一種用于趨磁螺菌amb-1高效固態(tài)培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于趨磁螺菌Magnetospirillum?magneticum?AMB-1（ATCC?700264）高效固態(tài)培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法。本發(fā)明通過對MSGM（ATCC?Medium?1653）培養(yǎng)基的改良，如添加β-巰基乙醇酸鈉0.05~0.4g/L或還原型谷胱甘肽0.4~1.0g/L后對趨磁螺菌AMB-1進行固態(tài)培養(yǎng)。采用本發(fā)明公開的高效固態(tài)培養(yǎng)方法，得到的趨磁螺菌AMB-1單菌落轉(zhuǎn)入液態(tài)培養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)，其第一代恢復(fù)產(chǎn)磁能力的菌株比例大幅度提高,達(dá)到100%。
【專利說明】—種用于趨磁螺菌AMB-1局效固態(tài)培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種用于趨磁螺菌Magnetospirillum magneticum AMB-1 (ATCC700264)高效固態(tài)培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]趨磁細(xì)菌是一類能沿磁力線運動、在細(xì)胞內(nèi)積累生物膜包被的納米尺寸單磁疇級別晶體顆粒一磁小體的特殊細(xì)菌。造礙燦麗Magnetospirillum magneticum AMB-1 (ATCC700264)最初是由日本學(xué)者Matsunaga T (1991)等從日本東京一天然淡水泉沉積物中分離得到的一株螺旋形趨磁細(xì)菌。作為趨磁細(xì)菌中的一株模式菌，其磁小體是一種晶型完美、單分散性、生物性能良好的納米級Fe3O4型磁性微球，其粒徑分布在35~120nm范圍內(nèi)。趨磁螺菌AMB-1磁小體膜上鑲嵌有多種特異蛋白，包含多種功能基團，不具有細(xì)胞毒性，具有極好的生物相容性。因此其磁小體作為新一代納米磁性材料在磁學(xué)、材料、生物工程、醫(yī)藥、地球物理學(xué)等領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用價值。
[0003]作為一株兼性厭氧菌，趨磁螺菌AMB-1生長緩慢，生長量低，環(huán)境要求苛刻，固態(tài)培養(yǎng)難度大，特別是經(jīng)過常規(guī)固`態(tài)平板培養(yǎng)后產(chǎn)磁能力的減弱或喪失，對其生理特性研究以及遺傳操作都造成了一定困難。故一般采用磁鐵反復(fù)吸附、毛細(xì)管磁分離以及一些磁分離儀器在液態(tài)條件下進行分離、復(fù)壯等操作，其培養(yǎng)也在液態(tài)條件下進行。由于固態(tài)培養(yǎng)在微生物的常規(guī)培養(yǎng)、分子生物學(xué)操作等方面的優(yōu)越性，加之液態(tài)培養(yǎng)的局限性，如不利于高產(chǎn)磁小體菌株的分離，不利于重組基因工程菌的篩選等，使得找到一種趨磁螺菌AMB-1固態(tài)培養(yǎng)方法極其重要。為了解決趨磁螺菌AMB-1難以進行固態(tài)培養(yǎng)的問題，日本學(xué)者Matsunaga T等(1991)及山東大學(xué)李金華等(2006)采用厭氧袋技術(shù)進行了研究，取得了一定效果。但該法存在操作復(fù)雜，培養(yǎng)周期長，設(shè)備及培養(yǎng)條件要求高，恢復(fù)產(chǎn)磁菌株比例低等問題。
[0004]隨著對趨磁螺菌AMB-1研究的深入，特別是自日本學(xué)者Matsunaga T等(2005)公布AMB-1全基因組序列(NCBI GenBank: AP007255.1)后，國內(nèi)外學(xué)者們對趨磁螺菌AMB-1磁小體形成相關(guān)功能基因及磁小體生物礦化過程的研究逐漸深入，基于進行分子生物學(xué)操作、構(gòu)建遺傳操作體系等工作的迫切需要，使得尋找一種簡單高效的固態(tài)培養(yǎng)方法成為必要。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006](一)要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的目的在于提供一種趨磁螺菌AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，解決趨磁螺菌AMB-1固態(tài)培養(yǎng)難度大以及不能經(jīng)過常規(guī)固態(tài)平板培養(yǎng)后高效恢復(fù)產(chǎn)磁能力的問題。[0007]( 二)技術(shù)方案
一種用于趨磁螺菌magneticum AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的MSGM-LIS培養(yǎng)基，1000ml培養(yǎng)基中含有以下成分:
維生素混和液10.0ml
無機鹽混和液5.0ml
0.01mol/L奎尼酸鐵溶液2.0ml
0.1%刃天青溶液0.45ml 磷酸二氫鉀 0.68g 硝酸鈉 0.12g 琥珀酸 0.74g 多聚蛋白胨 0.2g 酵母浸膏 0.1g
β -巰基乙醇酸鈉0.0 5^0.4 g或者還原型谷胱甘肽0.r1.0g 用lmol/L NaOH調(diào)PH至6.75,蒸懼水定容。
[0008]一種趨磁螺菌AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
1、通過平板表面涂布法、雙 層混合平板法或雙層夾心平板法實現(xiàn)高效固態(tài)培養(yǎng)。
[0009]( I)平板表面涂布法
Φ制備含0.6%瓊脂的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基，121°C高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至45°C后倒平板；
?在無菌條件及操作下，將趨磁螺菌magneticum AMB-1種子液用
無菌水進行梯度稀釋制成細(xì)胞密度約為2000CellS/ml的菌液，取0.1ml菌液用涂布器將其均勻地涂布在Φ所制備的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基上；室溫正置靜置固定30min后倒置于27 0C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至形成單菌落。
