檢測豬瘟病毒的rt-lamp核酸試紙條試劑盒及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒及應(yīng)用。該試劑盒包含核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1～6所示的引物組和核酸檢測試紙條。該試劑盒的使用方法如下：首先配制RT-LAMP反應(yīng)體系，包含AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、1倍反應(yīng)緩沖液、鏈置換DNA聚合酶、dNTP混合物、甜菜堿、MgSO4、FIP引物、BIP引物、Probe雜交探針、LoopB引物、F3引物、B3引物以及待測樣品RNA；恒溫反應(yīng)所得產(chǎn)物用核酸檢測試紙條檢測后直接進(jìn)行判讀：陽性結(jié)果為出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位于檢測區(qū)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)。該試劑盒操作簡單、成本低廉，反應(yīng)結(jié)果易于觀察，特異性好，易于大范圍推廣應(yīng)用。
【專利說明】檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 [0002]豬痕(Classicalswine fever, CSF)是由豬痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)引起的一種高發(fā)病率和高死亡率的烈性傳染病，感染過程可分為急性、亞急性、慢性、遲發(fā)性等多種。CSF急性病例多見于流行初期，主要表現(xiàn)為突然發(fā)病，皮膚、粘膜發(fā)紺，全身痙攣；初便秘，后腹瀉。后期出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)，隨后麻痹，倒地死亡。毒力較低的CSFV 毒株可引起亞急性CSF或溫和性CSF，癥狀比較輕。妊娠母豬感染后出現(xiàn)“帶毒母豬綜合征”，發(fā)生流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎，新生仔豬死亡，耐過的豬終身帶毒。豬瘟在世界范圍內(nèi)流行，是動物衛(wèi)生組織要求申報的動物傳染病之一。
[0003]該病1833年首次出現(xiàn)于美國的俄亥俄洲，現(xiàn)在遍布全世界。發(fā)達(dá)國家通常采取撲殺政策防止和消滅豬瘟，澳大利亞、加拿大、愛爾蘭、新西蘭、瑞士和美國等國家都陸續(xù)宣布消滅了豬瘟，但近年來歐洲一些已消滅豬瘟的國家又出現(xiàn)有豬瘟的報道。在我國，豬瘟流行呈現(xiàn)典型和非典型共存、持續(xù)感染與隱性感染共存、免疫耐受和帶毒綜合征共存等現(xiàn)象。我國自50年代中期以來，一直使用CSF兔化弱毒疫苗免疫控制CSF的大規(guī)模爆發(fā)流行。但是近半個世紀(jì)以來，CSF在我國仍屢禁不止，對畜產(chǎn)品造成的損失是無可估量的。
[0004]CSFV為黃病毒科(Flaviviridae)痕病毒屬(Pestivirus)成員，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組大小約1.23父1041*，僅含有一個大的開放讀碼框架(01^)。整個ORF 編碼一個由3898個氨基酸殘基組成的多聚蛋白，此多聚蛋白經(jīng)病毒#?蛋白和細(xì)胞的蛋白酶裂解，形成4個結(jié)構(gòu)蛋白(C、E0、El、E2)以及至少7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NpM、P7、NS2、NS3、 NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。結(jié)構(gòu)蛋白組裝成熟的病毒粒子與病毒的感染和誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)有密切關(guān)系，而非結(jié)構(gòu)蛋白則對病毒基因組復(fù)制、病毒粒子的組裝成熟起調(diào)控作用。
[0005]目前常用于檢測豬瘟病毒的方法包括病原的分離鑒定、血清學(xué)方法和RT-PCR、熒光定量PCR。病原的分離鑒定是最傳統(tǒng)的檢測方法，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但其影響因素多，實(shí)際操作起來相當(dāng)費(fèi)時費(fèi)力，因此在臨床應(yīng)用中有一定的局限性；血凝抑制試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗、中和試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗等血清學(xué)試驗的敏感性及特異性較低，操作也比較復(fù)雜； 而RT-PCR、熒光定量PCR技術(shù)需要特殊的儀器設(shè)備(如PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)等)和專業(yè)人員進(jìn)行相關(guān)的操作，對于在基層和現(xiàn)場檢測有局限性。因此建立一種快速，敏感，特異的檢測豬瘟病毒的方法是十分必要的。
