微陣列芯片檢測中核苷酸序列的顆粒標(biāo)記方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微陣列芯片檢測中核苷酸序列的顆粒標(biāo)記方法。本發(fā)明公開的一種在利用微陣列芯片檢測靶標(biāo)分子的方法包括如下步驟：顆粒表面包被上若干個功能基團(tuán)，記作功能化顆粒；每種靶標(biāo)分子都標(biāo)記有修飾基團(tuán)，記作修飾化靶標(biāo)分子；所述功能基團(tuán)與所述修飾基團(tuán)能夠結(jié)合；利用功能化顆粒和發(fā)光基團(tuán)使每種修飾化靶標(biāo)分子都能發(fā)光，從而實現(xiàn)對靶標(biāo)分子的標(biāo)記。本發(fā)明公開的顆粒標(biāo)記方法可以直接或間接對靶標(biāo)分子進(jìn)行熒光標(biāo)記，這種標(biāo)記方法不但能夠大幅度的降低熒光檢測的成本，同時避免了傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記方法在利用PCR富集靶標(biāo)核酸分子過程中的抑制作用。
【專利說明】微陣列芯片檢測中核苷酸序列的顆粒標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微陣列芯片檢測中核苷酸序列的顆粒標(biāo)記方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近幾年微陣列芯片技術(shù)的發(fā)展使得高通量地并行分析成千上萬的分子相互作用成為可能。DNA微陣列芯片方法已被廣泛使用，包括基因表達(dá)分析、突變分型、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)，對藥物開發(fā)、疾病診斷和司法鑒定起到重要作用。固定于微陣列芯片的特定核苷酸探針，充當(dāng)解碼工具，通過空間上不同的位置把溶液中并行反應(yīng)產(chǎn)生的多個靶標(biāo)分子加以區(qū)別。這些探針甚至可以是通用探針，比如通用芯片上經(jīng)過設(shè)計與人工合成的人造標(biāo)簽(Tag)序列或者相互補的序列。微陣列芯片方法與多重PCR結(jié)合在一起，可用于檢測SNP與基因突變，包括堿基刪除、插入、以及長片段缺失，適用于常規(guī)的遺傳和診斷實驗室開展。
[0003]與此同時，蛋白芯片和化學(xué)芯片也已經(jīng)發(fā)展成為蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域兩個重要的工具。結(jié)合多重PCR方法，特定的蛋白質(zhì)、抗體、小分子化合物、多肽及碳水化合物都可以固定在固體表面形成微陣列芯片，類似于DNA微陣列芯片。這些分子的微陣列芯片可以用于分析單一的分子組成或者復(fù)雜的分子組成。
[0004]待檢樣本和固定在微陣列芯片表面的探針之間的相互作用可以通過多種方法加以檢測。通常情況下，微陣列芯片的檢測方法有基于熒光、化學(xué)發(fā)光或酶聯(lián)標(biāo)記的光學(xué)檢測方法，基于酶標(biāo)記、二茂鐵標(biāo)記或其他電活性標(biāo)記的電化學(xué)檢測方法，以及基于表面等離子共振技術(shù)或微天平分析技術(shù)的無標(biāo)記的檢測方法。為了進(jìn)一步簡化分析步驟和減少對儀器設(shè)備的依賴，磁珠標(biāo)記方法也被采用，其結(jié)果可以用基于電荷耦合器件(CCD)的相機(jī)、攝像機(jī)或低倍顯微鏡進(jìn)行成像分析，而且交叉反應(yīng)和非特異性吸附能通過磁場或流體來快速地加以消除。用磁珠檢測微陣列雜交DNA開辟了一條新的途徑，在不需要對溶液中DNA的濃度進(jìn)行精準(zhǔn)的同時，實現(xiàn)常規(guī)的雜交試驗。