[0010](2)雙層混合平板法
Φ制備含1%瓊脂的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基，121°c高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至45°C后
倒平板待其凝固之后備用；
@制備含0.6%瓊脂的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基，121 °C高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至45°C;
在無菌條件及操作下，將趨磁螺菌magneticum AMB-1種子液用無菌水進行梯度稀釋制成細(xì)胞密度約為2000 cells/ml的菌液，取2ml菌液加入到100ml冷卻至450C的含0.6%瓊脂的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基中，混勻后制成培養(yǎng)基菌液混合物，將5ml該培
養(yǎng)基菌液混合物覆蓋于Φ所制備的已凝固的培養(yǎng)基上；室溫正置靜置凝固30min后倒置于
27 0C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至形成單菌落。
[0011](3)雙層夾心平板法X制備含1%瓊脂的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基，121 °C高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至45°C后倒平板待其凝固之后備用；
%制備含0.6%瓊脂的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基，121°C高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至45°C保溫備用；
S在無菌條件及操作下，將趨磁螺菌AMB-1種子液用無菌水進行梯度稀釋制成細(xì)胞密度約為2000cells/ml的菌液，取0.1ml菌液用涂布器將其均勻地涂布在步驟Φ所制備的已
凝固的培養(yǎng)基上，室溫正置靜置固定30min ；
%在無菌條件及操作下，將5ml步驟②所制備的冷卻至45 °C的含0.6%瓊脂的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基覆蓋于步驟S已經(jīng)涂布菌液的培養(yǎng)基上；室溫正置靜置凝固30min后倒置于27°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至形成單菌落。
[0012]2、AMB-1單菌落轉(zhuǎn)入液態(tài)培養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)以恢復(fù)產(chǎn)磁能力
(I)在無菌條件及操作下，用裝有剪去尖端的Iml槍頭的移液槍吸取固態(tài)培養(yǎng)基上或其中的趨磁螺菌AMB-1單菌落,將其轉(zhuǎn)入裝有100ml用于趨磁螺菌Magnetospirillummagneticum AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的MSGM-LIS液態(tài)培養(yǎng)基的130ml鹽水瓶中，然后加上無菌
丁基塞。[0013](2)將鹽水瓶置于27°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5天。
[0014](三)有益效果
相比常規(guī)固態(tài)平板培養(yǎng)基氧分壓、氧化還原電位太高使得趨磁螺菌AMB-1難以保持產(chǎn)磁能力，以及采用厭氧袋技術(shù)氧分壓、氧化還原電位太低使得趨磁螺菌AMB-1生長緩慢，采用本發(fā)明提供的高效固態(tài)培養(yǎng)方法在培養(yǎng)基中添加β -巰基乙醇酸鈉0.05、.4g/L或還原型谷胱甘肽0.r1.0g/L后，培養(yǎng)基表面或內(nèi)部保持了一個適合趨磁螺菌AMB-1生長及保持產(chǎn)磁能力的氧分壓和氧化還原電位。該法周期短，操作簡單，無需厭氧裝置等大型設(shè)備，在一般實驗室中即可實現(xiàn)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為趨磁螺菌AMB-1經(jīng)固態(tài)培養(yǎng)后在培養(yǎng)基表面或其中形成的單菌落照片。圖中a、b、c使用的培養(yǎng)基為MSGM-LIS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中還原型谷胱甘肽的濃度依次為0.4、0.8、1.0g/L，采用的培養(yǎng)方法依次為平板表面涂布法、雙層混合平板法、雙層夾心平板法，培養(yǎng)時間均為5天；d、e、f使用的培養(yǎng)基為MSGM-LIS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中β-巰基乙醇酸鈉的濃度依次為0.4,0.2,0.05g/L，采用的培養(yǎng)方法依次為平板表面涂布法、雙層混合平板法、雙層夾心平板法，培養(yǎng)時間均為5天；g、h、i使用的培養(yǎng)基為常規(guī)MSGM培養(yǎng)基，采用的培養(yǎng)方法依次為平板表面涂布法、雙層混合平板法、雙層夾心平板法，培養(yǎng)時間均為8天。
[0016]圖2為趨磁螺菌AMB-1經(jīng)固態(tài)培養(yǎng)獲得單菌落，將其轉(zhuǎn)入對應(yīng)液態(tài)培養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)5天(一代)后，恢復(fù)產(chǎn)磁的菌株經(jīng)磁鐵吸附得到的磁斑照片。圖2中i上標(biāo)有數(shù)字21、22的鹽水瓶中的菌株來源于圖1中標(biāo)有a的平板，23、24來源于圖1中標(biāo)有b的平板，25來源于圖1中標(biāo)有c的平板；對應(yīng)地，圖2中ii上標(biāo)有11的鹽水瓶中的菌株來源于圖1中標(biāo)有d的平板，12、13來源于圖1中標(biāo)有e的平板，14、15來源于圖1中標(biāo)有f的平板；圖2中iii上標(biāo)有16、17及18的鹽水瓶中的菌株來源于圖1中標(biāo)有h的平板，19、20來源于圖1中標(biāo)有i的平板。