[0006]日本學(xué)者Notomi等(2000)建立了一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP),其原理是在具有鏈置換活性的 Bst DNA聚合酶作用下，利用能識別目的基因上6個獨(dú)立區(qū)段的4條引物，即正向內(nèi)側(cè)引物 (Forward inner primer, FIP)、正向外側(cè)引物(Forward outer primer, F3)、反向內(nèi)側(cè)引物 (Backward inner primer, BIP)、反向外側(cè)引物(Backward outer primer, B3),在60 ~65°C等溫條件下高效特異地擴(kuò)增目的基因，終產(chǎn)物是具有與目的基因反相重復(fù)序列的莖環(huán)DNA。 Hong TC 等人(Development and evaluation of a novel loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus.ClinMicrobiol, 2004May ；42 (5): 1956-61)于 2004 年根據(jù) LAMP 原理設(shè)計了 實(shí)時定量RT-LAMP方法，以快速檢測SARS-Cov，結(jié)果RT-LAMP的靈敏度是RT-PCR的100 倍；Masaki Imai 等人(Rapid diagnosis of H5Nlavian influenza virus infection by newly developed influenza H5hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method.Virol Methods.2007May;141(2):173-80.)于2007年建立了快速診斷H5N1禽流感病毒的RT-LAMP檢測體系。實(shí)現(xiàn)了一步法檢測病毒RNA的方法，大大節(jié)省了檢測時間。反應(yīng)結(jié)果可通過肉眼觀察，或者通過濁度儀檢測反應(yīng)過程中獲得的副產(chǎn)品焦磷酸鎂所形成的白色沉淀的混濁度來判定，但是濁度儀造價比較昂貴且不方便攜帶。有學(xué)者利用往反應(yīng)后的體系中加入SYBR Green I染料的方法來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，但是這樣觀察又必需開蓋處理，LAMP擴(kuò)增的高效性及高敏感性使得產(chǎn)物中含有大量目的片段， 開蓋添加染料極其容易污染環(huán)境。故又發(fā)明了在反應(yīng)管中加入熒光染色試劑，在紫外燈下觀察，對反應(yīng)產(chǎn)物實(shí)時監(jiān)測，實(shí)現(xiàn)了可視化LAMP，但此方法對弱陽性的判斷不夠準(zhǔn)確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種檢測豬瘟病毒的 RT-LAMP核酸試紙條試劑盒。該試劑盒具有高靈敏度、高特異性、可視化的、操作方法簡單等優(yōu)點(diǎn)。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供實(shí)現(xiàn)上述檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，包含如下引物組和核酸檢測試紙條:
[0010]所述的引物組的核苷酸序列如下所示:
[0011]F3:5，-GGAAAGGGCAAAGAGGCA-3’ ；
[0012]B3:5’ -CGAGAGCCCTTTCTGTGATC-3’ ；
[0013]FIP:5’ -CCTCGCAGAAGGCGTAAACCAT-GTGGACAACCTGACACAAGC-3’ ；
[0014]BIP:5，-ACGGGAGTACCCTACAAGAGCT-AACCATCATCCCCGCACA-3，；
[0015]LoopB:5，-FITC-GACAGGGTGGCAAAAATTCATG-3，；
[0016]Probe:5’ -CCACGGGAGTACCCTACAAGAG-Biotin-3’ ；
[0017]所述的核酸檢測試紙條為通用型核酸檢測試紙條；
[0018]所述的檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒優(yōu)選包含上述引物組和全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置；
[0019]所述的全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置為杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；該檢測裝置為將通用型核酸檢測試紙條置入一個掌上塑料檢測裝置內(nèi)得到；
