豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重?zé)晒鈖cr檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種豬葡萄球菌4種脫落毒素分型（EXHA、EXHB、EXHC和EXHD）的多重?zé)晒釶CR方法及試劑盒，屬于多重?zé)晒釶CR方法及試劑盒領(lǐng)域。本發(fā)明的方法采用了序列如SEQ?ID?NO:1-8所示的引物，還采用了序列如SEQ?ID?NO:9-12所示的Taqman探針。本發(fā)明還提供了豬葡萄球菌脫落毒素EXHA、EXHB、EXHC和EXHD多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包含上述引物和Taqman探針，還包括DNA聚合酶；PCR緩沖液；dNTP和水。本發(fā)明的試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、操作方便、節(jié)約耗材、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，可用于豬葡萄球菌4種脫落毒素的檢測(cè)，用于科研及臨床應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法及試劑
盒【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多重?zé)晒釶CR方法及試劑盒，特別涉及一種豬葡萄球菌4種脫落毒素分型(EXHA、EXHB, EXHC和EXHD)的多重?zé)晒釶CR方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]葡萄球菌產(chǎn)生的脫落毒素可以引起人和動(dòng)物發(fā)生嚴(yán)重的皮膚性疾病。例如金黃色葡萄球菌可引起人的燙傷樣皮膚綜合癥，豬葡萄球菌可引起仔豬發(fā)生滲出性皮炎。目前發(fā)現(xiàn)的脫落毒素有9種，包括金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的ETA、ETB和ETD，以及豬葡萄球菌產(chǎn)生的EXHA、EXHB、EXHC和EXHD，還有日本研究人員發(fā)現(xiàn)的另外兩種豬葡萄球菌毒素蛋白SHETA和SHETB0
[0003]豬葡萄球菌(S.hyicus)可以引起豬群發(fā)生大規(guī)模的滲出性皮炎病(ExudativeEpidermitis，EE)，它是一種急性、高度接觸性的豬傳染病，患豬以急性全身性滲出性皮炎為主要特征，該病又稱(chēng)溢脂性皮炎或煤煙病。本病主要感染5-6日齡的初生哺乳仔豬、剛斷奶的仔豬以及母豬乳房上。該病原可通過(guò)各種途徑感染，主要以破裂和損傷的皮膚黏膜引起動(dòng)物的感染。據(jù)國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果表明它的發(fā)病率為80% ;死亡率5%~90%不等；少數(shù)存活的病豬常導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育障礙形成“僵豬”。
[0004]豬葡萄球菌所產(chǎn)生的這些脫落毒素是造成豬滲出性皮炎的主要致病因子之一，它是一種細(xì)胞外分泌的蛋白質(zhì)，分子量大約30KD。丹麥研究者首先通過(guò)PCR和Western-blot對(duì)產(chǎn)生的脫落毒素進(jìn)行了分析和研究，將脫落毒素分為4種類(lèi)型，并分別命名為EXHA、EXHB、EXHC、EXHD，其中EXHD的抗原性不同于其他3種毒素的抗原性。這4種脫落毒素的基因大小約為816bp~834bp，這些基因攜帶一些質(zhì)粒，并受這些質(zhì)粒的調(diào)控。
[0005]由于豬葡萄球菌在嗜菌型、血清型和DNA指紋型方面具有多型性(Andresenetal, 1993),發(fā)病豬中同時(shí)存在不同型的S.hyicus,從而使診斷變得復(fù)雜。Wegener發(fā)現(xiàn)從每個(gè)病豬的皮膚上任選分離出的10株S.hyicus中，平均包含1.9種不同的噬菌體型和2.3種不同的抗生素型。從動(dòng)物肝、脾中分離到的菌株的多樣性則稍低一些。目前，在實(shí)驗(yàn)室診斷中缺少簡(jiǎn)易方法來(lái)區(qū)分毒力型和非毒力型菌株，所以各型S.hicus都應(yīng)被看做潛在的毒力型菌株。但是，由于引起該病的病因很復(fù)雜，而且易與其它皮膚病變混淆，如脂痘，疥癬，癬，玫瑰糖疹，缺鋅，增生性皮膚病等。因此，在診斷過(guò)程中要選擇特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè)方法進(jìn)行鑒別診斷。
[0006]目前，對(duì)豬葡萄球菌產(chǎn)生的脫落毒素采用的診斷方法主要是細(xì)菌學(xué)的分離鑒定、生化試驗(yàn)、冰凍組織切片、免疫印跡分析、酶聯(lián)免疫(ELISA)、PCR和多重PCR方法等。
