食用油中轉(zhuǎn)基因成分CaMV35S的恒溫檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了食用油中轉(zhuǎn)基因成分CaMV35S的恒溫檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒。該方法可穩(wěn)定從植物油中提取核酸成分，并采用恒溫?cái)U(kuò)增的方法在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)，所述方法包括如下步驟：包括如下步驟：1）提取待檢樣品DNA；2）待檢樣品DNA在引物、BstDNA聚合酶存在的條件下進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；3）根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判斷待檢樣品中是否存在CaMV35S轉(zhuǎn)基因成分。該方法具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、高特異性、高靈敏度、鑒定簡(jiǎn)便、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等特點(diǎn)，能快速檢測(cè)食用油中轉(zhuǎn)基因成分CaMV35S。
【專利說明】食用油中轉(zhuǎn)基因成分CaMV35S的恒溫檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物分子檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種食用油中轉(zhuǎn)基因成分CaMV35S的恒溫檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]自20世紀(jì)70年代轉(zhuǎn)基因生物和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品被開發(fā)以來，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品發(fā)展迅猛。到目前為止，已經(jīng)有超過100種以上的轉(zhuǎn)基因植物被商業(yè)化種植，其中最廣泛的是作為食用油加工原料的大豆、油菜和玉米。由于這些轉(zhuǎn)基因油料作物出油率高、制油成本低，各發(fā)展中國(guó)家紛紛進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆和油菜作為制油原料。但由于目前尚缺乏科學(xué)依據(jù)證明轉(zhuǎn)基因食品的安全性，因而對(duì)轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)的需求也越來越緊迫。近年來，中國(guó)進(jìn)口的制油原料中，有相當(dāng)數(shù)量的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，尤其是轉(zhuǎn)基因大豆，中國(guó)進(jìn)口的大豆幾乎100%為轉(zhuǎn)基因大豆。由于世界上已經(jīng)有很多國(guó)家規(guī)定了轉(zhuǎn)基因食品是必須加貼標(biāo)簽或禁止進(jìn)口，因此，對(duì)食用油脂進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)，顯得尤為重要。如何鑒別食用油脂是否為轉(zhuǎn)基因食品，除了檢測(cè)原料以外，更多的是需要從成品食用油中直接進(jìn)行檢測(cè)。
[0003]花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子是最常使用的組成型啟動(dòng)子，它具有多種順式作用元件，能在多種植物物種的幾乎所有發(fā)育階段和所有組織中高效表達(dá)，被廣泛用于轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建。在目前市面上常見的玉米、棉花、大豆、等轉(zhuǎn)基因植物中，約有85% — 90%的轉(zhuǎn)基因植物使用了該啟動(dòng)子。雖然目前CaMV35S啟動(dòng)子存在多個(gè)版本，但其保守序列相對(duì)穩(wěn)定，是轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的最佳靶基因之一。而從食用油脂中提取出可用于核酸檢測(cè)的DNA，是進(jìn)行檢驗(yàn)的關(guān)鍵。但是食用油的DNA提取仍是國(guó)內(nèi)外的難題之一，由于食用油生產(chǎn)加工過程中經(jīng)過高溫和高壓等處理過程，產(chǎn)品中的DNA遭到嚴(yán)重破壞，降解為長(zhǎng)度較短，大小不一的片段，而且受到物理、化學(xué)和生物等因素的影響，DNA的質(zhì)量也大大降低。目前，國(guó)內(nèi)外仍沒有一個(gè)比較穩(wěn)定的食用油DNA提取方法或試劑盒。本研究建立一種可從食用油中穩(wěn)定提取核酸的方法，并建立一種恒溫檢測(cè)CaMV35S啟動(dòng)子的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種快速檢測(cè)食用油中轉(zhuǎn)基因成分CaMV35S的恒溫檢測(cè)方法。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種用于檢測(cè)食用油中轉(zhuǎn)基因成分CaMV35S的LAMP試劑盒。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種用于檢測(cè)食用油中轉(zhuǎn)基因成分CaMV35S的LAMP引物組。