[0005]熒光分子的應(yīng)用提高了靶標(biāo)分子與微陣列芯片結(jié)合的檢測能力，當(dāng)熒光分子同目標(biāo)分子綁定后，顯示出了不同的信號強(qiáng)度和發(fā)射光譜。將熒光分子標(biāo)記在特異擴(kuò)增靶標(biāo)片段的引物上，通過不對稱聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)富集靶標(biāo)核酸片段，在各種SNP位點和基因突變的檢測方面已得到了廣泛的應(yīng)用。但對于少量的臨床樣本，檢測精度極端重要，單步不對稱PCR由于其較低的靈敏度不能完成少量樣品的檢測。對于其他類型的檢測同樣也會因樣本量太少無法獲得足夠的熒光信號強(qiáng)度，從而導(dǎo)致無法得到相應(yīng)的檢測結(jié)果。
[0006]以前的工作中提到的另一種方法是采用微球，優(yōu)選順磁性微粒，由于其易于處理和良好的生物相容性，能夠使靈敏度進(jìn)一步提高。通過對微球和標(biāo)記了熒光的靶標(biāo)分子進(jìn)行修飾，便可以使突光標(biāo)記分子可以I禹合到磁珠上，這樣每一個磁珠同時偶聯(lián)大量的突光分子，從而獲得較高強(qiáng)度的發(fā)光能力的個體與微陣列芯片上面的探針進(jìn)行雜交，從而獲得對靶標(biāo)分子的檢測結(jié)果。目前這種方法主要應(yīng)用于核酸分子檢測當(dāng)中，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行靶標(biāo)分子的富集，在進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)過程中所添加到引物均進(jìn)行了熒光分子和能與順磁性微粒相結(jié)合的化學(xué)修飾的雙標(biāo)記，以達(dá)到獲得熒光信號的目的。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)是將熒光分子標(biāo)記在每一個靶標(biāo)分子上，如:聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)過程中添加的弓I物均進(jìn)行了熒光分子和能與順磁性微粒相結(jié)合的化學(xué)修飾的雙標(biāo)記，這種標(biāo)記方法，檢測成本過高，在富集靶標(biāo)核酸分子方面也存在一定的抑制作用。理論上，靶標(biāo)分子均需進(jìn)行相應(yīng)的化學(xué)修飾，以便能夠與順磁性微粒相偶聯(lián)，而在對靶標(biāo)分子進(jìn)行熒光標(biāo)記可以采用不同方式來實現(xiàn)，并非是要全部并直接的將熒光分子標(biāo)記到靶標(biāo)分子上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種微陣列芯片檢測中核苷酸序列的顆粒標(biāo)記方法。
[0009]本發(fā)明提供了一種在利用微陣列芯片檢測靶標(biāo)分子的方法中對靶標(biāo)分子進(jìn)行標(biāo)記的方法，該方法涉及到微陣列芯片和靶標(biāo)分子；微陣列芯片上連接有若干種探針；靶標(biāo)分子是若干種靶標(biāo)分子的混合物，每種靶標(biāo)分子中含有能與芯片上的某種探針結(jié)合的序列、還含有待測靶標(biāo)位點的序列，一種靶標(biāo)分子對應(yīng)一種探針；
[0010]該方法包括如下步驟:顆粒表面包被上若干個功能基團(tuán)，記作功能化顆粒；每種靶標(biāo)分子都標(biāo)記有修飾基團(tuán)，記作修飾化靶標(biāo)分子；所述功能基團(tuán)與所述修飾基團(tuán)能夠相互作用；利用功能化顆粒和發(fā)光基團(tuán)使每種修飾化靶標(biāo)分子都能發(fā)光，從而實現(xiàn)對靶標(biāo)分子的標(biāo)記。
[0011]上述方法中，所述利用功能化顆粒和發(fā)光基團(tuán)使每種修飾化靶標(biāo)分子都能發(fā)光的方法為如下(I)- (5)中任一所述的方法:
[0012](I)將修飾化靶標(biāo)分子混合物中的一種修飾化靶標(biāo)分子進(jìn)行發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記，記作修飾化且發(fā)光化靶標(biāo)分子；將除修飾化且發(fā)光化靶標(biāo)分子之外的其它修飾化靶標(biāo)分子混合物、修飾化且發(fā)光化靶標(biāo)分子、功能化顆粒共同孵育，通過功能基團(tuán)與修飾基團(tuán)的相互作用從而實現(xiàn)靶標(biāo)分子與顆粒的連接，每個顆粒上連接若干個靶標(biāo)分子，從而實現(xiàn)每種靶標(biāo)分子都能發(fā)光；
[0013]修飾化且發(fā)光化靶標(biāo)分子與除修飾化且發(fā)光化靶標(biāo)分子之外的其它修飾化靶標(biāo)分子混合物均勻混合，當(dāng)該均勻混合物與功能化顆粒共同孵育時，得到的每一個功能化顆粒上均會連接有修飾化且發(fā)光化靶標(biāo)分子，從而實現(xiàn)結(jié)合在功能化顆粒的每種靶標(biāo)分子都能發(fā)光；
[0014](2)在功能化顆粒上的功能基團(tuán)上標(biāo)記發(fā)光基團(tuán)，記作功能化且發(fā)光化顆粒；將修飾化靶標(biāo)分子混合物與功能化且發(fā)光化顆粒孵育，通過功能基團(tuán)與修飾基團(tuán)的相互作用從而實現(xiàn)靶標(biāo)分子與顆粒的連接，每個顆粒上連接若干個靶標(biāo)分子，從而實現(xiàn)每種靶標(biāo)分子都能發(fā)光；
[0015](3)在功能化顆粒的內(nèi)部標(biāo)記上發(fā)光基團(tuán)，記作功能化且發(fā)光化顆粒；將修飾化靶標(biāo)分子混合物與功能化且發(fā)光化顆粒孵育，通過功能基團(tuán)與修飾基團(tuán)的相互作用從而實現(xiàn)靶標(biāo)分子與顆粒的連接，每個顆粒上連接若干個靶標(biāo)分子，從而實現(xiàn)每種靶標(biāo)分子都能發(fā)光;
[0016](4)制備無關(guān)分子，該無關(guān)分子不含有靶標(biāo)位點序列且不能與探針結(jié)合，該無關(guān)分子被標(biāo)記上與修飾化靶標(biāo)分子同樣的修飾基團(tuán)，同時標(biāo)記發(fā)光基團(tuán)，記作修飾化且發(fā)光化無關(guān)分子；將修飾化靶標(biāo)分子混合物、修飾化且發(fā)光化無關(guān)分子、功能化顆粒共同孵育，每個顆粒連接有若干個靶標(biāo)分子和無關(guān)分子，從而實現(xiàn)每種靶標(biāo)分子都能發(fā)光；
[0017]修飾化靶標(biāo)分子混合物與修飾化且發(fā)光化無關(guān)分子均勻混合，當(dāng)該均勻混合物與功能化顆粒共同孵育時，得到的每一個功能化顆粒上均會帶有修飾化且發(fā)光化無關(guān)分子，從而實現(xiàn)結(jié)合在功能化顆粒的每種靶標(biāo)分子都能發(fā)光；
[0018](5)制備結(jié)合分子，該結(jié)合分子與靶標(biāo)分子混合物中的一種靶標(biāo)分子結(jié)合、但不與探針序列結(jié)合，該結(jié)合分子不連接修飾基團(tuán)但是連接發(fā)光基團(tuán)，記作發(fā)光化結(jié)合分子；將功能化顆粒和修飾化靶標(biāo)分子混合物共同孵育，得到孵育產(chǎn)物；將孵育產(chǎn)物與發(fā)光化結(jié)合分子混勻，使每個顆粒上連接若干個靶標(biāo)分子，每個顆粒上都有一種靶標(biāo)分子與所述發(fā)光化結(jié)合分子，從而實現(xiàn)每種靶標(biāo)分子都能發(fā)光。
[0019]上述任一所述的方法中，所述方法(I )、方法(4)或方法(5)的發(fā)光基團(tuán)是通過PCR的方法合成到所述方法(I)的靶標(biāo)分子混合物中的一種靶標(biāo)分子、所述方法(4)的無關(guān)分子或所述方法(5)的結(jié)合分子上的；
