球孢白僵菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及球孢白僵菌及其菌劑的制備方法和應(yīng)用，尤其對(duì)防治蝗蟲類害蟲有效。本發(fā)明提供的球孢白僵菌Beauveria?bassiana(Bals.-Criv.)Vuill?TRCC16003，其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC?No.7998；該菌株產(chǎn)孢能力強(qiáng)，對(duì)菱蝗3齡跳蝻殺蟲活性強(qiáng)，LT50(致死中時(shí))為4.13天。利用該菌株能有效控制菱蝗的種群數(shù)量?；认x綠僵菌對(duì)其他害蟲松毛蟲、玉米螟、蠐螬等具有很好的防治效果，值得推廣應(yīng)用。
【專利說明】球孢白僵菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)防治領(lǐng)域，具體涉及球孢白僵菌(Beauveriabassiana (Bals.-Criv.) Vui 11 TRCC16003)及其菌劑的制備方法和在防治植物蟲害中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]蝗蟲是蝗科，直翅目昆蟲。全世界有超過10，000種。分布于全世界的熱帶、溫帶的草地和沙漠地區(qū)?？谄鲌?jiān)硬，前翅狹窄而堅(jiān)韌，后翅寬大而柔軟，善于飛行，后肢很發(fā)達(dá)，善于跳躍?；认x是農(nóng)、林、牧業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，不少有害蝗種對(duì)農(nóng)、林、牧業(yè)可造成不同程度危害。全世界的蝗蟲已有I萬種以上，其中對(duì)農(nóng)、林、牧業(yè)可造成危害的蝗蟲約300種左右，全球除南極洲、歐亞大陸北緯550以北地區(qū)外均可發(fā)生蝗蟲。
[0003]多年來草原蝗蟲一直采用化學(xué)農(nóng)藥防治，對(duì)迅速控制蝗害的發(fā)生、擴(kuò)散起到了積極作用。但化學(xué)農(nóng)藥治蝗存在成本高、用量大、安全性差等弊端且大量使用易造成人畜中毒、污染草原同時(shí)殺滅蝗蟲天敵危害草原生態(tài)環(huán)境破壞生態(tài)平衡。因此生物防治技術(shù)是目前草原災(zāi)害綜合治理的積極有效的措施。白僵菌是一種半知菌類的蟲生真菌，具有營養(yǎng)器官一菌絲和繁殖器官一分生孢子，菌絲有橫隔有分枝。白僵菌的分布范圍很廣，從海拔幾米至2000多米的高山均發(fā)現(xiàn)過白僵菌的存在，白僵菌可以侵入6個(gè)目15科200多種昆蟲、螨類的蟲體內(nèi)大量繁殖，同時(shí)不斷產(chǎn)生白僵素(大環(huán)脂類毒素)和草酸鈣結(jié)晶，這些物質(zhì)可引起昆蟲中毒，使體液發(fā)現(xiàn)機(jī)能發(fā)生變化，打亂新陳代謝以致死亡。所謂白僵蟲就是白僵菌的分生孢子落在昆蟲體上，在合適溫濕條件下，即可發(fā)芽直接侵入昆蟲體內(nèi)，以昆蟲體內(nèi)的血細(xì)胞及其他組織細(xì)胞作為營養(yǎng)，大量增殖，以后菌絲穿出體表，產(chǎn)生白粉狀分生孢子，從而使害蟲呈白色僵死狀，稱為白僵蟲。白僵菌制劑對(duì)人、畜無毒，對(duì)作物安全，無殘留、無污染，但能感染家蠶幼蟲，形成僵蠶病。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了一株球孢白僵菌。
[0005]本發(fā)明所提供的球抱白僵菌Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) VuillTRCC16003，其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCCN0.7998。該菌株已于2013年08月13日把藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC)。
[0006]本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種殺蟲菌劑。
[0007]本發(fā)明提供的殺蟲菌劑，它的活性成分是上述球孢白僵菌Beauveriabassiana(Bals.-Criv.)Vui11 TRCC16003。
[0008]所述殺蟲菌劑用于防治以下害蟲的幾種或一種:松毛蟲、玉米螟、蠐螬、蝗蟲、馬鈴薯甲蟲、松褐天牛、白蟻、茶小綠葉蟬、桃小食心蟲等。
[0009]本發(fā)明的球抱白僵菌Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill TRCC16003 對(duì) 3齡蝗蝻具有高致病力。
[0010]菌種名稱:球孢白僵菌
[0011]拉丁名:Beauveriabassiana
[0012]菌種編號(hào):TRCC16003
[0013]保藏機(jī)構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心
[0014]保藏機(jī)構(gòu)簡稱:CGMCC
[0015]地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)
[0016]保藏日期:2013年08月13日
[0017]保藏中心登記入冊(cè)編號(hào):CGMCC N0.7998
[0018]以下結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例詳細(xì)描述本發(fā)明，這些實(shí)例僅僅是用于理解本發(fā)明而非限制。
[0019]實(shí)施實(shí)例I球孢白僵菌的菌株鑒定
[0020]分子系統(tǒng)學(xué)鑒定
[0021]DNA提取方法:采用石英砂研磨CTAB提取法(Scott et al., 2000)。
[0022]遺傳標(biāo)記:選用翻譯延伸因子(tef Ι-alpha)基因(tef)，擴(kuò)增引物=EFlT,EF2T(Bischoff et al.,2006)。
[0023]PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:先94攝氏度加熱3分鐘使模板DNA變性，然后進(jìn)入下列溫度循環(huán):94攝氏度變性30秒，50攝氏度退火30秒，72攝氏度延伸45秒，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后在72攝氏度延伸5分鐘(Wang，2012)。
