一種利用浮萍為原料制備2,3-丁二醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用浮萍為原料制備2,3-丁二醇的方法，屬于環(huán)境生物技術(shù)和生物質(zhì)能源領(lǐng)域。本發(fā)明以水生植物浮萍為主要原料，采用液態(tài)發(fā)酵方法制備2,3-丁二醇。生產(chǎn)工藝包括：添加α-淀粉酶和糖化酶對(duì)浮萍懸液進(jìn)行糖化處理；向液體種子培養(yǎng)基中接種多黏芽孢桿菌，通過搖床震蕩培養(yǎng)獲得液態(tài)種子；向裝有預(yù)處理好的浮萍細(xì)胞液發(fā)酵罐中接種體積比為6-8%的液態(tài)種子，通過發(fā)酵得到液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明不僅解決了浮萍在污水凈化過程中因大量繁殖而可能導(dǎo)致的二次污染，而且也為2,3-丁二醇的生物煉制提供了可再生的原料來源。特別是該法作為非糧作物的2,3-丁二醇發(fā)酵的替代法，還可以有效緩解世界范圍內(nèi)糧食短缺的緊張局面。
【專利說明】—種利用浮萍為原料制備2, 3- 丁二醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用浮萍為原料制備2，3-丁二醇的方法，屬于環(huán)境生物技術(shù)和生物質(zhì)能源領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)今世界面臨資源短缺和環(huán)境污染兩大難題，發(fā)展低碳、環(huán)保的循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展模式已經(jīng)迫在眉睫，而生物制造產(chǎn)業(yè)已成為當(dāng)前發(fā)展低碳經(jīng)濟(jì)的重要途徑之一。2，3- 丁二醇作為一種重要的化工原料和液體燃料，廣泛應(yīng)用于化工、能源、食品以及航空航天等多個(gè)等領(lǐng)域，因此它已經(jīng)成為當(dāng)前生物制造產(chǎn)物發(fā)展的重要領(lǐng)域之一。就其自身而言，它是一種極具價(jià)值的液體燃料，因而常備用作航空燃料山-2，3- 丁二醇由于極低的凝固點(diǎn)而用作抗凍劑。作為合成前體，由它合成的化合物則具有更廣泛的功能，如雙乙酰是一種具有很高價(jià)值的風(fēng)味劑，3-羥基-2-丁酮(乙偶姻)是一種天然食用香料，二者廣泛應(yīng)用在食品工業(yè)中；1，3- 丁二烯則用于合成橡膠、合成樹脂的生產(chǎn)；甲乙酮不僅是一種高價(jià)值的液體燃料添加劑，而且也常用作低沸點(diǎn)溶劑，在粘結(jié)劑、涂料、燃料、潤(rùn)滑劑、油墨等行業(yè)應(yīng)用十分廣泛(戴建英，孫亞琴，孫麗慧，李丹，董悅生，修志龍.生物基化學(xué)品2，3-丁二醇的研究進(jìn)展.過程工程學(xué)報(bào)，2010，10(1):200-208.)。目前用于2，3-丁二醇生產(chǎn)的方法主要有化學(xué)法和生物發(fā)酵法兩大類，化學(xué)法采用的是石油化工路線，需高溫高壓，且工藝復(fù)雜、污染嚴(yán)重；相比而言，生物發(fā)酵法則可以彌補(bǔ)上述缺陷，特別是對(duì)于2，3-丁二醇的手性結(jié)構(gòu)特征，生物發(fā)酵法則具有化學(xué)法無法比擬的優(yōu)勢(shì)。而生物發(fā)酵法生產(chǎn)又常以淀粉、乳清和糖蜜為原料，需要指出的是后兩者的資源有限，而淀粉又將與我國(guó)糧食短供需的不足相矛盾，因此尋求廉價(jià)的非糧物質(zhì)發(fā)酵原料已經(jīng)成為制約該產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題，特別是關(guān)于利用浮萍為原料發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇的 研究還沒有報(bào)道。
[0003]浮萍是一種漂浮的單子葉水生植物，在全世界廣泛分布，常見于靜止或流動(dòng)性不大的水體及湖泊的港灣部分，共有4屬40個(gè)種，其中以蕪萍、紫背浮萍、稀脈浮萍、三叉浮萍、槐葉萍和滿江紅較為常見。浮萍不僅可以吸收污染水體中的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且其生長(zhǎng)速率高并可以耐受多種污水條件，因此該類植物是污水處理生態(tài)工程中重要的水生植物類群(張營(yíng)，郜煒，景逵，曲文杰，李崇.鳳眼蓮和浮萍對(duì)水中硝基苯的凈化及動(dòng)力學(xué)研究.遼寧大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，2013,40(1):92-96)。此外，浮萍的營(yíng)養(yǎng)成分也非常豐富，蛋白質(zhì)含量高，纖維含量低，淀粉含量因不同種而有很大變化，通常約25%左右(Klass DL.Duckweed Plants for ffaste-water Reuse and Biomass Production [M].Chicago:1nstitute of Gas Technology, 1993:423-432.)