸暨脈達(dá)生物科技有限公司