[0024]PCR產(chǎn)物檢測和測序:PCR產(chǎn)物與 10bp DNA ladder (MBI Fermentas)用 2.0%的瓊脂糖凝膠(agarose gel)在0.5 X TBE電泳緩沖液中于80V電壓下電泳20分鐘，然后置于
0.5 μ g / ml的溴乙淀(EB, ehidium bromide)溶液中染色15分鐘,在波長365和254nm的紫外光下檢測為明顯單一條帶的產(chǎn)物由擎科生物技術(shù)有限公司純化后用ABI3700 (AppliedB1systems)進(jìn)行雙向直通測序。測序結(jié)果見附圖1。
[0025]數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:原始序列用生物軟件B1edit7.0.9(Hall，1999)編輯后得到準(zhǔn)確無誤的序列，與GenBank下載的模式和權(quán)威菌株序列組成序列數(shù)據(jù)矩陣。對(duì)于序列矩陣，在B1edit7.0.9下做必要的人工編輯和調(diào)整得到的新矩陣。將該矩陣用MEGA5.0 (Tamura et al., 2011)進(jìn)行鄰居連接法(neighbor-joining, NJ)分析，推斷出系統(tǒng)發(fā)育樹，并用自展法(bootstrap)進(jìn)行1000次重復(fù)評(píng)估各分支的可靠性(附圖2，見下頁)。
[0026]菌株TRCC16003tef 序列:
[0027]TRCC16003
[0028]5，-TCACATCAACGTCGTCGTTATCGGGTGCGTTTAACGCTGAACGCCTTCGACCTCGACGAGCAATAAATACTGACCACCAGACAGCCACGTCGATTCCGGCAAGTCTACCACCGTAAGTTTTTTTTCAGGTCGAGTGGCTTTTGAGCTCTCGAACCAGCAATCTTCCGCCTCGCCGGTACCTGAGAGCAAAGAGCTAACTCATGTATACAGACTGGTCACTTGATCTACCAGTGCGGTGGTATTGACAAGCGTACTTGAGAAGTTCGAGAAGGTAAGCATAGTATCCAACTCTTTTCTACTGTCAAATGGACCTTGATCGCTTGCTGCGCAATTTTTTTTTCGTCGTATCGCGCTGGCCACCAGCACTCACTACCCCTCCCGTGCGGCAAAAATTTTCAGTGCCTTATCAATTCAGTGGGGCCAGTGAGAGTACCCCGCCACCTTGTCGCAAGCTTTCCCCTCATCTATTAGGTCGAAGCAGCAGAAGAAGAGATATCGCGTGCACCAGCAACAGATCGCTAACCTACCGTCTACAGGAAGCCGCTGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTATGCCTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATTGATATCGCCTCTGAAGTTCGAGACTCCCAAGTACCACGTCACCGTCATTGATGCTCCCGGTCACCGTGATTTCATCAAGAACAT-3’
[0029]球孢白僵菌Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill TRCC16003 的系統(tǒng)發(fā)育樹見附圖2。
[0030]實(shí)施實(shí)例2球孢白僵菌的室內(nèi)殺蝗特性測定:
[0031]該實(shí)驗(yàn)設(shè)兩個(gè)處理，分別是球抱白僵菌Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) VuillTRCC16003實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組。
[0032]實(shí)驗(yàn)處理方法如下:25攝氏度下，接種孢子量為1.0X 18個(gè)/ mL，處理籠放入菱蟲皇(pygmy grasshoppers) 3齡幢蝻,每個(gè)處理有3個(gè)重復(fù),每組處理30頭幢蟲,藥劑用量為5ml / 30頭，利用小噴霧器直接噴霧于養(yǎng)蟲籠內(nèi)。計(jì)錄死蟲數(shù)，記錄存活率。經(jīng)SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析得到LT5tl (致死中時(shí))。結(jié)果表明，球孢白僵菌Beauveria bassiana (Bals.-Criv.)Vuill, TRCC16003 對(duì)菱蟲皇(pygmy grasshoppers) 3 齡蟲皇蝻的 LT50 為 4.13 天。
[0033]表1球孢白僵菌CC16003室內(nèi)殺蝗活性測定
[0034]

【權(quán)利要求】
1.一種球抱白僵菌,其拉丁名稱為Beauveria bassiana(Bals.-Criv.) Vuill,其特征在于:所述的球抱白僵菌 Beauveria bassiana(Bals.-Criv.) Vuill 菌株號(hào)為 TRCC16003,其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC N0.7998。
2.權(quán)利要求1所述的球孢白僵菌在產(chǎn)生分生孢子或菌絲體中的應(yīng)用。
3.一種殺蟲菌劑，它的活性成分是權(quán)利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveriabassiana)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的殺蟲菌劑，其特征在于:所述的球孢白僵菌為分生孢子或菌絲體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的菌劑，其特征在于:所述殺蟲菌劑用于防治以下害蟲的幾種或一種:松毛蟲、玉米螟、蠐螬、蝗蟲、馬鈴薯甲蟲、松褐天牛、白蟻、茶小綠葉蟬、桃小食心蟲。
6.權(quán)利要求1所述的球孢白僵菌,其拉丁名稱為Beauveriabassiana,在制備殺蟲劑中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3或4所述的殺蟲菌劑在制備殺蟲劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N3/00GK104073439SQ201310646189
【公開日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】梁小文, 王根豪, 陳曉燕, 周立峰, 李肖宇, 馬忠?guī)r, 吳俊杰, 劉麗君, 李源 申請(qǐng)人:江西天人生態(tài)股份有限公司