一種錨定表達(dá)屋塵螨過(guò)敏原Derp2的重組乳酸乳球菌及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及通過(guò)對(duì)屋塵螨（Dermatophagoides?pteronyssinus）的主要過(guò)敏原Derp2基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化得到優(yōu)化后的基因mderp2，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建錨定表達(dá)屋塵螨過(guò)敏原Derp2的重組表達(dá)質(zhì)粒pNZ8148-AD和重組乳酸乳球菌L.lactis?AD（保藏號(hào)為CGMCC?No.8221）。Western?blot結(jié)果表明本發(fā)明的重組乳酸乳球菌L.lactis?AD可在菌體表面表達(dá)過(guò)敏原Derp2；同時(shí)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示口服重組乳酸乳球菌L.lactis?AD可增加脾臟內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平，降低小鼠體內(nèi)由屋塵螨過(guò)敏原Derp2引發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)，具有較好的預(yù)防作用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種錨定表達(dá)屋塵螨過(guò)敏原DerP2的重組乳酸乳球菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及遺傳資源工程，具體涉及一種錨定表達(dá)屋塵螨過(guò)敏原Derp2的重組乳酸乳球菌L.lactis AD及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]過(guò)敏性疾病是臨床上的常見(jiàn)病、多發(fā)病，是當(dāng)前世界性的重大衛(wèi)生學(xué)問(wèn)題。其中，在引發(fā)過(guò)敏性疾病的眾多吸入性過(guò)敏原中，屋塵螨是導(dǎo)致呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病的重要因素之一。屋塵螨是一類(lèi)結(jié)構(gòu)和成分復(fù)雜的生物，目前人們已從屋塵螨的數(shù)百種蛋白中初步鑒定出幾十種過(guò)敏原；過(guò)敏原Derp2是其中最為主要的過(guò)敏原之一，約80%_90%的屋塵螨過(guò)敏患者對(duì)Derp2產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。特異性免疫治療(SIT)被認(rèn)為是最有效的治療過(guò)敏的方法，但成功的免疫治療取決于高質(zhì)量的變應(yīng)原。目前，臨床上用于診斷和治療的屋塵螨粗提液含有大量非特異性雜質(zhì)，嚴(yán)重阻礙了屋塵螨過(guò)敏原試劑的臨床應(yīng)用。為獲得高質(zhì)量的變應(yīng)原，從天然產(chǎn)物中分離純化過(guò)敏原(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?200410022961.9)，操作繁復(fù)且純度不高，重復(fù)性較差；利用分子生物學(xué)技術(shù)，在大腸桿菌(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?201210139240.0)、酵母等表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)過(guò)敏原Derp2被認(rèn)為是一種可行的策略，但其安全性及后續(xù)過(guò)敏原的純化限制了這些表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)際應(yīng)用。