[0017]圖3為趨磁螺菌AMB-1經(jīng)高效固態(tài)培養(yǎng)獲得單菌落，將其轉(zhuǎn)入對應(yīng)液態(tài)培養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)5天(一代)后，與常規(guī)平板培養(yǎng)比較平均恢復(fù)產(chǎn)磁菌株的比例關(guān)系圖。圖中的平均恢復(fù)產(chǎn)磁菌株比例定義為相應(yīng)培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法下恢復(fù)產(chǎn)磁菌株的總數(shù)與所挑取的單菌落總數(shù)之比。
[0018]圖4為趨磁螺菌AMB-1經(jīng)高效固態(tài)培養(yǎng)獲得單菌落，將其轉(zhuǎn)入液態(tài)培養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)5天(一代)后，與常規(guī)固態(tài)平板培養(yǎng)比較產(chǎn)磁菌株平均0D600值、磁敏系數(shù)Cmag值的對比圖。圖中的平均0D600值、平均磁敏系數(shù)Cmag值定義為相應(yīng)培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法下恢復(fù)產(chǎn)磁菌株的平均0D600值、平均磁敏性系數(shù)Cmag值。Cmag值定義為施加4.25mT磁場強度的平行于分光光度計光束方向的勻強磁場下的0D600值與施加4.25mT磁場強度的垂直于光束方向的勻強磁場下的0D600值的比值 。
具體實施例
[0019]以下通過實施例進一步說明本發(fā)明
實施例1常規(guī)用于趨磁螺菌AMB-1培養(yǎng)的MSGM培養(yǎng)基的配制取800ml蒸餾水于2000ml燒杯中，將磁力攪拌器轉(zhuǎn)子置于燒杯后將燒杯置于磁力攪拌器上，將溫度傳感器放置于燒杯中，使其末端插入液面以下3cm，調(diào)節(jié)磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為200rpm，設(shè)置溫度為40°C。
[0020]按照如下配方組成:
維生素混和液10.0Oml
無機鹽混和液5.0Oml
0.01mol/L奎尼酸鐵溶液2.0Oml
0.1%刃天青溶液0.45ml
磷酸二氫鉀0.68g
硝酸鈉0.12g
抗壞血酸CL 035g
酒石酸0.37g
琥珀酸0.37g
醋酸鈉0.05g
將各配方依次加入燒杯中攪拌IOmin后,用lmol/L氫氧化鈉調(diào)PH至6.75,再用蒸懼水定容至1000ml。
[0021]所述的維生素混合液組成如下:
生物素(Biotin)2.0mg
葉酸(Folic acid)2.0mg
維生素 B6 (Pyridoxine hydrochloride)10.0mg
維生素 BI (Thiamine1HCl)5.0mg
核黃素(Riboflavin)5.0mg
煙酸(Nicotinic acid)5.0mg泛酸?丐(Calcium D-(+)-pantothenate)5.0mg
維生素 B12(vitamin B12)0.1mg
對氛基苯甲酸(P-Aminobenzoic acid)5.0mg
硫辛酸(Thioctic acid)5.0mg
蒸懼水定容至1000ml。
[0022]所述的無機鹽混合液組成如下:
次氮基三乙酸(C6H9NO6)1.5g
硫酸鎂(MgSO4.7Η20)3.0g
硫酸錳(MnS04*H20)0.5g
氯化鈉(NaCl)LOg
硫酸亞鐵(FeSO4WH2O)0.1g
氯化鈷(CoCl2.6Η20)0.1g
氯化鈣(CaCl2)0.1g
硫酸鋅(ZnSO4WH2O)0.1g
硫酸銅(CuSO4.5Η20)0.01g
硫酸鋁鉀(KA1(S04)2*12H20)0.01g
硼酸(H3BO3) 0.01g
鑰酸鈉(Na2MoO4CH2O)0.01g
蒸懼水定容至1000ml。
[0023]所述的0.01mol/L奎尼酸鐵溶液組成如下:
氯化鐵(FeCl3)0.27g
奎尼酸(C7H12O6)0.19g
蒸懼水定容至100ml。
[0024]實施例2用于趨磁螺菌AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的MSGM-LIS培養(yǎng)基(含0.05g/L的β-巰基乙醇酸鈉)的配制
取800ml蒸餾水于2000ml燒杯中，將磁力攪拌器轉(zhuǎn)子置于燒杯后將燒杯置于磁力攪拌器上，將溫度傳感器放置于燒杯中，使其末端插入液面以下3cm，調(diào)節(jié)磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為200rpm，設(shè)置溫度為40°C。
[0025]按照如下配方組成:
維生素混和液10.0Oml
無機鹽混和液5.0Oml
0.01mol/L奎尼酸鐵溶液2.0Oml
0.1%刃天青溶液0.45ml
磷酸二氫鉀0.68g
硝酸鈉0.12g
琥珀酸0.74g
多聚蛋白胨0.20g
酵母浸膏0.1Og
β-巰基乙醇酸鈉0.05 g將各配方依次加入燒杯中攪拌IOmin后,用lmol/L氫氧化鈉調(diào)PH至6.75,再用蒸懼水定容至1000ml。
[0026]所述的維生素混合液組成與實施例1中維生素混合液組成相同。
[0027]所述的無機鹽混合液組成與實施例1中無機鹽混合液組成相同。
[0028]所述的0.01mol/L奎尼酸鐵溶液組成與實施例1中0.01mol/L奎尼酸鐵溶液組成相同。
[0029]實施例3用于趨磁螺菌AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的MSGM-LIS培養(yǎng)基(含0.2g/L的β-巰基乙醇酸鈉)的配制
取800ml蒸餾水于2000ml燒杯中，將磁力攪拌器轉(zhuǎn)子置于燒杯后將燒杯置于磁力攪拌器上，將溫度傳感器放置于燒杯中，使其末端插入液面以下3cm，調(diào)節(jié)磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為200rpm，設(shè)置溫度為40°C。
[0030]按照如下配方組成:
維生素混和液10.0Oml
無機鹽混和液5.0Oml
0.01mol/L奎尼酸鐵溶液2.0Oml
0.1%刃天青溶液0.45ml
磷酸二氫鉀0.68g
硝酸鈉0.12g
琥珀酸0.74g
多聚蛋白胨0.20g
酵母浸膏0.1Og
β-巰基乙醇酸鈉0.2g
將各配方依次加入燒杯中攪拌IOmin后,用lmol/L氫氧化鈉調(diào)PH至6.75,再用蒸懼水定容至1000ml。
