一種轉(zhuǎn)Cry1Ab抗蟲基因水稻品系mfb-MH3301的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)Cry1Ab抗蟲基因水稻品系mfb-MH3301的檢測(cè)方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。所述方法是轉(zhuǎn)化體mfb-MH3301中外源基因Cry1Ab及其表達(dá)框在水稻染色體上插入片段及其旁側(cè)特異序列SEQ?ID?NO:1及基于該序列建立的特異性PCR擴(kuò)增鑒定技術(shù)。PCR所用正向引物依據(jù)SEQ?ID?NO:1中1-500位序列設(shè)計(jì)，反向引物依據(jù)SEQ?ID?NO:1中501-2000位序列設(shè)計(jì)。該P(yáng)CR方法可作為鑒定轉(zhuǎn)基因水稻品系mfb-MH3301及該品系的衍生系的有效手段。
【專利說明】—種轉(zhuǎn)CryIAb抗蟲基因水稻品系mfb_MH3301的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及鑒定轉(zhuǎn)CrylAb抗蟲基因水稻品系mfb-MH3301及其衍生品系的檢測(cè)方法及其所依賴的轉(zhuǎn)化體特異序列。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是我國乃至世界最主要的糧食作物之一。水稻也是蟲害發(fā)生較為嚴(yán)重的作物之一。我國水稻田間害蟲有600多種上，其中分布廣泛且為害較為嚴(yán)重的是二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等鱗翅目害蟲。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年我國由蟲害造成的損失占水稻總產(chǎn)量的5%以上，高達(dá)一千萬噸，每年用于水稻害蟲防治的費(fèi)用都在135億元人民幣以上。而在水稻品種及野生稻中沒有抗鱗翅目害蟲的種質(zhì)資源可以利用。以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為核心的品種設(shè)計(jì)技術(shù)可以將遠(yuǎn)緣物種的抗性基因?qū)胨局?，從而使現(xiàn)有品種獲得高抗蟲特性。目前已經(jīng)有多個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻品系獲準(zhǔn)進(jìn)入環(huán)境釋放和生產(chǎn)性試驗(yàn)。對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的有效監(jiān)管是轉(zhuǎn)基因作物安全利用的前提和保障。轉(zhuǎn)基因作物外源序列插入片段旁側(cè)序列是轉(zhuǎn)基因植物品系的最重要的分子身份證。因此，依據(jù)外源插入片段的旁側(cè)序列是建立轉(zhuǎn)基因作物品系特異性檢測(cè)方法的重要技術(shù)資料。
[0003]mfb-MH3301是福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所和中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所共同研發(fā)的抗二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟以及大螟的具有廣泛應(yīng)用前景的轉(zhuǎn)基因水稻品系。利用插入位 點(diǎn)旁側(cè)序列特異性地鑒定轉(zhuǎn)基因品種(品系)是目前鑒定轉(zhuǎn)基因作物最可靠最特異的檢測(cè)方法，是準(zhǔn)確鑒別區(qū)分同一轉(zhuǎn)化體及其衍生品系的方法。
[0004]利用插入位點(diǎn)旁側(cè)序列鑒定轉(zhuǎn)基因品系，該方法已在鑒定克螟稻、Bt汕優(yōu)63、科豐6號(hào)和科豐8號(hào)品系中建立。mfb-MH3301是最新研發(fā)的抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻品系，尚無任何相關(guān)轉(zhuǎn)基因水稻mfb-MH3301外源基因插入片段的旁側(cè)序列文章報(bào)道和專利。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)CrylAb抗蟲基因水稻品系mfb_MH3301的檢測(cè)方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，利用插入位點(diǎn)旁側(cè)序列特異性地鑒定轉(zhuǎn)基因品種(品系)是目前鑒定轉(zhuǎn)基因作物最可靠最特異的檢測(cè)方法，是準(zhǔn)確鑒別區(qū)分同一轉(zhuǎn)化體及其衍生品系的方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
所述方法是轉(zhuǎn)化體mfb-MH3301中外源基因CrylAb及其表達(dá)框在水稻染色體上插入片段及其旁側(cè)特異序列SEQ ID NO:1及基于該序列建立的特異性PCR擴(kuò)增鑒定技術(shù)。
[0007]所述旁側(cè)序列為L(zhǎng)B端旁側(cè)序列，其LB端旁側(cè)序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]依據(jù)LB端旁側(cè)序列設(shè)計(jì)的特異性引物為:
正向引物 G92:5’ -GAGACATTAGTAGGCAGGAC-3’ ；
反向引物 Bb3301-Ll:5’ -CGAGACATAACTGACAGAGGAGG-3’ 或 Bb3301-L2:5’ -CTACTCTATCGTTGTTTTTGAC-3’ 或Bb3301-L3:5’ -TCTTCATCTGAGCAAACATAAAC-3’。
[0009]所述特異性引物中一條引物為依據(jù)SEQ ID NO:1中1-500位序列設(shè)計(jì)的正向引物；另一條引物為依據(jù)SEQ ID NO:1中501-2000序列設(shè)計(jì)的三條反向引物中的任一條。
[0010]轉(zhuǎn)基因水稻mfb-MH3301及其衍生品系的外源插入片段的旁側(cè)序列的PCR檢測(cè)方法，所述PCR擴(kuò)增條帶中含有SEQ ID NO:1中的一段序列。
[0011]依賴于外源基因插入片段旁側(cè)序列的轉(zhuǎn)CrylAb基因水稻品系mfb_MH3301的PCR檢測(cè)方法，可依據(jù)LB旁側(cè)序列檢測(cè)I個(gè)插入在水稻9號(hào)染色體上的位置。上述I對(duì)引物可用于轉(zhuǎn)基因水稻mfb-MH3301及其衍生品系的定性PCR檢測(cè)。
[0012]轉(zhuǎn)基因水稻mfb_MH3301所用載體見圖1，用于轉(zhuǎn)化目的基因CrylAb和選擇標(biāo)記基因hpt分別位于不同的二個(gè)獨(dú)立T-DNA區(qū)域，其中一個(gè)T-DNA區(qū)含有35S啟動(dòng)子和選擇標(biāo)記基因hpt ;另一個(gè)T-DNA區(qū)含有2條核基質(zhì)結(jié)合區(qū)MAR系列、Ubi啟動(dòng)子和目的基因CryIAb。
[0013]本發(fā)明采用常規(guī)方法提取轉(zhuǎn)基因水稻mfb_MH3301 DNA,利用Tail-PCR方法擴(kuò)增得到LB旁側(cè)序列2000bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，該序列包括水稻基因組序列，位于水稻第9號(hào)染色體(GeneBank ID: NC-008402.2 )的7709771-7710270位，其核苷酸序列與SEQ ID NO:1中1-500位的核苷酸序列完全相同；該序列還包括了轉(zhuǎn)化載體pCDMARUBb-Hyg的部分序列，其核苷酸序列與SEQ ID NO:1中501-2000位的核苷酸序列完全相同。
[0014]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因水稻mfb_MH3301外源基因插入位點(diǎn)的左邊界旁側(cè)序列，以及基于這段序列的轉(zhuǎn)化事件特異檢測(cè)方法，為轉(zhuǎn)基因水稻mfb-MH3301品系及其衍生系提供了分子特征和特異的檢測(cè)手段。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1:轉(zhuǎn)化載體pCDMARUBb-Hyg的T-DNA區(qū)域結(jié)構(gòu)示意圖。
[0016]圖2:mfb-MH3301 LB 邊界 Tail-PCR 擴(kuò)增電泳圖。1:Tail_PCR 第一輪產(chǎn)物；11:Tail-PCR 第二輪產(chǎn)物；111:Tai1-PCR 第三輪產(chǎn)物;Μ: λ -EcoT14 Marker。
[0017]圖3:水稻mfb_MH3301外源基因插入旁側(cè)序列定性PCR檢測(cè)電泳圖。1_3泳道:三條反向特異性引物Bb3301-Ll、Bb3301-L2、Bb3301_L3分別與正向特異性引物G92組合對(duì)mfb-MH3301品系DNA特異性擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出1260bp 1150bp 1034bp大小的特異性條帶；M:DL2000 Marker。
[0018]圖4:水稻mfb_MH3301外源基因插入旁側(cè)序列特異性定性PCR檢測(cè)電泳圖，采用正向特異性引物G92與反向特異性引物Bb3301-L3組合對(duì)mfb_MH3301及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ臻}恢3301進(jìn)行的PCR鑒定，mfb-MH3301擴(kuò)增出1034bp大小的特異性擴(kuò)增條帶，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ臻}恢3301沒有擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。泳道I:mfb-MH3301 ；泳道2:閩恢3301 ； Μ:λ -EcoTHMarker0
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例1.轉(zhuǎn)基因水稻mfb_MH3301外源基因插入位點(diǎn)旁側(cè)序列克隆 一、實(shí)驗(yàn)材料
1.植物材料:轉(zhuǎn)基因水稻mfb-MH33012.試劑:
1)Taq DNA Ploymerase:天根(TIANGEN)生化科技(北京)有限公司提供
2)PCR擴(kuò)增引物:生工生物工程(Sangon)(上海)有限公司合成
3)上樣緩沖液:10XLoadingBuffer，寶生物工程(TaKaRa)(大連)有限公司提供
4)Agarose:西班牙瓊脂 糖，BIOffEST公司提供