[0003]近幾年，隨著對(duì)乳酸菌性質(zhì)的不斷研究，其益生特性逐漸被人們所認(rèn)識(shí)并接受，特別是在治療一些慢性疾病和自身免疫性疾病，如過(guò)敏，腸炎等，具有普通藥物所不具備的優(yōu)勢(shì)。以乳酸菌作為表達(dá)系統(tǒng)，使抗原或其他功能性蛋白在粘膜表面進(jìn)行表達(dá)釋放，可以有效的避免傳統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)(大腸桿菌)所帶來(lái)的安全隱患及后續(xù)抗原的純化問(wèn)題，同時(shí)避免了在口服過(guò)程中蛋白的降解和口服耐受，更能促進(jìn)抗原或功能性蛋白被免疫系統(tǒng)所吸收等。
[0004]外源蛋白在乳酸菌中的表達(dá)方式有三種:一是目的蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)；二是在信號(hào)肽作用下將目的蛋白分泌到培養(yǎng)基中；三是目的蛋白錨定在細(xì)胞壁上。將外源蛋白展示在乳酸菌表面是一種有效的研究工具并在活載體疫苗開(kāi)發(fā)、診斷學(xué)、全細(xì)胞吸附劑以及新的生物催化劑等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明通過(guò)對(duì)過(guò)敏原Derp2的天然基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，構(gòu)建錨定表達(dá)屋塵螨過(guò)敏原Derp2的重組乳酸乳球菌L.lactis AD ;并驗(yàn)證其在預(yù)防屋塵螨過(guò)敏疾病方面的效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種基因優(yōu)化的屋塵螨過(guò)敏原基因mderp2，提供一種錨定表達(dá)基因優(yōu)化的屋塵螨過(guò)敏原Derp2的重組乳酸乳球菌L.lactis AD (保藏號(hào)為CGMCCN0.8221)，提供將所述過(guò)敏原用于預(yù)防屋塵螨過(guò)敏疾病的用途，提供將所述重組乳酸乳球菌L.lactis AD用于預(yù)防屋塵螨過(guò)敏疾病的用途。
[0006]一方面，本發(fā)明提供了一種基因優(yōu)化的屋塵螨過(guò)敏原Derp2，該過(guò)敏原基因mderp2 的序列為 SEQ ID N0.1。[0007]所述基因優(yōu)化的屋塵螨過(guò)敏原基因mderp2是通過(guò)對(duì)來(lái)源于屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的主要過(guò)敏原 Derp2 的天然基因序列 SEQ ID N0.2 進(jìn)行基因優(yōu)化后獲得的。
[0008]另一方面，本發(fā)明提供了一種錨定表達(dá)基因優(yōu)化的屋塵螨過(guò)敏原Derp2的重組乳酸乳球菌L.lactis AD(保藏號(hào)為CGMCC N0.8221 )，所述菌株是通過(guò)將優(yōu)化后的基因mderp2克隆到乳酸乳球菌的表達(dá)質(zhì)粒PNZ8148上，構(gòu)建錨定表達(dá)型質(zhì)粒pNZ8148-AD，再將獲得的錨定表達(dá)型質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入宿主菌株L.lactis NZ9000而獲得的。
[0009]另一方面，本發(fā)明提供了將所述過(guò)敏原用于預(yù)防屋塵螨過(guò)敏疾病的用途。
[0010]再一方面，本發(fā)明提供了將上述乳酸乳球菌用于預(yù)防屋塵螨過(guò)敏疾病的用途。
[0011]本發(fā)明涉及的乳酸乳球菌Lactococcus lactis AD于2013年9月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址(100101)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8221。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1表示屋塵螨過(guò)敏原Derp2基因突變位點(diǎn)對(duì)照?qǐng)D。
[0013]圖2表不重組乳酸乳球菌L.lactis AD中Derp2蛋白的western blot檢測(cè)。
[0014]如圖:最左側(cè)為蛋白分子Marker ；1號(hào)泳道:純化的Derp2,陽(yáng)性對(duì)照；2號(hào)泳道:重組菌株L.lactis AD原生質(zhì)體的細(xì)胞破碎液；3、4號(hào)泳道:陰性對(duì)照菌株L.1actis8148(不含Derp2基因)的上清液和細(xì)胞破碎液
