一種中國西門塔爾牛胴體和肉質(zhì)性狀遺傳標記的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種中國西門塔爾牛胴體和肉質(zhì)性狀遺傳標記的檢測方法，利用DNA池測序和PCR-RFLP技術(shù)篩查和檢測中國西門塔爾牛GPAM基因功能突變的方法。通過關(guān)聯(lián)分析尋找與中國西門塔爾牛胴體組成和肉質(zhì)性狀相關(guān)的SNPs作為分子遺傳標記，應(yīng)用于肉牛早期選擇和分子聚合育種，進一步加快中國西門塔爾牛肉用性能的選育和提高。
【專利說明】一種中國西門塔爾牛胴體和肉質(zhì)性狀遺傳標記的檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開一種中國西門塔爾牛胴體和肉質(zhì)性狀遺傳標記的檢測方法，屬于家養(yǎng) 肉食動物基因工程檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 中國西門塔爾牛我國于20世紀五十年代引進后自主培育的大型乳肉役兼用品 種，因具有體質(zhì)強健，適應(yīng)性強，乳、肉、役性能俱佳等優(yōu)點，而成為國內(nèi)飼養(yǎng)最多，分布最廣 泛的品種，是目前我國肉牛產(chǎn)業(yè)中的主導品種。隨著國內(nèi)外市場的變化及消費者對牛肉需 求程度的提高，中國西門塔爾牛肉用性能進一步選育和提高成為該品種的主要目標。要提 高肉用性能就必須采用常規(guī)育種技術(shù)和分子育種方法從生長發(fā)育性狀、胴體組成和肉質(zhì)性 狀方面進行選育。
[0003] 根據(jù)生產(chǎn)性狀的表型值估計育種值進行肉牛的選種和培育，已經(jīng)極大促進了肉牛 生長發(fā)育和肉質(zhì)性狀的遺傳改良。上個世紀九十年代以來，隨著現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的飛 速發(fā)展，遺傳學家和育種學家認識到控制數(shù)量性狀的基因并非在基因組中隨機分布，且存 在影響數(shù)量性狀的主效基因。以分子標記為核心的分子標記輔助選擇和GWAS等分子育種 技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合大大加速了肉牛育種的進程。目前篩查對目標性狀具有較大作 用的主效基因及其與之緊密連鎖的分子標記成為肉牛分子育種的基礎(chǔ)和前提，也是將來肉 牛分子生物學領(lǐng)域研究的重點。
[0004] 線粒體甘油 _3_憐酸醜基轉(zhuǎn)移酶基因（glycerol-3-phosphate acyltransferase, mitochondrial, GPAM)編碼一個由828個氨基酸組成的位于線粒體外膜的多通道膜蛋白， 在動物機體代謝過程中催化甘油三酯（TAG)和磷脂生物合成的第一步反應(yīng)，而甘油三酯對 于哺乳動物的脂肪沉積，能量消耗，乳脂，胴體重以及整體的代謝都調(diào)控作用。另外，GPAM還 通過去磷酸化作用調(diào)控磷酸形成。但是目前關(guān)于GPAM基因與牛生長發(fā)育、胴體組成和脂肪 沉積性狀相關(guān)性的研究尚未有報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于并提供一種中國西門塔爾牛胴體和肉質(zhì)性狀遺傳標記的檢測 方法， 本發(fā)明提供的一種中國西門塔爾牛胴體和肉質(zhì)性狀遺傳標記的檢測方法，是通過以下 技術(shù)方案來實現(xiàn)： 利用DNA池測序和PCR-RFLP技術(shù)篩查和檢測中國西門塔爾牛GPAM基因功能突變的的 方法。通過關(guān)聯(lián)分析尋找與中國西門塔爾牛胴體組成和肉質(zhì)性狀相關(guān)的SNPs作為分子遺 傳標記，應(yīng)用于肉牛早期選擇和分子聚合育種，進一步加快中國西門塔爾牛肉用性能的選 育和提商。
[0006] 本發(fā)明提供一種檢測中國西門塔爾牛胴體和肉質(zhì)性狀的遺傳標記，其特征在于： 核昔酸序列如序列表Seq ID N0. 3和Seq ID N0. 6所不，在序列表Seq ID N0. 3第197 bp處有197T-197C的突變，導致Avr- II -RFLP多態(tài)性；在序列表Seq ID NO. 6第299處有 299A-299G的突變，導致Aci- I -RFLP多態(tài)性。