3.實(shí)驗(yàn)儀器
1)高速/ 冷凍高速離心機(jī):Eppenddorf Centrifuge 5415D、Eppenddorf Centrifuge5424、Eppenddorf Centrifuge 5804R
2)PCR儀:GeneAmp PCR System Perkin-Elmer 9600、GeneAmp PCR System2700>BIO-RAD Dyad Disciple Thermal Cycler PTC-0221、Eppendorf Mastercycler pro S
3)電泳儀系統(tǒng):B10_RADPowerPac Basic 電源、BIO-RAD PowerPac Universal 電源、BIO-RAD sub-cell GT 水平電泳槽、BIO-RAD Wide Min1-sub cell 水平電泳槽
4)凝膠成像系統(tǒng):AlphaInnotech FluorChem SP (突光/化學(xué)光/可見光凝膠成像系
統(tǒng))
5)移液器:EppendorfResearch可調(diào)量程移液器 二、實(shí)驗(yàn)方法
1.水稻DNA提取
I)將2XCTAB溶液置于65°C水浴中預(yù)熱。
[0020]2)摘取新鮮的水稻葉片或凍存于_20°C的水稻葉片l_3cm，置于1.5mL EP管中，加入適量液氮，用洗凈晾干的尖頭玻璃棒研磨至粉末狀。
[0021]3)向EP管中中加入600 μ L預(yù)熱的2 X CTAB溶液，混勻。
[0022]4)將EP管置于65°C水浴中溫育20分鐘，期間顛倒I次。
[0023]5)從水浴中取出EP管，加入等量氯仿:異戊醇(24:1)，用力上下顛倒或渦旋混勻，至下層液相呈現(xiàn)深綠色。
[0024]6)于室溫條件靜置10分鐘，10，OOOrpm,離心10分鐘。
[0025]7)將上層水相上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL EP管中，加入2倍體積預(yù)凍的無水乙醇，輕輕顛倒混勻后置于一 20°C冰箱沉淀30-60分鐘。
[0026]8)沉淀結(jié)束后，10, OOOrpm,離心10分鐘,小心棄上清。
[0027]9)加入ImL 75%乙醇，渦旋洗滌沉淀。
[0028]10) 5，OOOrpm,離心3分鐘，收集DNA，小心棄液體，剩余少量液體短暫離心,然后用槍頭吸出。
[0029]11)室溫自然干燥，或置于通風(fēng)處吹干。
[0030]12)加入ddH20或TE (pH8.0)，充分溶解，置4°C備用。
[0031]2.旁側(cè)序列擴(kuò)增
米用熱不對(duì)稱交錯(cuò) PCR (Thermal Asymmetric Interlaced PCR, Tail-PCR)擴(kuò)增與已知DNA序列鄰接的未知旁側(cè)序列。根據(jù)已知載體pCDMARUBb-Hyg序列，設(shè)計(jì)了 3條左邊界嵌套的特異引物Bb3301-Ll、Bb3301-L2和Bb3301_L3依次與簡(jiǎn)并引物ADlO組合進(jìn)行三輪擴(kuò)增。引物序列見表1。
[0032]表1.用于Tail-PCR和mfb_MH3301特異性鑒定的引物
【權(quán)利要求】
1.一種轉(zhuǎn)CrylAb抗蟲基因水稻品系mfb_MH3301的檢測(cè)方法，其特征在于:所述方法是轉(zhuǎn)化體mfb-MH3301中外源基因CrylAb及其表達(dá)框在水稻染色體上插入片段及其旁側(cè)特異序列。
2.一種如權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)CrylAb抗蟲基因水稻品系mfb_MH3301的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的旁側(cè)特異序列所述旁側(cè)序列為L(zhǎng)B端旁側(cè)序列，其LB端旁側(cè)序列如SEQ ID NO:1 所示。
3.一種如權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)CrylAb抗蟲基因水稻品系mfb_MH3301的檢測(cè)方法，其特征在于:依 據(jù)LB端旁側(cè)序列設(shè)計(jì)的特異性引物為:
正向引物 G92:5’ -GAGACATTAGTAGGCAGGAC-3’ ； 反向引物 Bb3301-Ll:5’ -CGAGACATAACTGACAGAGGAGG-3’ 或 Bb3301-L2:5’ -CTACTCTATCGTTGTTTTTGAC-3’ 或 Bb3301-L3:5’ -TCTTCATCTGAGCAAACATAAAC-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種轉(zhuǎn)CrylAb抗蟲基因水稻品系mfb_MH3301的檢測(cè)方法，其特征在于:所述特異性引物中一條引物為依據(jù)SEQ ID NO:1中1-500位序列設(shè)計(jì)的正向引物；另一條引物為依據(jù)SEQ ID NO:1中501-2000位序列設(shè)計(jì)的三條反向引物中的任一條。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103667476SQ201310650382
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】蘇軍, 顏靜宛, 王 鋒, 胡太蛟, 陳在杰, 林智敏, 李剛 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所