[0015]圖3表示小鼠免疫的過(guò)程。
[0016]首先進(jìn)行小鼠屋塵螨過(guò)敏模型的構(gòu)建，具體的構(gòu)建過(guò)程分為三個(gè)階段:首先在0-4天及7-11天進(jìn)行灌胃預(yù)防處理(200 μ I菌體或生理鹽水)；在第17、24、31天進(jìn)行腹腔注射Der p2/Alum (Pierce，美國(guó))(200 μ I)的混合物，使小鼠產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)；最后一個(gè)階段為霧化階段，通過(guò)霧化激發(fā)器將Derp2蛋白進(jìn)行霧化，使小鼠通過(guò)自然呼吸的方式吸入體內(nèi)。
[0017]圖4表示口服重組乳酸乳球菌L.lactis AD對(duì)小鼠體內(nèi)過(guò)敏原特異性抗體的影響。
[0018]Positive:陽(yáng)性對(duì)照組小鼠！Negative:陰性對(duì)照組小鼠；8148:灌胃對(duì)照菌株L.1actis8148 (不含Derp2基因)的小鼠；AD:灌胃重組菌株L.lactis AD的小鼠;ND:灌胃重組菌株L.1actis ND(先前構(gòu)建，用作對(duì)照菌株)的小鼠
[0019]圖5-1表示肺部的組織形態(tài)觀察(HE染色)；
[0020]圖5-2表示肺部的組織形態(tài)觀察(甲苯胺藍(lán)染色)；
[0021]A:陽(yáng)性對(duì)照組小鼠；B:陰性對(duì)照組小鼠；C:灌胃L.1actis8148 (空質(zhì)粒)的小鼠；D:灌胃重組菌株L.lactis AD的小鼠；
[0022]圖6表示不同組別脾臟內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平
[0023]A:陽(yáng)性對(duì)照組小鼠；B:灌胃重組菌株Llactis ND的小鼠；C:灌胃重組菌株L.lactis AD的小鼠；D:陰性對(duì)照小鼠
[0024]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0025]目前， 臨床使用的屋塵螨變應(yīng)原制劑多為通過(guò)對(duì)人工飼養(yǎng)的屋塵螨進(jìn)行滅活處理后分離純化得到的混合物，其成分復(fù)雜，用于SIT治療存在著無(wú)法避免的副作用。本發(fā)明所用的乳酸菌疫苗因?yàn)槿樗峋目墒秤眯?，不用?jīng)過(guò)滅活及純化處理即可用于臨床使用。此外，乳酸菌作為一種常見(jiàn)的微生物，培養(yǎng)及后續(xù)操作過(guò)程簡(jiǎn)單，成本較低，可以通過(guò)制成粉狀制劑、膠囊等形式的藥品，攜帶方便，無(wú)需特殊條件即可自行服用。相比傳統(tǒng)的皮下注射方式，乳酸菌疫苗的口服方式更易為病人所接受，同時(shí)通過(guò)口服方式更容易使機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受，縮短治療時(shí)間。
實(shí)施例
[0026]下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)的說(shuō)明。
[0027]1、根據(jù)乳酸乳球菌基因組數(shù)據(jù)，分析乳酸乳球菌的密碼子偏好性、GC含量等參數(shù)，將來(lái)源于屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的主要過(guò)敏原Derp2的天然基因序列該修飾性過(guò)敏原的基因序列為SEQ ID N0.2 (genebank:AF276239.1)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，得到可以在乳酸乳球菌內(nèi)高效表達(dá)的基因mderp2，該基因的序列為SEQ IDN0.1 ； [0028]2、將優(yōu)化后的基因mderp2克隆到乳酸乳球菌的表達(dá)質(zhì)粒pNZ8148(中國(guó)科學(xué)院鐘瑾研究員惠贈(zèng))上，構(gòu)建錨定表達(dá)型質(zhì)粒PNZ8148-AD，并將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入宿主菌株L.1actisNZ9000 (中國(guó)科學(xué)院鐘瑾研究員惠贈(zèng))中，得到重組菌株L.lactis AD (保藏號(hào)為CGMCCN0.8221)。