[0007]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種食用油中轉(zhuǎn)基因成分CaMV35S的恒溫檢測(cè)方法，包括如下步驟:
I)根據(jù)CaMV35S啟動(dòng)子基因序列設(shè)計(jì)特異性恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物；2)提取待檢樣品DNA；
3)待檢樣品DNA在上述引物、ifeiDNA聚合酶存在的條件下進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；
4)根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判斷待檢樣品中是否存在CaMV35S轉(zhuǎn)基因成分。
[0008]所述恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物的序列分別如下所示:
35S- F3:GGTGGCTCCTACAAATGC (SEQ ID N0:1),
35S- B3:GTCTTGCGAAGGATAGTGG (SEQ ID NO:2),
35S-FIP:GTCCATCTTTGGGACCACTGTCCATCATTGCGATAAAGGAAAGG (SEQ ID NO:3),
35S-BIP: CACGAGGAGCATCGTGGAAACGTCAGTGGAGATATCACATC (SEQ ID NO:4)，
35S-FLP:AGAGGCATCTTCAACGATGG (SEQ ID NO:5),
35S-BLP:AGAAGACGTTCCAACCACG (SEQ ID NO:6)。
[0009]作為優(yōu)選的，步驟2)提取待檢樣品DNA的具體步驟為:
1)取一定樣品油，加入I~3倍體積的正己烷和0.1~0.3倍體積的TE，20~25°C環(huán)境條件下，混合均勻；
2)靜置分層后，去除上 層油相；
3)將下層的TE水相轉(zhuǎn)移到離心管；依次加入I~2Pg鮭魚精DNA，0.5~0.7倍體積預(yù)冷的異丙醇，0.1~0.2倍體積的3 mol/L的乙酸鈉；輕輕來回顛倒混勻后置于一 20°C以下沉淀DNA ；
4)沉淀過夜后離心，棄上清液，用預(yù)冷的65~75%的乙醇洗滌沉淀，轉(zhuǎn)移到離心管，離
心；
5)空干DNA，加入TE溶解DNA，置于一20°C以下保存。
[0010]作為優(yōu)選的，步驟3)所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的體系為:25 UL LAMP反應(yīng)體系含有1.6μ mol/L 35S-FIPU.6 μ mol/L 35S_BIP、0.2 μ mol/L 35S_F3、0.2 μ mol/L 35S_B3、0.8μ mol/L 35S-FLP、0.8 μ mol/L 35S_BLP、1 mol/L 甜菜堿、8 mmol/L MgS04、8 U Bst DNA聚合酶、1.6 mmol/L dNTP、2.5 μ L IOXThermo pol Buffer 及待測(cè) DNA 模板 2 μ L。
[0011]作為優(yōu)選的，步驟3)所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)?60~65 °C恒溫反應(yīng)45~60mino
[0012]作為優(yōu)選的，步驟4)可根據(jù)恒溫?zé)晒夥ㄅ袛鄼z測(cè)結(jié)果，在反應(yīng)體系中加入2-20μ M SYT0-9，使用熒光PCR儀(如ΑΒΙ7500)或其它恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀(Genie II )進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增曲線判斷結(jié)果，有“s”型擴(kuò)增曲線的為陽性，無“s”型擴(kuò)增曲線的為陰性。
[0013]一種用于檢測(cè)食用油中轉(zhuǎn)基因成分CaMV35S的試劑盒，其包括6條根據(jù)CaMV35S啟動(dòng)子基因序列設(shè)計(jì)的特異性恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物。
[0014]所述恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物的序列分別如下所示:
35S- F3:GGTGGCTCCTACAAATGC (SEQ ID N0:1),
35S- B3:GTCTTGCGAAGGATAGTGG (SEQ ID NO:2),
35S-FIP:GTCCATCTTTGGGACCACTGTCCATCATTGCGATAAAGGAAAGG (SEQ ID NO:3),
35S-BIP: CACGAGGAGCATCGTGGAAACGTCAGTGGAGATATCACATC (SEQ ID NO:4)，
35S-FLP:AGAGGCATCTTCAACGATGG (SEQ ID NO:5),
35S-BLP:AGAAGACGTTCCAACCACG (SEQ ID NO:6)。
[0015]所述試劑盒中還包括以下組分:1fei DNA聚合酶、MgSO4、甜菜堿、dNTP、10XThermopol Buffer、SYT0_9、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽性對(duì)照為含有CaMV35S啟動(dòng)子基因序列的重組質(zhì)粒,所述陰性對(duì)照品為ddH20。