[0020]所述的檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，還包含dNTP混合物溶液、 MgSO4溶液、反應(yīng)緩沖液、鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)、甜菜堿(Betaine)溶液和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶；[0021]所述的試劑盒更優(yōu)選為包含濃度為5U/ii L的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、10倍反應(yīng)緩沖液 (10XThermoPol Reaction Buffer)、濃度為 8U/L 的鏈置換 DNA 聚合酶、濃度為 2.SmmoI / L的dNTP混合物溶液、濃度為lOmol/L的甜菜堿溶液、濃度為lOOmmol/L的MgSO4溶液、濃度為IOii mol/L的引物FIP、濃度為IOii mol/L的引物BIP、濃度為IOy mol/L的引物F3、 濃度為10 y mol/L的引物B3、濃度為IOii mol/L的探針Probe和濃度為IOy mol/L的引物 LoopB ；
[0022]所述的檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，包含以下步驟:
[0023](I)配制RT-LAMP反應(yīng)體系，按終濃度計算，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶為105U/L、10倍反應(yīng)緩沖液(10 X ThermoPol Reaction Buffer)為 I 倍(I X )、鏈置換 DNA 聚合酶為 0.32U/L、 dNTP混合物為0.4~0.6mmol/L、甜菜喊為I~2mol/L、MgS04為0~3mmol/L、FIP引物為
1.6u mol/L、BIP 引物為 1.6 ii mol/L、F3 引物為 0.2 y mol/L、B3 引物為 0.2 y mol/L、探針 Probe 為 1.2 ii mol/L、LoopB 引物為 1.2u mol/L,待測樣品 RNA 為 12ng/ u L ;恒溫反應(yīng)；
[0024](2)反應(yīng):將步驟(1)恒溫反應(yīng)后的產(chǎn)物用核酸檢測試紙條檢測，IOmin觀察結(jié)果；
[0025](3)結(jié)果判讀:直接肉眼判讀
[0026]①陰性(一):僅在質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)一條紅色條帶，在檢測區(qū)(T)內(nèi)無紅色條帶出現(xiàn)， 證明所檢測的樣本沒有豬瘟病毒感染；
[0027]②陽性(+):出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位于檢測區(qū)(T)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)(C) 內(nèi)，證明所檢測的樣本為豬瘟病毒感染；
[0028]③無效:質(zhì)控區(qū)(C)和檢測區(qū)(T)內(nèi)均無紅色條帶出現(xiàn)，表明核酸試紙條失效。
[0029]步驟(1)中所述的dNTP混合物的終濃度優(yōu)選為0.5mmol/L ；
[0030]步驟(1)中所述的甜菜堿的終濃度優(yōu)選為1.5mol/L ；
[0031] 步驟(1)中所述的MgSO4的終濃度優(yōu)選為3mmol/L ；
[0032]步驟(2)中所述的恒溫反應(yīng)的時間優(yōu)選為30~60min ；
[0033]步驟(2)中所述的恒溫反應(yīng)的條件優(yōu)選為60°C反應(yīng)50min。
[0034]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0035](I) RT-LAMP核酸試紙條檢測方法成本低廉,利用Bst DNA polymerase在60°C實(shí)現(xiàn)等溫擴(kuò)增，不需要復(fù)雜且昂貴的PCR儀，因此，本發(fā)明提供的檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒使用成本低。
[0036](2)本發(fā)明所提供的檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒反應(yīng)迅速，利用 AMV反轉(zhuǎn)錄酶實(shí)現(xiàn)一步法RT-LAMP，無需增加42°C Ih的反轉(zhuǎn)錄過程，可以在60min內(nèi)完成反應(yīng)，最快可以在30min內(nèi)完成。
[0037](3)本發(fā)明提供的檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒得到的反應(yīng)結(jié)果易于觀察，雖然LAMP在DNA擴(kuò)增過程中產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀使反應(yīng)液呈現(xiàn)渾濁，在反應(yīng)結(jié)束后無需瓊脂糖凝膠電泳即可直接肉眼觀察反應(yīng)管中渾濁來判斷陽性與否，但弱陽性結(jié)果仍給判別帶來較大困難。如果在環(huán)引物5’端進(jìn)行特異性生物標(biāo)記，對探針3’端進(jìn)行特異性標(biāo)記，探針與反應(yīng)產(chǎn)物雜交。然后再用核酸檢測試紙條對產(chǎn)物進(jìn)行檢測，既可以準(zhǔn)確對結(jié)果進(jìn)行快速判讀，又可以防止污染。