[0029]3、用Western blot檢測(cè)重組乳酸乳球菌L.lactis AD中重組蛋白Derp2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)重組乳酸乳球菌L.lactis AD可在菌體表面成功表達(dá)過(guò)敏原Derp2 ；
[0030]4、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，相比口服生理鹽水和胞內(nèi)表達(dá)過(guò)敏原的重組乳酸乳球菌的對(duì)照小鼠，口服重組乳酸乳球菌L.lactis AD通過(guò)增加脾臟內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平降低實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)Derp2特異性的IgE的水平和肺部炎癥反應(yīng)，抑制過(guò)敏反應(yīng)。
[0031]技術(shù)細(xì)節(jié)
[0032]1、屋塵螨過(guò)敏原Derp2天然基因的優(yōu)化
[0033]參照屋塵螨過(guò)敏原Derp2天然基因序列SEQ ID N0.2 (GeneBank:AF276239.1),基于乳酸乳球菌基因組的特點(diǎn)，根據(jù)GC含量、稀有密碼子使用情況等對(duì)其進(jìn)行基因優(yōu)化，得到優(yōu)化后的基因序列mderp2 (SEQ ID N0.1 )，人工合成后克隆到質(zhì)粒pUC57 (生工生物工程(上海)有限公司)上，得到pUC57-mderp2質(zhì)粒。
[0034]屋塵纟兩過(guò)敏原Derp2基因優(yōu)化后的基因序列mderp2:SEQ ID N0.1。
[0035]屋塵螨過(guò)敏原Derp2的原始基因序列AF276239.1:SEQ ID N0.2。
[0036]屋塵螨過(guò)敏原Derp2的氨基酸序列:SEQ ID N0.3。
[0037]2、乳酸乳球菌錨定表達(dá)質(zhì)粒pNZ8148-AD的構(gòu)建
[0038]以人工合成質(zhì)粒pUC57-mderp2 為模板，以 8N-F’ (ggggtaccGATCAAGTTGATGTTAAAGATTGTGC)和 8N-R’ (gtctagaATCACGAATTTTAGCATGAGTAG)為引物，采用 PCR 的方法擴(kuò)增目的基因 mderp2(PCR 程序?yàn)?95°C 30s, 57°C 30s, 72°C 30s, 30 個(gè)循環(huán)；PCR 反應(yīng)體系(50 μ I):5μ I dNTPs (2mM)，5 μ I 10 X Buffer, I μ I TaqE,上下游引物各 I μ 1，模板 I μ I)，PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后得到目的片段，然后以內(nèi)切酶KpnI和XbaI在37°C條件下反應(yīng)3小時(shí)，再經(jīng)純化處理后得到目的片段-mderp2 ;同上一步操作，以乳酸乳球菌NZ9000基因組為模板，分別以CA-F (gtctagaGACGGAGCTTCTTCAGCTGG), CA-R (ggagctcAATAAAATAAGCATCTATG)和 SPusp45-F(cgaattcCATGGTGAAAAAAAAGATTATCTCAGC)，SPusp45-R (ggggtaccCAGCGTAAACACCTGACAAC)為引物，以PCR的方法擴(kuò)增錨定蛋白基因ca (GenBank:U17696.1)和信號(hào)肽序列SPusp45(GeneBank:EU382094.1),經(jīng)1%瓊脂糖電泳后回收得到目的片段，分別經(jīng)內(nèi)切酶Xba1、SacI和Nco1、KpnI處理后得到目的片段-ca和-SPusp45 ;然后與質(zhì)粒片段pNZ8148連接后得到質(zhì)粒pNZ8148-AD，電轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌NZ9000中，得到重組菌株L.lactis AD (保藏號(hào)為CGMCCN0.8221)。該菌株已于2013年9月18日交由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保減。
[0039]3、重組乳酸乳球菌L.lactis AD中過(guò)敏原Derp2的檢測(cè)