[0031]所述的維生素混合液組成與實施例1中維生素混合液組成相同。
[0032]所述的無機鹽混合液組成與實施例1中無機鹽混合液組成相同。
[0033]所述的0.01mol/L奎尼酸鐵溶液組成與實施例1中0.01mol/L奎尼酸鐵溶液組成相同。
[0034]實施例4用于趨磁螺菌AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的MSGM-LIS培養(yǎng)基(含0.4g/L的β-巰基乙醇酸鈉)的配制
取800ml蒸餾水于2000ml燒杯中，將磁力攪拌器轉(zhuǎn)子置于燒杯后將燒杯置于磁力攪拌器上，將溫度傳感器放置于燒杯中，使其末端插入液面以下3cm，調(diào)節(jié)磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為200rpm，設(shè)置溫度為40°C。
[0035]按照如下配方組成:
維生素混和液10.0Oml
無機鹽混和液5.0Oml
0.01mol/L奎尼酸鐵溶液2.0Oml
0.1%刃天青溶液0.45ml
磷酸二氫鉀0.68g硝酸鈉0.12g
琥珀酸0.74g
多聚蛋白胨0.20g
酵母浸膏0.1Og
β-巰基乙醇酸鈉0.4g
將各配方依次加入燒杯中攪拌IOmin后,用lmol/L氫氧化鈉調(diào)PH至6.75,再用蒸懼水定容至1000ml。
[0036]所述的維生素混合液組成與實施例1中維生素混合液組成相同。
[0037]所述的無機鹽混合液組成與實施例1中無機鹽混合液組成相同。
[0038]所述的0.01mol/L奎尼酸鐵溶液組成與實施例1中0.01mol/L奎尼酸鐵溶液組成相同。
[0039]實施例5用于趨磁螺菌AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的MSGM-LIS培養(yǎng)基(含0.4g/L的還原型谷胱甘肽)的配制
取800ml蒸餾水于2000ml燒杯中，將磁力攪拌器轉(zhuǎn)子置于燒杯后將燒杯置于磁力攪拌器上，將溫度傳感器放置于燒杯中，使其末端插入液面以下3cm，調(diào)節(jié)磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為200rpm，設(shè)置溫度為40°C。
[0040]按照如下配方組成:
維生素混和液10.0Oml
無機鹽混和液5.0Oml
0.01mol/L奎尼酸鐵溶液2.0Oml
0.1%刃天青溶液0.45ml
磷酸二氫鉀0.68g
硝酸鈉0.12g
琥珀酸0.74g
多聚蛋白胨0.20g
酵母浸膏0.1Og
還原型谷胱甘肽0.4g
將各配方依次加入燒杯中攪拌IOmin后,用lmol/L氫氧化鈉調(diào)PH至6.75,再用蒸懼水定容至1000ml。
[0041]所述的維生素混合液組成與實施例1中維生素混合液組成相同。
[0042]所述的無機鹽混合液組成與實施例1中無機鹽混合液組成相同。
[0043]所述的0.01mol/L奎尼酸鐵溶液組成與實施例1中0.01mol/L奎尼酸鐵溶液組成相同。
[0044]實施例6用于趨磁螺菌AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的MSGM-LIS培養(yǎng)基(含0.8g/L的還原型谷胱甘肽)的配制
取800ml蒸餾水于2000ml燒杯中，將磁力攪拌器轉(zhuǎn)子置于燒杯后將燒杯置于磁力攪拌器上，將溫度傳感器放置于燒杯中，使其末端插入液面以下3cm，調(diào)節(jié)磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為200rpm，設(shè)置溫度為40°C。
[0045]按照如下配方組成:維生素混和液10.0Oml
無機鹽混和液5.0Oml
0.01mol/L奎尼酸鐵溶液2.0Oml
0.1%刃天青溶液0.45ml
磷酸二氫鉀0.68g
硝酸鈉0.12g
琥珀酸0.74g
多聚蛋白胨0.20g
酵母浸膏0.1Og
還原型谷胱甘肽0.8g
將各配方依次加入燒杯中攪拌IOmin后,用lmol/L氫氧化鈉調(diào)PH至6.75,再用蒸懼水定容至1000ml。
[0046]所述的維生素混合液組成與實施例1中維生素混合液組成相同。
[0047]所述的無機鹽混合液組成與實施例1中無機鹽混合液組成相同。
[0048]所述的0.01mol/L奎尼酸鐵溶液組成與實施例1中0.01mol/L奎尼酸鐵溶液組成相同。
[0049]實施例7用于趨磁螺菌AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的MSGM-LIS培養(yǎng)基(含1.0g/L的還原型谷胱甘肽)的配制
取800ml蒸餾水于2000ml燒杯中，將磁力攪拌器轉(zhuǎn)子置于燒杯后將燒杯置于磁力攪拌器上，將溫度傳感器放置于燒杯中，使其末端插入液面以下3cm，調(diào)節(jié)磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為200rpm，設(shè)置溫度為40°C。
[0050]按照如下配方組成:
維生素混和液10.0Oml
無機鹽混和液5.0Oml
0.01mol/L奎尼酸鐵溶液2.0Oml
0.1%刃天青溶液0.45ml
磷酸二氫鉀0.68g
硝酸鈉0.12g
琥珀酸0.74g
多聚蛋白胨0.20g
酵母浸膏0.1Og
還原型谷胱甘肽1.0g
將各配方依次加入燒杯中攪拌IOmin后,用lmol/L氫氧化鈉調(diào)PH至6.75,再用蒸懼水定容至1000ml。
[0051]所述的維生素混合液組成與實施例1中維生素混合液組成相同。
[0052]所述的無機鹽混合液組成與實施例1中無機鹽混合液組成相同。
[0053]所述的0.01mol/L奎尼酸鐵溶液組成與實施例1中0.01mol/L奎尼酸鐵溶液組成相同。 [0054]實施例8采用平板表面涂布法實現(xiàn)高效固態(tài)培養(yǎng)(O趨磁螺菌常規(guī)培養(yǎng)的MSGM固態(tài)培養(yǎng)基和用于趨磁螺菌AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基的制備 取7個250 ml錐形瓶，編號為A、B、C、D、E、F、G。
[0055]向A瓶裝入100ml實施例1所配置的常規(guī)MSGM培養(yǎng)基；