[0038](4)本發(fā)明提供的檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒特異性好，對豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒2型等都呈陰性反應(yīng)；靈敏度高，最低可以檢測到30pg的RNA模板，與RT-LAMP瓊脂糖凝膠電泳和鈣黃綠素可視化RT-LAMP方法的檢測限一致，比普通RT-PCR方法的靈敏度高10倍(即檢測限低10倍)。即使是幾個病毒粒子，也能被快速準(zhǔn)確的檢測出來。
[0039](5)本發(fā)明所述的檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒可快速、靈敏地檢測豬瘟病毒，無需昂貴儀器，只需一個恒溫水浴鍋即可完成反應(yīng)。操作簡單、成本低廉，反應(yīng)結(jié)果易于觀察，特異性好，非常適用于出口檢疫、食品衛(wèi)生以及畜牧養(yǎng)殖場的現(xiàn)場檢測，易于大范圍推廣應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1為RT-LAMP反應(yīng)檢測體系優(yōu)化結(jié)果圖，其中:
[0041]A為dNTP不同終濃度與電泳亮度關(guān)系圖，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道I~ 6依次對應(yīng)dNTP終濃度分別為0.lmM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM和0.6mM得到的反應(yīng)產(chǎn)物；
[0042]B為甜菜堿不同終濃度與電泳亮度關(guān)系圖，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道I~ 5依次對應(yīng)甜菜堿終濃度分別為0M、0.5M、1.0M、1.5M和2M得到的反應(yīng)產(chǎn)物；
[0043]C為MgSO4F同終濃度與電泳亮度關(guān)系圖，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道I~ 5依次對應(yīng)MgSO4終濃度分別為OmM、lmM、2mM、3mM和4mM得到的反應(yīng)產(chǎn)物；
[0044]D為內(nèi)引物(FIP+BIP)與外引物(F3+B3)不同濃度比例與電泳亮度關(guān)系圖，泳道M 為DNA Marker DL2000，泳道I~6依次對應(yīng)內(nèi)引物和外引物按終濃度比為2:1、4:1、6:1、 8:1、10:1和12:1得到的反應(yīng)產(chǎn)物，其中，外引物終濃度為0.2 ii mol/L ；
[0045]E為環(huán)引物(LoopF+LoopB )與外引物(F3+B3 )不同濃度比例與電泳亮度關(guān)系圖，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道I~6依次對應(yīng)環(huán)引物和外引物按終濃度比為0: 1、1: 1、 2:1、4:1、6:1、8:1得到的反應(yīng)產(chǎn)物，外引物終濃度為0.2 ii mol/L。
[0046]圖2為RT-LAMP反應(yīng)檢測條件優(yōu)化結(jié)果圖，其中:
[0047]A為不同溫度下RT-LAMP反應(yīng)的電泳亮度關(guān)系圖，泳道M為DNA Marker DL2000, 泳道I~8依次對應(yīng)反應(yīng)溫度為59°C、60°C、61°C、62°C、63°C、64°C、65°C和66°C的產(chǎn)物；
[0048]B為不同反應(yīng)時間下RT-LAMP反應(yīng)的電泳亮度關(guān)系圖，泳道M為DNAMarker DL2000,泳道 I ~I 依次對應(yīng)反應(yīng)時間為 10min、20min、30min、40min、50min、60min 和 70min
的產(chǎn)物。
[0049]圖3為檢測本發(fā)明試劑盒特異性的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖，其中:
[0050]泳道M為DNA Marker DL2000 ;泳道I是以CSFV疫苗株基因組為模板的RT-LAMP 反應(yīng)產(chǎn)物；泳道2是以CSFV石門株基因組為模板的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；泳道3是以JEV基因組為模板的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；泳道4是以PRRSV基因組為模板的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；泳道5是以豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌基因組為模板的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；泳道6是以PRV基因組為模板的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；泳道7是以PCV-2基因組為模板的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物。