[0007] 本發(fā)明公開的中國西門塔爾牛胴體和肉質(zhì)性狀遺傳標記的檢測方法，其特征在 于， 設(shè)計擴增如權(quán)利要求1所述的中國西門塔爾牛GPAM基因遺傳標記的引物對，得到的 引物序列如下所示： P1 正向引物 F:5' GAAGGAAGTAGCGTGAGGTGTG 3'， P1 反向引物 R:5' TGCTGGGTTAATACAGGCTTGG 3' ； P2 正向引物 F :5' GCAACAGAGGCACATCTGCATCGT 3'， P2 反向引物 R:5' GCCAGATGCCAAGTCTCAAGTTCCT 3' ； 用所示的特異性引物在中國西門塔爾?；蚪M中進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物純化、克隆測 序，獲得如序列表SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 6所示的核苷酸序列，其中分別包括GPAM基 因 2823 T>C和3386 A>G的單核苷酸堿基突變，并且利用PCR-RFLP方法對中國西門塔爾牛 群體中GPAM基因 2個SNPs進行了檢測。
[0008] 本發(fā)明所述中國西門塔爾牛胴體和肉質(zhì)性狀遺傳標記的檢測方法，其特征在于， 所述的PCR擴增條件是：25 μ L反應(yīng)體系，包括DNA模板（50 ng/μ L) 1 μ L、上下游 引物（10 μπιοΙ/L)各 1 yL、dNTPs(2mmol/L)2.5 yL、TaqDNA 聚合酶（5U/yL)0.3 μ L、Mg2+ (25 mmol/L) 1· 5 μ L、10XPCR 緩沖液 2. 5 μ L、超純水 15. 2 μ L ;所述的 PCR 擴增反應(yīng)程序為：95°C變性 5 min，95°C變性 30 s，58°C (P1)、62°C (P2)退火 30 s，72°C延 伸30 s，進行30個循環(huán)，最后72°C延伸10 min。
[0009] 本發(fā)明所述中國西門塔爾牛胴體和肉質(zhì)性狀遺傳標記的檢測方法，其特征在于： 檢測中國西門塔爾牛群體遺傳標記的限制性內(nèi)切酶為：SNP1 (E20-2823 T>C)為 Avr- II內(nèi)切酶，在功能區(qū)域識別序列為C/CTAGG;SNP2 (E20-3386 A>G)為Aci- I內(nèi)切酶， 在功能區(qū)域識別序列為C/CGC。
[0010] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下的積極效果： 本發(fā)明把DNA池測序篩查SNP與PCR-RFLP結(jié)合起來解決了 SSCP的繁瑣和不穩(wěn)定性， 提供了一種簡單、快速、低成本、精確度高、便于在DNA水平上篩查和檢測與中國西門塔爾 牛肉用性狀密切相關(guān)的GPAM等基因的遺傳標記，可用于肉牛的分子聚合育種。
[0011] 本發(fā)明篩查獲得中國西門塔爾牛群體中GPAM基因 2個SNPs位點不同基因型個體 與部分胴體組成和肉質(zhì)性狀間顯著相關(guān)，可用于肉牛的早期輔助選擇和分子聚合育種。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1為中國西門塔爾牛GPAM基因第20外顯子P1弓丨物對PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。
[0013] 圖2為中國西門塔爾牛GPAM基因第20外顯子P2弓丨物對PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。
[0014] 圖3為中國西門塔爾牛GPAM基因第2823位T>C突變位點測序和Avr- II酶切圖。
[0015] 圖4為中國西門塔爾牛GPAM基因第3386位A>G突變位點測序和Aci- I酶切圖。

【具體實施方式】
[0016] 通過以下實施例進一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離 本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實現(xiàn)的任何改 動或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
[0017] 實施例1 牛GPAM基因片段的獲得及功能區(qū)域多態(tài)性檢測方法的建立。