向B瓶裝入100ml實施例2所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向C瓶裝入100ml實施例3所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向D瓶裝入100ml實施例4所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向E瓶裝入100ml實施例5所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向F瓶裝入100ml實施例6所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向G瓶裝入100ml實施例7所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基。
[0056]再向以上7個瓶子中加入0.6克瓊脂，以上錐形瓶用4 X 4cm的錫箔紙包住瓶口后再用8層紗布和4層報紙包扎，之后置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121 °C滅菌15 min。在滅菌結(jié)束前，提前打開超凈工作臺紫外燈及風(fēng)箱30 min。滅菌結(jié)束后，將上述錐形瓶取出搖勻后置于超凈工作臺冷卻至45 1:后倒平板，每板20 ml，制成固態(tài)培養(yǎng)基，得到常規(guī)固態(tài)培養(yǎng)基(MSGM)和高效固態(tài)培養(yǎng)基(MSGM-LIS)。
[0057](2)平板表面涂布法進行趨磁螺菌AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)
將趨磁螺菌AMB-1種子液用無菌水進行梯度稀釋制成細(xì)胞密度為2000 cells/ml的菌液，取0.1ml菌液用無菌涂布器在無菌條件下將其均勻地涂布在上述固態(tài)培養(yǎng)基上。室溫正置靜置固定30min后倒置于27°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至形成單菌落，之后用接種環(huán)挑取單菌落進行結(jié)晶紫染色鏡檢。
[0058](3)趨磁螺菌AMB-1單菌落轉(zhuǎn)入對應(yīng)的液態(tài)培養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)
用裝有剪去尖端的Iml槍頭的移液槍吸取如(2)中所述平板培養(yǎng)基上的趨磁螺菌AMB-1單菌落，將其轉(zhuǎn)入裝有100ml對應(yīng)的常規(guī)MSGM液態(tài)培養(yǎng)基和MSGM-LIS液態(tài)培養(yǎng)基中，在無菌條件下加上無菌丁基塞。將鹽水瓶置于27°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5天。
[0059](4)趨磁螺菌AMB-1單菌落轉(zhuǎn)入液態(tài)培養(yǎng)基中進行一代靜置培養(yǎng)后，恢復(fù)產(chǎn)磁驗證
用5ml無菌一次性醫(yī)用注射器在無菌條件下取鹽水瓶中培養(yǎng)好的第一代菌液5ml，用Cmag值測量儀測量其0D600值及磁敏性系數(shù)Cmag值(Cmag值測量儀:中國科學(xué)院電工研究所造。測量方法按照以下文章中的方法進行:Zhao, L.，Wu, D.，Wu, L.F.，& Song,T.(2007).A simple and accurate method for quantification of magnetosomes inmagnetotactic bacteria by common spectrophotometer.Journal of biochemical andbiophysical methods, 70 (3), 377-383.Do1:10.1016/j.jbbm.2006.08.010)。在已培養(yǎng)好第一代菌液的鹽水瓶外用透明膠帶將磁場強度為30mT的圓形磁鐵貼于瓶外，4°C下吸附一天后觀察磁斑的有無。之后統(tǒng)計恢復(fù)產(chǎn)磁菌株總數(shù)，計算平均恢復(fù)產(chǎn)磁菌株比例。
[0060]實驗結(jié)果:采用MSGM培養(yǎng)基及平板表面涂布法對趨磁螺菌AMB-1進行常規(guī)固態(tài)培養(yǎng)得到的單菌落，平均恢復(fù)產(chǎn)磁能力的菌株比例為0%，其平均0D600值為0.14，平均Cmag值為1.0 (不具有產(chǎn)磁能力)；采用MSGM-LIS培養(yǎng)基及平板表面涂布法對趨磁螺菌AMB-1進行高效固態(tài)培養(yǎng)得到的單菌落，平均恢復(fù)產(chǎn)磁能力的菌株比例為100%，其平均0D600值為0.12，平均Cmag值為2.24。需要說明的是，本結(jié)果的平均恢復(fù)產(chǎn)磁能力菌株比例、平均0D600值及平均Cmag值依次定義為在相應(yīng)培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式下產(chǎn)磁菌株總數(shù)與所挑取單菌落總數(shù)之比值、產(chǎn)磁菌株平均平均0D600值及平均Cmag值。
[0061]實施例9:采用雙層混合平板法實現(xiàn)高效固態(tài)培養(yǎng)
(I)趨磁螺菌常規(guī)MSGM培養(yǎng)基和用于趨磁螺菌AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的MSGM-LIS上層和下層固態(tài)培養(yǎng)基的制備
O下層固態(tài)培養(yǎng)基和平板的制備 取7個250 ml錐形瓶，編號為A、B、C、D、E、F、G。 [0062]向A瓶裝入100ml實施例1所配置的常規(guī)MSGM培養(yǎng)基；
向B瓶裝入100ml實施例2所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向C瓶裝入100ml實施例3所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向D瓶裝入100ml實施例4所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向E瓶裝入100ml實施例5所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向F瓶裝入100ml實施例6所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向G瓶裝入100ml實施例7所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基。