[0020]所述PCR的方法是利用一條引物含有發(fā)光基團(tuán)，另一條引物不進(jìn)行任何標(biāo)記的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而得到含有發(fā)光基團(tuán)的所述方法(I)的靶標(biāo)分子混合物中的一種靶標(biāo)分子、所述方法(4)的無關(guān)分子或所述方法(5)的結(jié)合分子上的；
[0021]所述方法(I)和方法(4)的PCR的方法中，所述含有發(fā)光基團(tuán)的引物同時帶有修飾基團(tuán)。
[0022]上述任一所述的方法中，所述靶標(biāo)分子為單鏈核苷酸，所述探針為單鏈核苷酸，所述無關(guān)分子為單鏈核苷酸，結(jié)合分子為單鏈核苷酸。
[0023]上述任一所述的方法中，所述靶標(biāo)分子為多核苷酸、多肽、蛋白或碳水化合物；
[0024]所述多核苷酸具體為通過PCR的方法富集得到的；
[0025]所述功能基團(tuán)為化學(xué)功能基團(tuán)或鏈霉親和素、中性鏈親和素、卵白親合素、鏈親合素或卵黃親合素；
[0026]所述化學(xué)功能基團(tuán)具體為多核苷酸、蛋白、多肽、碳水化合物、醛基，羥基，羧基，酯鍵，氣基，橫酸基或疏基；
[0027]所述發(fā)光基團(tuán)為熒光團(tuán)、磷光團(tuán)或發(fā)色團(tuán)標(biāo)記；
[0028]所述修飾基團(tuán)為生物素、地高辛、多核苷酸、蛋白、多肽或碳水化合物。
[0029]上述任一所述的方法中，所述熒光團(tuán)為量子點、發(fā)光的蛋白質(zhì)或小分子熒光染料。
[0030]上述任一所述的方法中，所述小分子熒光染料為氧雜蒽衍生物、青色素衍生物、萘衍生物、香豆素衍生物、噻二唑衍生物、芘衍生物、惡嗪衍生物、吖啶衍生物、次甲基衍生物、CF染料、Alexa Fluor染料、四氫吡咯衍生物、吖啶橙、DAP1、Hoechst33258、吡羅昔康或奎寧。
[0031]上述任一所述的方法中，所述氧雜蒽衍生物為熒光素、羅丹明、俄勒R綠、曙紅或得克薩斯紅；
[0032]所述青色素衍生物為青色素、吲哚花青綠、羰花青或部花青；
[0033]所述萘衍生物為丹磺酰氯或普羅丹；
[0034]所述芘衍生物為級聯(lián)藍(lán)色；
[0035]所述惡嗪衍生物為尼羅河紅色、藍(lán)色尼羅河、甲酚紫或惡嗪170 ；
[0036]所述吖啶衍生物為二氨基吖啶、吖啶橙或吖啶黃；[0037]所述次甲基衍生物為金胺、結(jié)晶紫或孔雀石綠；
[0038]所述四氫吡咯衍生物為卟吩或膽紅素。
[0039]上述任一所述的方法中，所述磷光團(tuán)為過渡金屬化合物或稀土化合物；
[0040]所述發(fā)色團(tuán)為食品著色劑、織物染料、番茄紅素、β -胡蘿卜素、花青素、葉綠素、血紅蛋白、血藍(lán)蛋白或礦物；
[0041]所述織物染料具體為偶氮化合物；
[0042]所述礦物具體為孔雀石或紫水晶；
[0043]所述顆粒的直徑為0.1微米至10微米；
[0044]所述顆粒為磁性顆粒，具體為順磁性顆粒；
[0045]所述微陣列芯片上的探針分子為多核苷酸，蛋白、多肽或碳水化合物；
[0046]所述微陣列芯片的基底材料為硅，玻璃，塑料，水凝膠，瓊脂糖，硝酸纖維素或尼龍；
[0047]所述微陣列芯片的探針點直徑具體為10微米到5000微米。
[0048]一種利用微陣列芯片檢測靶標(biāo)位點的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，包括如下步驟:
[0049](I)按照權(quán)利要求上述任一所述的方法，實現(xiàn)每種靶標(biāo)分子都能發(fā)光；
[0050](2)再將步驟(I)孵育后的體系與微陣列芯片進(jìn)行孵育，靶標(biāo)分子與芯片上的探針通過相互作用而連接，
[0051](3)檢測芯片的發(fā)光情況，再結(jié)合芯片上的探針，從而判斷連接到芯片上的靶標(biāo)位點種類。