[0040]重組乳酸乳球菌L.lactis AD活化后，按1:50接種于50ml GMl7培養(yǎng)基(1000ml培養(yǎng)基:胰蛋白胨5g,大豆蛋白胨5g,牛肉膏5g,酵母粉2.5g, β -磷酸甘油二鈉19g,維生素 C0.5g，lM MgSO4 1ml，葡萄糖 5g)中(含 10 μ g/ml 的氯霉素)，在 30°C培養(yǎng)至 OD6tltl=0.5，jjPA nisin (Sigma-Aldrich)至終濃度 10ng/ml,誘導(dǎo)培養(yǎng) 6 小時(shí)后；8000rpm 離心 5min,收集菌體。[0041]蛋白的處理:取誘導(dǎo)后的菌液10ml，4°C，4300g離心5min分離菌體；菌體沉淀用TES緩沖液(50mM Tris-HCl，ImMEDTA，20%蔗糖)洗滌兩次；菌體用200 μ ITES-LMR緩沖液(30mg/ml溶菌酶，0.lmg/ml RNase)懸??；37°C溫浴3h，期間混勻數(shù)次，使TES-LMR充分消化細(xì)胞壁；4°C，13000g離心lOmin，取上清，菌體沉淀保存?zhèn)溆茫簧锨逡褐屑尤腩A(yù)冷的100%TCA40 μ 1，使其終濃度為16%，以沉淀細(xì)胞壁釋放的蛋白質(zhì)，冰浴20min，4°C 11500g離心lOmin，棄上清液；沉淀用100 μ I 50mMNa0H懸浮，4°C作用12h后離心取上清，加入2xloadingbuffer 煮沸；
[0042]所有樣品取15 μ I上樣，經(jīng)5-12%SDS_PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF(Millipore公司，美國(guó))膜上，分別用Derp2特異性多克隆抗體(一抗)(京天成生物技術(shù)(北京)有限公司)及HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(二抗)(Thermo，美國(guó))雜交后，加入eECL顯色液(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)避光顯色，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。
[0043]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1號(hào)泳道可檢測(cè)到蛋白信號(hào)(陽(yáng)性對(duì)照)，分子量大小17KDa左右；2號(hào)泳道可在43KDa位置處檢測(cè)到明顯的信號(hào)，與預(yù)期分子量大小類(lèi)似(融合蛋白的總分子量為43KDa左右)，同時(shí)在3，4號(hào)泳道檢測(cè)不到信號(hào)；結(jié)果說(shuō)明過(guò)敏原Derp2蛋白可以在重組菌株L.lactis AD表面特異性表達(dá)。
[0044]4、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0045]參見(jiàn)圖3，進(jìn)行小鼠屋塵螨過(guò)敏模型的構(gòu)建，具體的構(gòu)建過(guò)程分為三個(gè)階段:首先在0-4天及7-11天進(jìn)行灌胃預(yù)防處理(200 μ I菌體或生理鹽水);在第17、24、31天進(jìn)行腹腔注射Derp2/Alum (Pierce，美國(guó))(200 μ I)的混合物，使小鼠產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)；最后一個(gè)階段為霧化階段，通過(guò)霧化激發(fā)器將Derp2蛋白進(jìn)行霧化，使小鼠通過(guò)自然呼吸的方式吸入體內(nèi)。
[0046]小鼠灌胃乳酸乳球菌的制備:乳酸乳球菌L.lactis AD活化后，按照1:50的比例接入GM17培養(yǎng)基中(加入10 μ g/ml氯霉素)進(jìn)行培養(yǎng)，至OD=0.5左右，加入nisin至終濃度10ng/ml，30°C培養(yǎng)6h后，8000rpm5min離心收集菌體，用預(yù)冷的滅菌的生理鹽水洗滌2遍后，加入一定體積的生理鹽水，調(diào)整菌落數(shù)為lX101(lCFU/ml，取200μ I進(jìn)行小鼠灌胃。
[0047]實(shí)驗(yàn)組的設(shè)計(jì):[0048]陽(yáng)性模型組:生理鹽水灌胃，然后腹腔注射處理；