[0063]再向以上7個瓶子中加入1.0克瓊脂，以上錐形瓶用4X 4cm的錫箔紙包住瓶口后再用8層紗布和4層報紙包扎，之后置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121 °C滅菌15 min。在滅菌結(jié)束前，提前打開超凈工作臺紫外燈及風(fēng)箱30 min。滅菌結(jié)束后，將上述錐形瓶取出搖勻后置于超凈工作臺冷卻至45 1:后倒平板，每板20 ml，得到常規(guī)固態(tài)培養(yǎng)基(MSGM)和高效固態(tài)培養(yǎng)基(MSGM-LIS)的平板(下層)備用。
[0064]2)上層固態(tài)培養(yǎng)基的制備
取 7 個 250 ml 錐形瓶，編號為 A1、B1、C1、D1、E1、F1、G1。
[0065]向Al瓶裝入100ml實施例1所配置的常規(guī)MSGM培養(yǎng)基；
向BI瓶裝入100ml實施例2所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向Cl瓶裝入100ml實施例3所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向Dl瓶裝入100ml實施例4所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向El瓶裝入100ml實施例5所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向Fl瓶裝入100ml實施例6所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向Gl瓶裝入100ml實施例7所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基。
[0066]再向以上7個瓶子中加入0.6克瓊脂，以上錐形瓶用4 X 4cm的錫箔紙包住瓶口后再用8層紗布和4層報紙包扎，之后置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121 °C滅菌15 min。在滅菌結(jié)束前，提前打開超凈工作臺紫外燈及風(fēng)箱30 min。滅菌結(jié)束后，將上述錐形瓶取出搖勻后置于超凈工作臺冷卻至45 °C立即用于下一步與菌液混合并形成上層平板。
[0067](2)取2ml梯度稀釋至2000cells/ml的菌液加入到本實施例中(I)所制備的100ml冷卻至45°C的上層固態(tài)培養(yǎng)基中，混勻后制成培養(yǎng)基菌液混合物。將5ml培養(yǎng)基菌液混合物在無菌條件下覆蓋于已凝固的下層培養(yǎng)基上。
[0068]其余操作與實施例8相同。
[0069]實驗結(jié)果:采用MSGM培養(yǎng)基及雙層混合平板法對趨磁螺菌AMB-1進行常規(guī)固態(tài)培養(yǎng)得到的單菌落，平均恢復(fù)產(chǎn)磁能力的菌株比例為10%，其平均0D600值為0.14，平均Cmag值為1.76 ;采用MSGM-LIS培養(yǎng)基及雙層混合平板法對趨磁螺菌AMB-1進行高效固態(tài)培養(yǎng)得到的單菌落，平均恢復(fù)產(chǎn)磁能力的菌株比例為100%，其平均0D600值為0.11，平均Cmag值為2.3。需要說明的是，本結(jié)果的平均恢復(fù)產(chǎn)磁能力菌株比例、平均0D600值及平均Cmag值依次定義為在相應(yīng)培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式下產(chǎn)磁菌株總數(shù)與所挑取單菌落總數(shù)之比值、產(chǎn)磁菌株平均平均OD600值及平均Cmag值。
[0070]實施例10:采用雙層平板夾心法實現(xiàn)高效固態(tài)培養(yǎng) (O下層固態(tài)培養(yǎng)基和平板的制備
取7個250 ml錐形瓶，編號為A、B、C、D、E、F、G。
[0071]向A瓶裝入100ml實施例1所配置的常規(guī)MSGM培養(yǎng)基；
向B瓶裝入100ml實施例2所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向C瓶裝入100ml實施例3所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向D瓶裝入100ml實施例4所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向E瓶裝入100ml實施例5所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向F瓶裝入100ml實施例6所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向G瓶裝入100ml實施例7所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基。
[0072]再向以上7個瓶子中加入1.0克瓊脂，以上錐形瓶用4X 4cm的錫箔紙包住瓶口后再用8層紗布和4層報紙包扎，之后置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121 °C滅菌15 min。在滅菌結(jié)束前，提前打開超凈工作臺紫外燈及風(fēng)箱30 min。滅菌結(jié)束后，將上述錐形瓶取出搖勻后置于超凈工作臺冷卻至45 1:后倒平板，每板20 ml，得到常規(guī)固態(tài)培養(yǎng)基(MSGM)和高效固態(tài)培養(yǎng)基(MSGM-LIS)的平板(下層)備用`。
[0073](2)上層固態(tài)培養(yǎng)基的制備
取 7 個 250 ml 錐形瓶，編號為 A1、B1、C1、D1、E1、F1、G1。
[0074]向Al瓶裝入100ml實施例1所配置的常規(guī)MSGM培養(yǎng)基；
向BI瓶裝入100ml實施例2所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向Cl瓶裝入100ml實施例3所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向Dl瓶裝入100ml實施例4所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向El瓶裝入100ml實施例5所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向Fl瓶裝入100ml實施例6所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基；
向Gl瓶裝入100ml實施例7所配置的MSGM-LIS培養(yǎng)基。