[0052]上述任一所述的方法在微陣列芯片檢測中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0053]本發(fā)明的顆粒標(biāo)記方法具有以下優(yōu)點:
[0054]1、可以直接或間接對靶標(biāo)分子進(jìn)行熒光標(biāo)記，這種標(biāo)記方法不但能夠大幅度的降低熒光檢測的成本，同時避免了傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記方法在利用PCR富集靶標(biāo)核酸分子過程中的抑制作用。
[0055]2、當(dāng)對靶標(biāo)分子中的一種靶標(biāo)分子進(jìn)行發(fā)光標(biāo)記，而并非是對所有的靶標(biāo)分子進(jìn)行發(fā)光標(biāo)記，使得標(biāo)記成本大幅度下降；其次，減少了對擴(kuò)增引物進(jìn)行發(fā)光標(biāo)記，在很大程度上也會降低其對PCR擴(kuò)增效率的抑制。
[0056]3、當(dāng)將發(fā)光標(biāo)記合成到顆粒內(nèi)或者包被在顆粒表面的功能基團(tuán)或無關(guān)分子上或結(jié)合分子上，從根本上解決了抑制PCR擴(kuò)增的問題，同時當(dāng)將發(fā)光標(biāo)記合成到顆粒內(nèi)或者包被在顆粒表面的功能基團(tuán)上或無關(guān)分子上或結(jié)合分子上，所需發(fā)光標(biāo)記的量僅為標(biāo)記一種革El標(biāo)分子的10%。
[0057]4、當(dāng)在微陣列芯片檢測中核苷酸序列的顆粒標(biāo)記方法中引入結(jié)合分子時，結(jié)合分子不連接修飾基團(tuán)但是連接發(fā)光基團(tuán)，由于結(jié)合分子片段短且不攜帶顆粒，能夠使其與靶標(biāo)分子相結(jié)合，從而使得一顆顆粒上的多個靶標(biāo)都能夠結(jié)合到連接了發(fā)光基團(tuán)的結(jié)合分子。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0058]圖1為微陣列芯片排布示意圖。[0059]圖2為實施例2的微陣列芯片檢測結(jié)果。
[0060]圖3為實施例2的方法示意圖。
[0061]圖4為實施例3的微陣列芯片檢測結(jié)果。
[0062]圖5為實施例3的方法示意圖。
[0063]圖6為實施例4的微陣列芯片檢測結(jié)果。
[0064]圖7為實施例4的方法示意圖。
[0065]圖8為實施例5的微陣列芯片檢測結(jié)果。
[0066]圖9為實施例5的方法示意圖。
[0067]圖10為實施例6的微陣列芯片檢測結(jié)果。
[0068]圖11為實施例6的方法示意圖。
【具體實施方式】
[0069]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0070]下述實施例中所用的材料 、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0071]下述實施例以遺傳性耳聾相關(guān)的6個SNP/突變的檢測為例，對本發(fā)明進(jìn)行具體闡述。
[0072]下述實施例用到的微陣列芯片如下:
[0073]—、微陣列芯片中的通用標(biāo)簽陣列是由12個標(biāo)簽探針組成的矩陣，能與下述實施例中的多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng)。
[0074]通用標(biāo)簽陣列的探針依格式進(jìn)行設(shè)計:NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-TagX，其中X是一個I到12的序數(shù)，TagX代表不同的序列。探針5’端有氨基修飾，沿著5’ -3’方向是15個胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸(T15)，再連有Tagl到Tagl2的任一序列。表1中的標(biāo)簽探針中Tagl到Tagl2的核苷酸序列與表2所示引物中的Tagl到Tagl2的核苷酸序列--對應(yīng)。