。如果種植條件適宜，其生產(chǎn)能力也非常可觀，每公頃每年大約能生產(chǎn)淀粉11.4t (趙昭，姚廣保，張藝瓊，趙玄.豬場(chǎng)污水中浮萍生物量和淀粉含量變化研究.四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012，49(3):693-698)。因此，它可以作為一種非常好的天然培養(yǎng)基，滿足微生物對(duì)碳源、氮源的需求，特別是它的再生能力很強(qiáng)，因此它是極好的2，3- 丁二醇非糧發(fā)酵的替代原料，目前以浮萍為原料制備燃料乙醇、生物柴油和丁醇的報(bào)道較多，但是利用它為原料發(fā)酵產(chǎn)2，3- 丁二醇的研究并未出現(xiàn)。
[0004]浮萍是一類可再生資源，它在凈化污水的同時(shí)，也為生物能源的煉制提供了豐富的原料，特別是浮萍在凈化污水后將大量繁殖，其巨大的數(shù)量如果不能及時(shí)處理，也將造成水體的二次污染，因此將浮萍的生物能源處理與污水治理耦合進(jìn)行，將會(huì)取長(zhǎng)補(bǔ)短，起到事半功倍的效果，因此該技術(shù)具有廣闊的發(fā)展前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種利用浮萍為原料制備2，3- 丁二醇的方法。
[0006]技術(shù)解決方案:
[0007]制備方法如下:
[0008]I)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備:采用下列原料，質(zhì)量體積比為:浮萍淀粉水解液總糖濃度80.0g/L,酵母膏 6.0g/L, (NH4)2HPO4L Og/L, KC10.2g/L, MgSO4 ? 7H200.3g/L, CaC033g/L,pH6.0，將上述培養(yǎng)基在115°C下，高壓滅菌30min備用；
[0009]2)發(fā)酵條件的設(shè)定:然后按6%_8%(V:V)的接種量接入液態(tài)種子，先在30°C、200r/min條件下發(fā)酵24h，接著在溫度不變的情況下調(diào)整轉(zhuǎn)速160r/min，發(fā)酵24h，以利于2，3- 丁二醇的合成，最后通過高效液相色譜檢測(cè)2，3 一丁二醇的含量。
[0010]本發(fā)明生產(chǎn)的2，3-丁二醇具有環(huán)境友好的特點(diǎn)，不僅解決了浮萍在污水凈化過程中因大量繁殖而可能導(dǎo)致的二次污染，而且也為2，3-丁二醇的生物煉制提供了可再生的原料來源。特別是該法作為非糧作物的2，3-丁二醇發(fā)酵的替代法，還可以有效緩解世界范圍內(nèi)糧食短缺的緊張局面。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012]浮萍淀粉水解液的制備:將浮萍洗凈、干燥，然后粉碎過60目篩，利用無菌水按1:8的體積比例將其調(diào)制成懸濁液，然后向其中加入中溫a -淀粉酶和0.2%的CaCl2,于60°C液化數(shù)分鐘，期間用碘液檢測(cè)淀粉的降解效果，直至顏色由藍(lán)色變?yōu)樽爻壬珵橹埂＝又诜兴顟B(tài)下將過量的a-淀粉酶酶活滅活。
[0013]待其冷卻后，在pH值約為4.5的條件下再向其中加入糖化酶使其充分降解為單糖，多余的糖化酶再在沸水浴條件下滅活，最后利用3，5- 二硝基水楊酸法測(cè)定其還原糖的含量(具體方法參照陳毓荃主編.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)，北京:科學(xué)出版社，2002)。其原理是利用還原糖能在堿性條件下與二硝基水楊酸發(fā)生氧化還原反應(yīng)，而反應(yīng)終產(chǎn)物3-氨基-5-硝基水楊酸在沸水浴條件下呈現(xiàn)出棕紅色，且該產(chǎn)物顏色的深淺與還原糖的量成正比。
[0014]種子制備及培養(yǎng):發(fā)酵菌種選取多黏芽孢桿菌(Bacillus polymyxa),其原因主要是因?yàn)樵摼N不僅能夠利用多種還原糖碳源，特別是它還能夠分泌淀粉酶。利用液體種子培養(yǎng)基制備發(fā)酵所需液態(tài)種子。培養(yǎng)基(g/L)配制方法如下:取浮萍淀粉水解液還原糖濃度為 2.0，葡萄糖 3.0，酵母膏 5.0，(NH4) 2HP041.0，KC10.2，MgSO4 ? 7H200.3，pH6.0，用高壓滅菌鍋在115°C滅菌25-30min備用。接種方法是先用接種環(huán)將目的菌種接種到100ml液體種子培養(yǎng)基中，再用搖床在30°C、150r/min條件下培養(yǎng)24h即得到液態(tài)種子。