[0075]再向以上7個瓶子中加入0.6克瓊脂，以上錐形瓶用4 X 4cm的錫箔紙包住瓶口后再用8層紗布和4層報紙包扎，之后置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121 °C滅菌15 min。在滅菌結(jié)束前，提前打開超凈工作臺紫外燈及風(fēng)箱30 min。滅菌結(jié)束后，將上述錐形瓶取出搖勻后置于超凈工作臺冷卻至45 V
(3)將0.1ml梯度稀釋至2000cellS/ml的菌液用無菌涂布器在如本實施例中(I)所述的平板上，常溫正置靜置30min后，將5ml含0.6%瓊脂的對應(yīng)的常規(guī)MSGM或高效固態(tài)培養(yǎng)MSGM-LIS培養(yǎng)基覆蓋于其上并形成上層平板(對應(yīng)是指:下層是A的話，則對應(yīng)于上層的Al，其他類推)。
[0076]其余操作與實施例8相同。
[0077]實驗結(jié)果:采用MSGM培養(yǎng)基及雙層夾心平板法對趨磁螺菌AMB-1進行常規(guī)固態(tài)培養(yǎng)得到的單菌落，平均恢復(fù)產(chǎn)磁能力的菌株比例為15%，其平均0D600值為0.14，平均Cmag值為1.9 ;采用MSGM-LIS培養(yǎng)基及雙層夾心平板法對趨磁螺菌AMB-1進行高效固態(tài)培養(yǎng)得到的單菌落，平均恢復(fù)產(chǎn)磁能力的菌株比例為100%，其平均0D600值為0.13，平均Cmag值為2.33。需要說明的是， 本結(jié)果的平均恢復(fù)產(chǎn)磁能力菌株比例、平均0D600值及平均Cmag值依次定義為在相應(yīng)培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式下產(chǎn)磁菌株總數(shù)與所挑取單菌落總數(shù)之比值、產(chǎn)磁菌株平均平均OD600值及平均Cmag值。
【權(quán)利要求】
1.一種用于趨磁螺菌Magnetospirillum magneticum AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的MSGM-LIS培養(yǎng)基，1000ml培養(yǎng)基中除含有以下用于趨磁螺菌AMB-1培養(yǎng)的常規(guī)成分: 維生素混和液10.0ml 無機鹽混和液5.0ml 0.01mol/L奎尼酸鐵溶液2.0ml 0.1%刃天青溶液0.45ml 磷酸二氫鉀0.68g硝酸鈉0.12g琥珀酸0.74g 多聚蛋白胨0.2g酵母浸膏0.1g, 其特征為:在1000 ml培養(yǎng)基中還含有β -巰基乙醇酸鈉0.05、.4 g或者還原型谷胱甘肽0.4~1.0 go
2.如權(quán)利要求1所述的一種用于趨磁螺菌magneticumAMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的MSGM-LIS培養(yǎng)基，其特征為: 所述的維生素混合液組成如下:` 生物素(Biotin)2.0mg 葉酸(Folic acid)2.0mg 維生素 B6 (Pyridoxine hydrochloride)10.0mg 維生素 BI (Thiamine1HCl)5.0mg 核黃素(Riboflavin)5.0mg 煙酸(Nicotinic acid)5.0mg 泛酸?丐(Calcium D-(+)-pantothenate)5.0mg 維生素 B12(vitamin B12)0.1mg 對氛基苯甲酸(P-Aminobenzoic acid)5.0mg 硫辛酸(Thioctic acid)5.0mg 蒸懼水定容至1000ml。
3.如權(quán)利要求1所述的一種用于趨磁螺菌magneticumAMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的MSGM-LIS培養(yǎng)基，其特征為: 所述的無機鹽混合液組成如下: 次氮基三乙酸(C6H9NO6)1.5g 硫酸鎂(MgSO4.7Η20)3.0g 硫酸錳(MnS04*H20)0.5g 氯化鈉(NaCl)LOg 硫酸亞鐵(FeSO4WH2O)0.1g 氯化鈷(CoCl2.6Η20)0.1g 氯化鈣(CaCl2)0.1g 硫酸鋅(ZnSO4WH2O)0.1g 硫酸銅(CuSO4.5Η20)0.01g硫酸鋁鉀(KA1(S04)2*12H20)0.01g 硼酸(H3BO3)0.01g
鑰酸鈉(Na2MoO4CH2O)0.01g 蒸懼水定容至1000ml。
4.如權(quán)利要求1所述的一種用于趨磁螺菌magneticumAMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的MSGM-LIS培養(yǎng)基，其特征為: 所述的0.01mol/L奎尼酸鐵溶液組成如下: 氯化鐵(FeCl3)0.27g 奎尼酸(C7H12O6)0.19g 蒸懼水定容至100ml。
5.一種用于趨磁螺菌Magnetospirillum magneticum AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基的配制方法，其特征為:取800ml蒸餾水于2000ml燒杯中，將磁力攪拌器轉(zhuǎn)子置于燒杯后將燒杯置于磁力攪拌器上，將溫度傳感器放置于燒杯中，使其末端插入液面以下3cm，調(diào)節(jié)磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為200rpm，設(shè)置溫度為40°C ;按照權(quán)利要求1-4任意一項所述的一種用于趨磁螺菌鐵magneticum AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的培養(yǎng)基MSGM-LIS的配方組成，將各配方依次加入燒杯中攪拌IOmin后，用lmol/L氫氧化鈉調(diào)PH至6.75，加入6.0-10.0g的瓊脂，用蒸餾水定容至1000ml ;再經(jīng)過分裝之后用高壓蒸汽滅菌鍋于121°C高壓蒸汽滅菌15min。