[0075]通用標(biāo)簽陣列上的探針如表1所示。
[0076]表1通用標(biāo)簽陣列上的探針
[0077]
【權(quán)利要求】
1.一種在利用微陣列芯片檢測靶標(biāo)分子的方法中對靶標(biāo)分子進(jìn)行標(biāo)記的方法，該方法涉及到微陣列芯片和靶標(biāo)分子；微陣列芯片上連接有若干種探針；靶標(biāo)分子是若干種靶標(biāo)分子的混合物，每種靶標(biāo)分子中含有能與芯片上的某種探針結(jié)合的序列、還含有待測靶標(biāo)位點的序列，一種祀標(biāo)分子對應(yīng)一種探針；
該方法包括如下步驟:顆粒表面包被上若干個功能基團(tuán)，記作功能化顆粒；每種靶標(biāo)分子都標(biāo)記有修飾基團(tuán)，記作修飾化靶標(biāo)分子；所述功能基團(tuán)與所述修飾基團(tuán)能夠相互作用；利用功能化顆粒和發(fā)光基團(tuán)使每種修飾化靶標(biāo)分子都能發(fā)光，從而實現(xiàn)對靶標(biāo)分子的己 O
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述利用功能化顆粒和發(fā)光基團(tuán)使每種修飾化靶標(biāo)分子都能發(fā)光的方法為如下(I) - (5)中任一所述的方法: (1)將修飾化靶標(biāo)分子混合物中的一種修飾化靶標(biāo)分子進(jìn)行發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記，記作修飾化且發(fā)光化靶標(biāo)分子；將除修飾化且發(fā)光化靶標(biāo)分子之外的其它修飾化靶標(biāo)分子混合物、修飾化且發(fā)光化靶標(biāo)分子、功能化顆粒共同孵育，通過功能基團(tuán)與修飾基團(tuán)的相互作用從而實現(xiàn)靶標(biāo)分子與顆粒的連接，每個顆粒上連接若干個靶標(biāo)分子，從而實現(xiàn)每種靶標(biāo)分子都能發(fā)光； (2)在功能化顆粒上的功能基團(tuán)上標(biāo)記發(fā)光基團(tuán)，記作功能化且發(fā)光化顆粒；將修飾化靶標(biāo)分子混合物與功能化且發(fā)光化顆粒孵育，通過功能基團(tuán)與修飾基團(tuán)的相互作用從而實現(xiàn)靶標(biāo)分子與顆粒的連接，每個顆粒上連接若干個靶標(biāo)分子，從而實現(xiàn)每種靶標(biāo)分子都能發(fā)光; (3)在功能化顆粒的內(nèi)部標(biāo)記上發(fā)光基團(tuán)，記作功能化且發(fā)光化顆粒；將修飾化靶標(biāo)分子混合物與功能化且發(fā)光化顆粒孵育，通過功能基團(tuán)與修飾基團(tuán)的相互作用從而實現(xiàn)靶標(biāo)分子與顆粒的連接，每個顆粒上連接若干個靶標(biāo)分子，從而實現(xiàn)每種靶標(biāo)分子都能發(fā)光； (4)制備無關(guān)分子，該無關(guān)分子不含有靶標(biāo)位點序列且不能與探針結(jié)合，該無關(guān)分子被標(biāo)記上與修飾化靶標(biāo)分子同樣的修飾基團(tuán)，同時標(biāo)記發(fā)光基團(tuán)，記作修飾化且發(fā)光化無關(guān)分子；將修飾化靶標(biāo)分子混合物、修飾化且發(fā)光化無關(guān)分子、功能化顆粒共同孵育，每個顆粒連接有若干個靶標(biāo)分子和無關(guān)分子，從而實現(xiàn)每種靶標(biāo)分子都能發(fā)光； (5)制備結(jié)合分子，該結(jié)合分子與靶標(biāo)分子混合物中的一種靶標(biāo)分子結(jié)合、但不與探針序列結(jié)合，該結(jié)合分子不連接修飾基團(tuán)但是連接發(fā)光基團(tuán)，記作發(fā)光化結(jié)合分子；將功能化顆粒和修飾化靶標(biāo)分子混合物共同孵育，得到孵育產(chǎn)物；將孵育產(chǎn)物與發(fā)光化結(jié)合分子混勻，使每個顆粒上連接若干個靶標(biāo)分子，每個顆粒上都有一種靶標(biāo)分子與所述發(fā)光化結(jié)合分子，從而實現(xiàn)每種靶標(biāo)分子都能發(fā)光。