[0051] 圖4為RT-LAMP和RT-PCR的靈敏度檢測結(jié)果圖，其中:
[0052]A為紫外條件下鈣黃綠素法對本發(fā)明提供的RT-LAMP產(chǎn)物檢測的結(jié)果圖；
[0053]B為利用本發(fā)明試劑盒得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳得到的結(jié)果圖；
[0054]C為利用RT-PCR方法得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳得到的圖；[0055]圖中均為:I的模板為CSFV RNA標(biāo)準(zhǔn)品(IOng/ u L)進(jìn)行10倍稀釋；2的模板為 CSFV RNA標(biāo)準(zhǔn)品(IOng/ u L)進(jìn)行IO2倍稀釋；3的模板為CSFV RNA標(biāo)準(zhǔn)品(IOng/ y L)進(jìn)行IO3倍稀釋；4的模板為CSFV RNA標(biāo)準(zhǔn)品(IOng/ u L)進(jìn)行IO4倍稀釋；5的模板為CSFV RNA標(biāo)準(zhǔn)品(IOng/ u L)進(jìn)行IO5倍稀釋；6的模板為CSFV RNA標(biāo)準(zhǔn)品(IOng/ u L)進(jìn)行IO6 倍稀釋；7為陰性對照。
【具體實(shí)施方式】
[0056]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0057]以下實(shí)施例中所用的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；Bst DNA 聚合酶大片段購自New England公司；甜菜堿(Betaine)和MgSO4購自Sigma公司；Trizol、 AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、隨機(jī)引物、Ex-Taq DNA聚合酶、dNTP (2.5mM)、瓊脂糖購自 Takara公司；全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置購自杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司(貨號:20120420-32)。
[0058]實(shí)施例1
[0059]一、引物設(shè)計
[0060]根據(jù)LAMP引物設(shè)計原則，針對CSFV NS5B基因的保守區(qū)域序列，根據(jù)LAMP引物的設(shè)計原則，應(yīng)用在線引物設(shè)計軟件PrimerExporer4.0設(shè)計引物三套,如表1所示(此時，弓丨物未進(jìn)行Biotin和FITC標(biāo)記)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，-20°C避光保存。對這三套引物分別進(jìn)行反應(yīng)溫度優(yōu)化后，在各自最優(yōu)反應(yīng)溫度下進(jìn)行反應(yīng)時間的優(yōu)化，并對三套引物的反應(yīng)時間優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行比較，反應(yīng)體系如表2所示，引物使用各套引物中相對應(yīng)的引物。第一套引物的最優(yōu)反應(yīng)溫度為60°C，反應(yīng)60min產(chǎn)物量即可達(dá)到最高。 第二套引物的最優(yōu)反應(yīng)溫度為61°C，反應(yīng)時間為80min才有產(chǎn)物形成。第三套引物的最優(yōu)反應(yīng)溫度為61°C，反應(yīng)為90min才有產(chǎn)物形成。通過篩選，得到反應(yīng)時間最短的第一套引物 (如表1所示)，包括I對外部引物(F3和B3)、l對內(nèi)部引物(FIP和BIP)和環(huán)引物(LoopB)。 FIP由Flc (Fl的互補(bǔ)序列)和F2序列組成；BIP由Blc和B2 (B2c的互補(bǔ)序列)組成。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司分別對第一套引物中的FIP引物的5’端進(jìn)行Biotin (生物素)標(biāo)記，再 分別對BIP引物和LoopB引物的5’端進(jìn)行FITC (異硫氰酸熒光素)標(biāo)記。 對FIP和BIP引物標(biāo)記組和FIP和LoopB引物標(biāo)記組分別進(jìn)行RT-LAMP的空白樣品試驗， 產(chǎn)物用核酸試紙條進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FIP和BIP引物標(biāo)記組的空白樣品核酸試紙條檢測呈陽性，而FIP和LoopB引物標(biāo)記組的空白樣品也呈陽性。所以選擇設(shè)計探針標(biāo)記。對所設(shè)計的探針Probe的3’端進(jìn)行Biotin (生物素)標(biāo)記，再對LoopB引物5’端進(jìn)行FITC (異硫氰酸熒光素)標(biāo)記。對標(biāo)記組的空白樣品核酸試紙條檢測呈陰性。所以LoopB引物的5’ 端進(jìn)行FITC (異硫氰酸熒光素)，Probe3’端Biotin (生物素)標(biāo)記為最佳標(biāo)記方式(如表1 所示)。