[0016]一種用于檢測(cè)食用油中轉(zhuǎn)基因成分CaMV35S的引物組，其序列分別如下所示:
【權(quán)利要求】
1.一種食用油中轉(zhuǎn)基因成分CaMV35S的恒溫檢測(cè)方法，包括如下步驟: 1)根據(jù)CaMV35S啟動(dòng)子基因序列設(shè)計(jì)特異性恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物； 2)提取待檢樣品DNA； 3)待檢樣品DNA在上述引物、ifeiDNA聚合酶存在的條件下進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)； 4)根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判斷待檢樣品中是否存在CaMV35S轉(zhuǎn)基因成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物的序列分別如下所示:
35S- F3:GGTGGCTCCTACAAATGC (SEQ ID N0:1),
35S- B3:GTCTTGCGAAGGATAGTGG (SEQ ID NO:2),
35S-FIP:GTCCATCTTTGGGACCACTGTCCATCATTGCGATAAAGGAAAGG (SEQ ID NO:3),
35S-BIP: CACGAGGAGCATCGTGGAAACGTCAGTGGAGATATCACATC (SEQ ID NO:4)，
35S-FLP:AGAGGCATCTTCAACGATGG (SEQ ID NO:5),
35S-BLP:AGAAGACGTTCCAACCACG (SEQ ID NO:6)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)提取待檢樣品DNA的具體步驟為: 1)取一定樣品油，加入I~3倍體積的正己烷和0.1~0.3倍體積的TE，20~25°C環(huán)境條件下，混合均勻； 2)靜置分層后，去除上層油相； 3)將下層的TE水相轉(zhuǎn)移到離心管；依次加入I~2Pg鮭魚精DNA，0.5~0.7倍體積預(yù)冷的異丙醇，0.1~0.2倍體積的3 mol/L的乙酸鈉；輕輕來回顛倒混勻后置于一 20°C以下沉淀DNA ； 4)沉淀過夜后離心，棄上清液，用預(yù)冷的65~75%的乙醇洗滌沉淀，轉(zhuǎn)移到離心管，離心； 5)空干DNA，加入TE溶解DNA，置于一20°C以下保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的體系為:25 μ L LAMP 反應(yīng)體系含有 1.6 μ mol/L 35S_FIP、1.6 μ mol/L 35S_BIP、0.2 μ mol/L35S-F3、0.2 μ mol/L 35S_B3、0.8 μ mol/L 35S_FLP、0.8 μ mol/L 35S_BLP、1 mol/L甜菜喊、8 mmol/L MgS04、8 U Bst DNA 聚合酶、1.6 mmol/L dNTP、2.5 μ L 10 X Thermo polBuffer及待測(cè)DNA模板2 μ L0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)?60~65 °C恒溫反應(yīng)45~60min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟4)可根據(jù)恒溫?zé)晒夥ㄅ袛鄼z測(cè)結(jié)果，在反應(yīng)體系中加入2-20 μ M SYT0-9，使用熒光PCR儀(如ΑΒΙ7500)或其它恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀(Genie II )進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增曲線判斷結(jié)果，有“s”型擴(kuò)增曲線的為陽性，無“s”型擴(kuò)增曲線的為陰性。
7.一種用于檢測(cè)食用油中轉(zhuǎn)基因成分CaMV35S的試劑盒，其包括6條根據(jù)CaMV35S啟動(dòng)子基因序列設(shè)計(jì)的特異性恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物的序列分別如下所示:
35S- F3:GGTGGCTCCTACAAATGC (SEQ ID N0:1),
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括以下組分'BstDNA聚合酶、MgSO4、甜菜堿、dNTP、10 X Thermo pol Buffer、SYT0-9、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽性對(duì)照為含有CaMV35S啟動(dòng)子基因序列的重組質(zhì)粒，所述陰性對(duì)照品為ddH20。
10.一種用于檢測(cè)食用油中轉(zhuǎn)基因成分CaMV35S的引物組，其序列分別如下所示:
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103614476SQ201310610888
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月25日
【發(fā)明者】石磊, 唐大運(yùn), 張璜, 劉美賢, 范耀森, 駱康杰, 葉蕾 申請(qǐng)人:廣州迪澳生物科技有限公司