6.一種趨磁螺菌MagnetospiriIlum magneticum AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)方法，其特征在于:按照權(quán)利要求5所述的用于趨磁螺菌Magne tospiri Ilum magne ti cum AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基的配制方法，配制MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基；再采用平板表面涂布法、雙層混合平板法或雙層夾心平板法對其進行固態(tài)培養(yǎng)，獲得趨磁螺菌Magne tospiri Ilum magnet i cum AMB-1單菌落后將單菌落轉(zhuǎn)入MSGM-LIS液態(tài)培養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)以恢復(fù)產(chǎn)磁能力。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種趨磁螺菌magneticumAMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)方法，其特征在于: 所述的平板表面涂布法按以下步驟進行: 由制備含0.6%瓊脂的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基，121°C高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至45°C后倒平板； 5:在無菌條件及操作下，將趨磁螺菌magneticum AMB-1種子液用無菌水進行梯度稀釋制成細(xì)胞密度約為2000CellS/ml的菌液，取0.1ml菌液用涂布器將其均勻地涂布在?所制備的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基上；室溫正置靜置固定30min后倒置于27°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至形成單菌落。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種趨磁螺菌magneticumAMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)方法，其特征在于: 所述的雙層混合平板法按以下步驟進行: 由制備含1%瓊脂的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基，121°C高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至45°C后倒平板待其凝固之后備用；Φ制備含0.6%瓊脂的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基，121 °C高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至45°C ；在無菌條件及操作下，將趨磁螺菌magneticum AMB-1種子液用無菌水進行梯度稀釋制成細(xì)胞密度約為2000 cells/ml的菌液，取2ml菌液加入到100ml冷卻至450C的含0.6%瓊脂的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基中，混勻后制成培養(yǎng)基菌液混合物，將5ml該培養(yǎng)基菌液混合物覆蓋于?所制備的已凝固的培養(yǎng)基上；室溫正置靜置凝固30min后倒置于27°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至形成單菌落。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種趨磁螺菌magneticumAMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)方法，其特征在于: 所述雙層夾心平板法按以下步驟進行: I:制備含1%瓊脂的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基，121°c高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至45°C后倒平板待其凝固之后備用； S制備含0.6%瓊脂的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基，121 °C高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至45°C保溫備用； S在無菌條件及操作下，將趨磁螺菌AMB-1種子液用無菌水進行梯度稀釋制成細(xì)胞密度約為2000cells/ml的菌液，取0.1ml菌液用涂布器將其均勻地涂布在步驟?所制備的已凝固的培養(yǎng)基上，室溫正置靜置固定30min ； Φ在無菌條件及操作下，將5ml步驟S.所制備的冷卻至45 °C的含0.6%瓊脂的MSGM-LIS固態(tài)培養(yǎng)基覆蓋于步驟: :f已經(jīng)涂布菌液的培養(yǎng)基上；室溫正置靜置凝固30min后倒置于27°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至形成單菌落。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9任意一項所述的趨磁螺菌MagnetospirillummagneticumAMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)方法獲得Magne tospiri Ilum magne ti cum AMB-1單菌落之后，將Magne tospiri Ilum magnet i cum AMB-1單菌落轉(zhuǎn)入對應(yīng)的MSGM-LIS液態(tài)培養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)以恢復(fù)產(chǎn)磁能力，其特征在于操作步驟如下: Φ在無菌條件及操作下，用裝有剪去尖端的Iml槍頭的移液槍吸取固態(tài)培養(yǎng)基上或其中的趨磁螺菌AMB-1單菌落，將其轉(zhuǎn)入裝有100 ml權(quán)利要求1_4任意一項所述的用于趨磁轅嵐MagnetospiriIIum magneticum AMB-1高效固態(tài)培養(yǎng)的MSGM-LIS液態(tài)培養(yǎng)基的130ml鹽水瓶中，然后加上無菌丁基塞； S將鹽水瓶置于27°c恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5天。
【文檔編號】C12R1/01GK103642728SQ201310644809
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】李相前, 茍育軍, 葛青青, 伍敏, 徐亞茹 申請人:淮陰工學(xué)院