[0049]ND, AD 和 8148 組:分別用重組菌株 L.lactis ND, L.lactis AD 和 L.1actis8148(空質(zhì)粒)進(jìn)行灌胃，并且進(jìn)行腹腔注射處理；
[0050]陰性模型組:只用生理鹽水灌胃處理，然后生理鹽水進(jìn)行腹腔注射。
[0051]5、過(guò)敏原Derp2特異性抗體的測(cè)定
[0052]在實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死小鼠時(shí)，取小鼠血液，然后室溫靜置2h，4000rpm離心lOmin，取上層血清，采用ELISA方法測(cè)定其中過(guò)敏原特異性抗體的濃度。
[0053]實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論:發(fā)現(xiàn)口服重組乳酸乳球菌L.lactis AD可明顯降低小鼠體內(nèi)Derp2特異性IgE的濃度(參見(jiàn)圖4A)，同時(shí)提高特異性IgG2a濃度(參見(jiàn)圖4B);結(jié)果說(shuō)明口服重組乳酸乳球菌L.lactis AD可通過(guò)調(diào)整血液中特異性抗體的濃度來(lái)抑制過(guò)敏反應(yīng)。
[0054](1)包被:用包被緩沖液(1000ml 含 Na2CO3L 59g ；NaHC032.93g，ph 調(diào)至 9.6)將提取的Derp2蛋白稀釋到10μ g/ml，每孔加入100 μ I后4°C包被過(guò)夜。次日棄去孔內(nèi)液體，用PBST (1000ml 0.1M的PBS緩沖液中加入Iml Tween20)洗滌3次，每次3min。
[0055](2)封閉:酶標(biāo)板加樣孔干燥后每孔加入100 μ I封閉液(Ig牛血清蛋白溶解到100ml的0.1MPBS緩沖液中)，37°C封閉2h，然后用同樣方法洗滌3次。
[0056](3)加樣:加100 μ I適度稀釋的小鼠血清于已包被的反應(yīng)孔中，分別設(shè)置空白對(duì)照和陰性對(duì)照(PBS對(duì)照組血清)，37°C保溫Ih后同樣方法洗滌。
[0057](4)加酶標(biāo)二抗:每孔加入100 μ I新鮮稀釋的酶標(biāo)二抗(IgE和IgG2a)(SouthernBiotech，美國(guó))，37°C保溫lh，用PBST洗滌2次，最后用不含Tween-20的PBS洗漆一次。
[0058](5)加底物液顯色:向每孔中加入新鮮配置的TMB底物溶液(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，每孔100 μ 1，室溫暗處?kù)o置反應(yīng)15min。
[0059](6)終止反應(yīng)及檢測(cè):向各反應(yīng)孔中加入2M H2S0450 μ 1，輕敲酶標(biāo)板使其均勻混合以終止反應(yīng)，然后在15min內(nèi)將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))上，于450nm處讀取各孔的OD值。
[0060]6、肺部的組織切片
[0061]取新鮮的小鼠肺部，用生理鹽水沖洗掉多余的血液，然后放入10%的多聚甲醛中保存過(guò)夜，然后用大量的清水沖洗，將多聚甲醛沖洗干凈，然后用75%的乙醇保存，然后經(jīng)脫水、包埋及切片染色后，用光學(xué)顯微鏡觀察肺部的組織形態(tài)。
[0062]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:通過(guò)HE染色和甲苯胺藍(lán)染色，我們發(fā)現(xiàn)服用重組乳酸乳球菌L.1actisAD的實(shí)驗(yàn)小鼠肺部?jī)?nèi)的炎癥細(xì)胞和肥大細(xì)胞的數(shù)目要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于陽(yáng)性對(duì)照組，參見(jiàn)圖5-1和5-2 ；
[0063]實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明口服重組乳酸乳球菌L.lactis AD可抑制炎癥細(xì)胞在炎癥部位的聚集。
[0064]7、脾臟淋巴細(xì)胞種群的分析