[0018] 1. 1試驗材料：245頭34月齡中國西門塔公牛來自內(nèi)蒙古通遼市寶龍山肉牛育肥 場。頸靜脈采血，所采血樣均為10 mL/頭，用A⑶抗凝劑抗凝，-20°c凍存。用基因組DNA 提取試劑盒從血樣中提取基因組DNA。
[0019] 1.2弓丨物設(shè)計及PCR擴增：選擇中國西門塔爾牛為試驗材料，根據(jù)牛GPAM基因序 列設(shè)計以下2對引物： P1 正向引物 F:5' GAAGGAAGTAGCGTGAGGTGTG 3'， P1 反向引物 R:5' TGCTGGGTTAATACAGGCTTGG 3' ； P2 正向引物 F:5' GCAACAGAGGCACATCTGCATCGT， P2 反向引物 R :5' GCCAGATGCCAAGTCTCAAGTTCCT。
[0020] 用上述引物對在中國西門塔爾?；蚪M中進行PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)為25 μ L 體系，包括：上、下游引物（10 ymol/L)l yL;dNTPs (2 mmol/L)2.5 yL;Taq DNA 聚合 酶（5U/yL)0.3 yL;DNA 模板（50ng/yL)l yL;Mg2+(25mmol/L)1.5 yL;10XPCR 緩沖液2. 5 yL;超純水15. 2 yL。PCR擴增反應(yīng)程序：95°C變性5 min;95°C變性30 s， 58°C (P1)、62°C (P2)退火 30 s，72°C延伸 30 s，進行 30 個循環(huán)；最后 72°C延伸 10 min。
[0021] PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后獲得目的基因片段P1和P2 (圖1和圖2 所示)。凝膠回收純化目的基因片段，PMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化DH5 α，菌液PCR檢測后，陽性 克隆進行測序和系列比對分析。GPAM基因功能區(qū)域存在2個突變位點：2823 T>C和3386 A>G，堿基突變引起Avr- II和Aci- I酶切位點多態(tài)。
[0022] 1.3 PCR-RFLP檢測：每個樣本取4 yL PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶(Avr- II和 Aci- I)進行酶切，以檢測中國西門塔爾牛群體多態(tài)性。酶切反應(yīng)總體積為10 yL，其中 RNaseFree 水 3.5 yL，內(nèi)切酶（10u/yL) 0.5 yL，10Xbuffer2 yL，37°C恒溫條件下 酶切4 h，經(jīng)3. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄酶切分型結(jié)果。
[0023] 酶切圖譜如圖3和圖4所示，對于SNP (E20-2823 T>C)和（E20-3386 A>G)均顯 示3種基因型：SNP(E20-2823 T>C)僅有 330 bp目的片段的樣本不含AVr-II酶切位點， 命名為TT型；含有197 bp和133 bp兩條帶的為含有Avr- II酶切位點的純合型，命名為 CC型；同時含有330 bp、197 bp和133 bp三條帶的為雜合型樣本，命名為TC型。TT和 CC相比在外顯子20編碼區(qū)的2823 bp處有一個T>C的突變。當E20-2823 bp處為C時， Avr- II酶切產(chǎn)生197 bp和133 bp的片段；當E20-2823 bp處為T時，無 Avr- II酶切位 點。
[0024] SNP (E20-3386 A>G)僅有380 bp目的片段的樣本不含Aci- I酶切位點，命名為 AA型；含有299 bp和81 bp的為含有Aci- I酶切位點的純合型（81 bp片段較小，電泳時 跑出凝膠)，命名為GG型；同時含有380 bp、299和81 bp三條帶的為雜合型樣本，命名為 AG型。AA和GG相比在外顯子20編碼區(qū)的3386 bp處有一個A>G的突變。當E20-3386 bp 處為G時，Aci- I酶切產(chǎn)生299 bp和81 bp的片段；當E20-3386 bp處為A時，無 Aci- I 酶切位點。
[0025] 實施例2 篩查獲得的遺傳標記在中國西門塔爾牛群體中的多態(tài)性分布檢測。