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述靶標(biāo)分子為多核苷酸、多肽、蛋白或碳水化合物； 所述多核苷酸具體為通過PCR的方法富集得到的； 所述功能基團(tuán)為化學(xué)功能基團(tuán)或鏈霉親和素、中性鏈親和素、卵白親合素、鏈親合素或卵黃親合素； 所述化學(xué)功能基團(tuán)具體為多核苷酸、蛋白、多肽、碳水化合物、醛基，羥基，羧基，酯鍵，氣基，橫酸基或疏基； 所述發(fā)光基團(tuán)為熒光團(tuán)、磷光團(tuán)或發(fā)色團(tuán)標(biāo)記；所述修飾基團(tuán)為生物素、地高辛、多核苷酸、蛋白、多肽或碳水化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于:所述熒光團(tuán)為量子點、發(fā)光的蛋白質(zhì)或小分子熒光染料。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:所述小分子熒光染料為氧雜蒽衍生物、青色素衍生物、萘衍生物、香豆素衍生物、噻二唑衍生物、芘衍生物、惡嗪衍生物、吖啶衍生物、次甲基衍生物、CF染料、Alexa Fluor染料、四氫吡咯衍生物、吖啶橙、DAPI,Hoechst33258、吡羅昔康或奎寧。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于:所述氧雜蒽衍生物為熒光素、羅丹明、俄勒R綠、曙紅或得克薩斯紅； 所述青色素衍生物為青色素、吲哚花青綠、羰花青或部花青； 所述萘衍生物為丹磺酰氯或普羅丹； 所述芘衍生物為級聯(lián)藍(lán)色； 所述惡嗪衍生物為尼羅河紅色、藍(lán)色尼羅河、甲酚紫或惡嗪170 ； 所述吖啶衍生物為二氨基吖啶、吖啶橙或吖啶黃； 所述次甲基衍生物為金 胺、結(jié)晶紫或孔雀石綠； 所述四氫吡咯衍生物為卟吩或膽紅素。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于:所述磷光團(tuán)為過渡金屬化合物或稀土化合物； 所述發(fā)色團(tuán)為食品著色劑、織物染料、番茄紅素、β_胡蘿卜素、花青素、葉綠素、血紅蛋白、血藍(lán)蛋白或礦物； 所述織物染料具體為偶氮化合物； 所述礦物具體為孔雀石或紫水晶； 所述顆粒的直徑為0.1微米至10微米； 所述顆粒為磁性顆粒，具體為順磁性顆粒； 所述微陣列芯片上的探針分子為多核苷酸，蛋白、多肽或碳水化合物； 所述微陣列芯片的基底材料為硅，玻璃，塑料，水凝膠，瓊脂糖，硝酸纖維素或尼龍。
8.一種利用微陣列芯片檢測靶標(biāo)位點的方法，包括如下步驟: (1)按照權(quán)利要求1-7任一所述的方法，實現(xiàn)每種靶標(biāo)分子都能發(fā)光； (2)再將步驟(1)孵育后的體系與微陣列芯片進(jìn)行孵育，靶標(biāo)分子與芯片上的探針通過相互作用而連接， (3)檢測芯片的發(fā)光情況，再結(jié)合芯片上的探針，從而判斷連接到芯片上的靶標(biāo)位點種類。
9.權(quán)利要求1-8任一所述的方法在微陣列芯片檢測中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103760355SQ201310651906
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】李陽, 張冠斌, 蔣迪, 項光新, 邢婉麗, 程京 申請人:博奧生物有限公司, 清華大學(xué)