[0065]取新鮮的小鼠脾臟，采用機(jī)械破碎(研磨)的方法獲得單細(xì)胞懸浮液，然后采用FITC標(biāo)記的⑶4抗體和PE標(biāo)記的Foxp3抗體進(jìn)行染色(兩種抗體均來(lái)源于eBioscience公司)，具體的實(shí)驗(yàn)操作方法為eBioscience推薦的最優(yōu)方法；細(xì)胞染色后用流式細(xì)胞儀(BDBioscience)進(jìn)行細(xì)胞種群的分析,如圖6所示。[0066]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:通過(guò)對(duì)脾臟內(nèi)淋巴細(xì)胞的染色分析發(fā)現(xiàn)，口服重組乳酸乳球菌可以明顯提高脾臟內(nèi)的CD4+Foxp3+細(xì)胞的數(shù)目；此外，相比胞內(nèi)表達(dá)過(guò)敏原的重組乳酸乳球菌L.1actis ND,錨定表達(dá)過(guò)敏原的重組乳酸乳球菌L.lactis AD可以刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的CD4+Foxp3+ 細(xì)胞。
[0067]實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明口服重組乳酸乳球菌可以通過(guò)增加免疫系統(tǒng)內(nèi)⑶4+FoXp3+細(xì)胞的數(shù)目，抑制過(guò)敏疾病的發(fā)生；此外，過(guò)敏原在細(xì)胞表面表達(dá)比在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)具有更好的保護(hù)作用。
[0068]結(jié)論:[0069]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，口服本發(fā)明的重組乳酸乳球菌L.lactis AD可通過(guò)降低小鼠血清中Derp2特異性IgE的水平、增加脾臟內(nèi)CD4+FoXp3+細(xì)胞的數(shù)目及降低炎癥細(xì)胞在發(fā)炎部位的聚集的方式降低實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)的屋塵螨過(guò)敏反應(yīng)；相比胞內(nèi)表達(dá)過(guò)敏原的重組菌株，表面展示表達(dá)過(guò)敏原的重組菌株L.lactis AD具有更好的效果。
【權(quán)利要求】
1.一種基因優(yōu)化的屋塵螨過(guò)敏原Derp2，該過(guò)敏原基因mderp2的序列為SEQ ID N0.1。
2.如權(quán)利要求1所述的基因優(yōu)化的屋塵螨過(guò)敏原Derp2，其特征在于所述過(guò)敏原基因mderp2是通過(guò)對(duì)來(lái)源于屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的主要過(guò)敏原Derp2的天然基因序列SEQ ID N0.2進(jìn)行基因優(yōu)化后獲得的。
3.—種錨定表達(dá)基因優(yōu)化的屋塵螨過(guò)敏原Derp2的重組乳酸乳球菌Lactococcuslactis AD，于2013年9月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCN0.8221。
4.如權(quán)利要求3所述的錨定表達(dá)基因優(yōu)化的屋塵螨過(guò)敏原Derp2的重組乳酸乳球菌L.lactis AD，其特征在于所述菌株是通過(guò)將優(yōu)化后的過(guò)敏原基因mderp2克隆到乳酸乳球菌的表達(dá)質(zhì)粒PNZ8148上，構(gòu)建錨定表達(dá)型質(zhì)粒pNZ8148-AD，再將獲得的錨定表達(dá)型質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入宿主菌株L.lactis NZ9000而獲得的。
5.將權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)所述的過(guò)敏原用于預(yù)防屋塵螨過(guò)敏疾病的用途。
6.將權(quán)利要求3或4中任意一項(xiàng)所述的乳酸乳球菌用于預(yù)防屋塵螨過(guò)敏疾病的用途。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK103642814SQ201310646395
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】陳衛(wèi), 張秋香, 艾春青, 王剛, 田豐偉, 劉小鳴, 趙國(guó)忠, 趙建新, 張灝, 郭敏 申請(qǐng)人:江南大學(xué)