[0007]以上這些方法雖然已經(jīng)得到了推廣應(yīng)用，但是都存在耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、靈敏性和特異性欠佳等缺陷，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)的指導(dǎo)意義不大。因此，建立一種快速、高效、準(zhǔn)確的多重?zé)晒釶CR診斷方法已迫在眉睫。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)引物組，其中包括檢測(cè)EXHA、EXHB, EXHC及EXHD的4組特異性引物和4條Taqman探針。
[0009]本發(fā)明的另目的在于提供包含上述檢測(cè)引物組的豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，從而使檢測(cè)達(dá)到靈敏、快速、準(zhǔn)確、節(jié)約材料和試劑的目的。
[0010]本發(fā)明的再一目的在于提供上述檢測(cè)試劑盒檢測(cè)豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重?zé)晒釶CR方法。
[0011]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)引物組，包括用于檢測(cè)EXHA、EXHB, EXHC及EXHD的4組引物和4條Taqman探針；
[0012]所述的4組引物為:
[0013]
【權(quán)利要求】
1.一種豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)引物組，其特征在于包括用于檢測(cè)EXHA、EXHB、EXHC及EXHD的4組引物和4條Taqman探針； 所述的4組引物如SEQ ID NO:1~8所示； 所述的Taqman探針由5’端帶有的突光物質(zhì)，Taqman探針的序列和3’端帶有的淬滅物質(zhì)組成； 所述的4條Taqman探針的序列如SEQ ID NO:9~12所示。
2.根據(jù)權(quán) 利要求1所述的豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)引物組，其特征在于:所述的5’端帶有的熒光物質(zhì)為FAM、J0E、TAMRA、Cy5中的至少一種； 所述的3’端帶有的淬滅物質(zhì)為BHQ、BHQU BHQ2和BHQ3中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)引物組，其特征在于:所述的4條Taqman探針如下: EXHA-Prob-FAMFAM-tgaagcgccttttggagcagga-BHQ EXHB-Prob-JOEJOE-cacgccaatagagaatgtatcacatg- BH QI EXHC-Prob-TAMRA TAMRA-tggcagattaaatgttcaaggagaagc-BHQ2 EXHD-Prob-Cy5Cy5-cgttgctaccgcttcagttgtagga-BHQ3。
4.一種豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求I所述的檢測(cè)EXHA、EXHB, EXHC及EXHD的4組引物和4條Taqman探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:試劑盒具有由以下成分組成:權(quán)利要求1所述的檢測(cè)EXHA、EXHB, EXHC及EXHD的4組引物和4條Taqman探針；DNA聚合酶；DNA聚合酶緩沖液；dNTP和水。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述的DNA聚合酶、DNA聚合酶緩沖液和dNTP為Premix Ex Taq試劑盒中的Premix溶液。
7.權(quán)利要求4~6任一項(xiàng)所述的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重?zé)晒釶CR方法，具體步驟如下: (1)提取待測(cè)樣品的DNA|旲板； (2)配制PCR反應(yīng)體系:步驟(1)待測(cè)樣品DNA模板2μ L ;4組引物中各條引物的量為5-15pmol ;4條Taqman探針中各種探針的量為2_10pmol ;Premix溶液10 μ L,加水至總體積為 20 μ L ; (3)將上述步驟(2)中配制的PCR反應(yīng)體系置于熒光定量PCR儀中反應(yīng)，反應(yīng)條件如下:95°C 30秒；熱循環(huán)為95°C I秒，60°C 20秒，共40個(gè)循環(huán)； (4)通過(guò)熒光探針上所攜帶的熒光染料的顏色對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線的CT值判斷，是否存在EXHA、EXHB、EXHC及EXHD，及存在的量的多少。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103667479SQ201310655300
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】宋長(zhǎng)緒, 蔣智勇, 張樂(lè)宜, 蔡汝健, 李艷, 劉燕玲 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所