[0061]表1
[0062]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于包含如下引物組和核酸檢測試紙條:所述的引物組的核苷酸序列如下所示:F3:5， -GGAAAGGGCAAAGAGGCA-3，；B3:5 ’ -CGAGAGCCCTTTCTGTGATC-3，；FIP:5’ -CCTCGCAGAAGGCGTAAACCAT-GTGGACAACCTGACACAAGC-3’ ；BIP:5’ -ACGGGAGTACCCTACAAGAGCT-AACCATCATCCCCGCACA-3’ ；LoopB:5’ -FITC-GACAGGGTGGCAAAAATTCATG-3’ ；Probe:5’ -CCACGGGAGTACCCTACAAGAG-Biotin-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于: 所述的核酸檢測試紙條為通用型核酸檢測試紙條。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于: 包含全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置和權(quán)利要求1所述的引物組；全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置為將通用型核酸檢測試紙條置入一個掌上塑料檢測裝置內(nèi)得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于: 還包含dNTP混合物溶液、MgSO4溶液、反應(yīng)緩沖液、鏈置換DNA聚合酶、甜菜堿溶液和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于: 包含濃度為5U/ ii L的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、10倍反應(yīng)緩沖液、濃度為8U/L的鏈置換DNA聚合酶、 濃度為2.5mmol/L的dNTP混合物溶液、濃度為lOmol/L的甜菜堿溶液、濃度為lOOmmol/L的 MgSO4溶液、`濃度為10iimol/L的引物FIP、濃度為10 y mol/L的引物BIP、濃度為IOumol/ L的引物F3、濃度為lOiimol/L的引物B3、濃度為10 y mol/L的探針和濃度為lOiimol/L的引物L(fēng)oopB。
6.權(quán)利要求1~5任一項所述的檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用， 其特征在于包含以下步驟:(1)配制RT-LAMP反應(yīng)體系，按終濃度計算，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶為105U/L、10倍反應(yīng)緩沖液為I倍、鏈置換DNA聚合酶為0.32U/L、dNTP混合物為0.4~0.6mmol/L、甜菜堿為I~ 2mol/L、MgS04 為 0 ~3mmol/L、FIP 引物為 1.6 y mol/L、BIP 引物為 1.6 y mol/L、F3 引物為0.2 u mol/L、B3 引物為 0.2 y mol/L、探針 Probe 為 1.2 y mol/L、LoopB 引物為 1.2 y mol/L, 待測樣品RNA為12ng/ u L ;恒溫反應(yīng)；(2)反應(yīng):將步驟(1)恒溫反應(yīng)后的產(chǎn)物用核酸檢測試紙條檢測，IOmin觀察結(jié)果；(3)結(jié)果判讀:直接肉眼判讀①陰性:僅在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅色條帶，在檢測區(qū)內(nèi)無紅色條帶出現(xiàn)，證明所檢測的樣本沒有豬瘟病毒感染；②陽性:出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位于檢測區(qū)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)，證明所檢測的樣本為豬瘟病毒感染；③無效:質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)內(nèi)均無紅色條帶出現(xiàn)，表明核酸試紙條失效。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，其特征在于:步驟(1)中所述的dNTP混合物的終濃度為0.5mmol/L ；步驟(1)中所述的甜菜堿的終濃度為1.5mol/L ；步驟(1)中所述的MgSO4的終濃度為3mmol/L ；步驟(2)中所述的恒溫反應(yīng)的時間為30~60min。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，其特征在于:步驟(2)中所述的 恒溫反應(yīng)的條件為60°C反應(yīng)50min。
【文檔編號】C12Q1/70GK103602761SQ201310629121
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】陳金頂, 鄧潔汝, 勾紅潮, 裴晶晶, 劉翠翠, 姚俊庸, 趙明秋 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)