[0015]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)的制備:浮萍淀粉水解液總糖濃度80.0，酵母膏6.0，(NH4)2HPO4L 0，KC10.2，MgSO4 ? 7H200.3，CaC0s3, pH6.0。同樣，以上培養(yǎng)基在 115。。下，高壓滅菌30min備用。然后按5-10%(V:V)的接種量將入液態(tài)種子，先在30°C、200r/min條件下發(fā)酵24h，使其有利于種子的菌體生長(zhǎng)，接下來在溫度不變的情況下調(diào)整轉(zhuǎn)速160r/1^11，發(fā)酵2411，以利于2，3-丁二醇的合成(楊歡歡，高健，徐虹，邵榮.利用菊芋菊粉制備R，R-2，3-丁二醇發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化?食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(11):6-10)。從而提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量。
[0016]2，3-丁二醇的提取和定量分析:采用高效液相色譜法從發(fā)酵液中分離純化2，3-丁二醇。具體方法參照張媛麗的方法((張媛麗.菊芋發(fā)酵液中2，3—丁二醇的鹽析萃取.大連理工大學(xué)2011屆碩士畢業(yè)論文，16-25)。其工藝流程如下:先將發(fā)酵液在8000r/min的條件下離心20min，以去除發(fā)酵液中大量的殘?jiān)图?xì)小微粒，再用濾膜過濾，之后再將所得上清液經(jīng)高效液相色譜分離純化。鑒于檢測(cè)濃度的問題，所得上清液要進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋稊?shù)稀釋。色譜條件如下:玻璃管填充色譜柱，填料為ChromsorblOl, 5mmX 2m ;檢測(cè)器為FID，柱溫為170°C，汽化室的溫度為200°C，檢測(cè)器的溫度為220°C ;載氣為N2，流速50ml/min，樣品進(jìn)樣量為lul，采用外標(biāo)法測(cè)定產(chǎn)物的含量。
[0017]實(shí)施例1
[0018]用250ml的三角瓶進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積為60ml,其中各成分的質(zhì)量體積比例如下:浮萍淀粉水解液總糖濃度80.0g/L，酵母膏6.0g/L, (NH4)2HPO4L Og/L，KC10.2g/L，MgSO4 ? 7H200.3g/L，CaC033g/L, pH6.0。將上述培養(yǎng)基在 115°C下，高壓滅菌30min備用。然后按8%(V: V)的接種量將入液態(tài)種子，先在30°C、200r/min條件下發(fā)酵24h，接著在溫度不變的情況下調(diào)整轉(zhuǎn)速160r/min,發(fā)酵24h,以利于2，3- 丁二醇的合成,最后通過高效液相色譜檢測(cè)2，3 一丁二醇的含量。
[0019]實(shí)施例2
[0020]取8g浮萍粉(淀粉含量30%，蛋白質(zhì)含量15%)、3.6g酵母膏、6.0g(NH4)2HPO4U.2gKC1、1.8gMgS04 WH2OjPTv 48.4ml的蒸餾水，置于250ml的三角瓶中，用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至6.0，并向制備好的液體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量體積濃度為0.2%的CaCl2以保證酶解效果，然后分別用中溫a -淀粉酶和糖化酶使淀粉糖化，115°C滅菌30分鐘，最后向其中加入經(jīng)過干熱滅菌的，CaC034.8g，然后按6%(V:V)的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°CU60r/min條件下于發(fā)酵60h后，利用高效液相色譜檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物的類型并對(duì)其進(jìn)行定量。
【權(quán)利要求】
1.一種利用浮萍為原料制備2，3- 丁二醇的方法，其特征在于，I)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備:采用下列原料，質(zhì)量體積比為:浮萍淀粉水解液總糖濃度80.0g/L,酵母膏6.0g/L,(NH4)2HPO4L 0g/L，KC10.2g/L,MgSO4 *7H200.3g/L, CaC033g/L, pH6.0，將上述培養(yǎng)基在 115°C下，高壓滅菌30min備用；2)發(fā)酵條件的設(shè)定:然后按6%_8%(V:V)的接種量接入液態(tài)種子，先在30°C、200r/min條件下發(fā)酵24h，接著在溫度不變的情況下調(diào)整轉(zhuǎn)速160r/min，發(fā)酵24h，以利于2，3- 丁二醇的合成，最后通過高效液相色譜檢測(cè)2，3 一丁二醇的含量。
【文檔編號(hào)】C12R1/12GK103614419SQ201310627393
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】潘建剛, 蔡祿, 張艾艾, 高國(guó)日, 張金艷 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古科技大學(xué)