[0026] 在中國西門塔爾牛群體中檢測GPAM基因第20外顯子PCR-Avr- II -RFLP和PCR-Aci- I -RFLP多態(tài)性分布頻率。檢測結(jié)果顯示，SNP1 (E20-2823 T>C)為同義突變，突變前 后的密碼子CTA和TTA均編碼亮氨酸，該SNP的三種基因型中，雜合子TC個體所占比例較 高，等位基因 T和C的在群體中的頻率分布差異不顯著。SNP2 (E20-3386 A>G)為錯義突 變，編碼精氨酸的密碼子CGC突變后成為編碼組氨酸的密碼子CAC，該位點的A>G突變導致 氨基酸發(fā)生變化，可能對GPAM蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能有一定影響作用。該SNP的三種基因型 中野生型AA基因型個體最少，突變純合個體GG基因型個體分布最多，在群體中占優(yōu)勢，為 0. 65 ;等位基因 G頻率為0.80,為優(yōu)勢基因(表1)。
[0027] 表1.中國西門塔爾牛群體GPAM基因外顯子區(qū)T 2823 C和A 3386 G突變位點基 因頻率及基因型頻率。

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測中國西門塔爾牛胴體和肉質(zhì)性狀的遺傳標記，其特征在于： 核昔酸序列如序列表Seq ID NO. 3和Seq ID NO. 6所不，在序列表Seq ID NO. 3第197 bp處有197T-197C的突變，導致Avr- II -RFLP多態(tài)性；在序列表Seq ID NO. 6第299處有 299A-299G的突變，導致Aci- I -RFLP多態(tài)性。
2. -種中國西門塔爾牛胴體和肉質(zhì)性狀遺傳標記的檢測方法，其特征在于， 設(shè)計擴增如權(quán)利要求1所述的中國西門塔爾牛GPAM基因遺傳標記的引物對，得到的 引物序列如下所示： P1 正向引物 F :5' GAAGGAAGTAGCGTGAGGTGTG 3'， P1 反向引物 R:5' TGCTGGGTTAATACAGGCTTGG 3' ； P2 正向引物 F :5' GCAACAGAGGCACATCTGCATCGT 3'， P2 反向引物 R :5' GCCAGATGCCAAGTCTCAAGTTCCT 3'。
3. -種中國西門塔爾牛胴體和肉質(zhì)性狀遺傳標記的檢測方法，其特征在于： 從中國西門塔爾牛血液中提取基因組DNA，根據(jù)中國西門塔爾牛GPAM基因序列設(shè)計引 物，得到的引物序列如權(quán)利要求2所述； 用所示的特異性引物在中國西門塔爾?；蚪M中進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物純化、克隆測 序，獲得如序列表SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列，其中分別包括GPAM基 因2823 T>C和3386 A>G的單核苷酸堿基突變，并且利用PCR-RFLP方法對中國西門塔爾牛 群體中GPAM基因2個SNPs進行了檢測。
4. 如權(quán)利要求2所述中國西門塔爾牛胴體和肉質(zhì)性狀遺傳標記的檢測方法，其特征在 于： 所述的PCR擴增條件是：25 μ L反應(yīng)體系，包括DNA模板（50 ng/μ L) 1 μ L、上下游 引物（10 μπιοΙ/L)各 1 yL、dNTPs(2mmol/L)2.5 yL、TaqDNA 聚合酶（5U/yL)0.3 μ L、Mg2+ (25 mmol/L) 1· 5 μ L、10XPCR 緩沖液 2. 5 μ L、超純水 15. 2 μ L ;所述的 PCR 擴增反應(yīng)程序為：95°C變性 5 min，95°C變性 30 s，58°C (P1)、62°C (P2)退火 30 s，72°C延 伸30 s，進行30個循環(huán)，最后72°C延伸10 min。
5. 如權(quán)利要求2所述中國西門塔爾牛胴體和肉質(zhì)性狀遺傳標記的檢測方法，其特征在 于： 檢測中國西門塔爾牛群體遺傳標記的限制性內(nèi)切酶為：SNP1 (E20-2823 T>C)為 Avr- II內(nèi)切酶，在功能區(qū)域識別序列為C/CTAGG;SNP2 (E20-3386 A>G)為Aci- I內(nèi)切酶， 在功能區(qū)域識別序列為C/CGC。
【文檔編號】C12Q1/68GK104059963SQ201310621249
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】楊潤軍, 趙志輝, 于海濱, 孫博興, 蘆春艷, 張永宏, 沈冰蕾 申請人:吉林大學