紅假單胞菌菌株及其在抑制黃瓜霜霉病菌、促進(jìn)黃瓜生長中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種兼性厭氧的紅假單胞菌菌株，其為保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心、且保藏號(hào)為CCTCC?NO：M2012366的菌株。該紅假單胞菌菌株可抑制黃瓜霜霉病菌且促進(jìn)黃瓜生長，應(yīng)用時(shí)可將光合細(xì)菌菌液直接噴施施用或?qū)⒕褐苽涑砂l(fā)酵液后再進(jìn)行噴施應(yīng)用，其中光合細(xì)菌菌液和光合細(xì)菌發(fā)酵液的制備方法包括以下步驟：先將紅假單胞菌菌株活化；再將活化培養(yǎng)得到的單菌落接入至血清瓶進(jìn)行種子培養(yǎng)；然后進(jìn)行生產(chǎn)培養(yǎng)，獲得光合細(xì)菌菌液；將光合細(xì)菌菌液進(jìn)行離心，收集上清液，再經(jīng)細(xì)菌過濾器過濾后得到光合細(xì)菌發(fā)酵液。本發(fā)明具有生產(chǎn)成本低、拮抗效果好、高效、無毒、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】紅假單胞菌菌株及其在抑制黃瓜霜霉病菌、促進(jìn)黃瓜生長
中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種光合細(xì)菌及其應(yīng)用，尤其涉及一種紅假單胞菌菌株及其在抑制黃瓜霜霉病菌以及促進(jìn)黃瓜生長中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]黃瓜霜霉病是影響黃瓜種植的最重要的病害之一，在整個(gè)黃瓜生育期，如遇適宜發(fā)病條件，無論是露天還是保護(hù)地栽培，其浸染、傳播流行速度極快，均能對(duì)黃瓜的產(chǎn)量造成嚴(yán)重?fù)p失。目前，防治黃瓜霜霉病最主要和最有效的措施是采用殺菌劑，然而，由于化學(xué)藥劑選擇壓力，單一藥劑或單一類型殺菌劑地不合理使用，極易造成病原菌的抗藥性快速上升，進(jìn)而導(dǎo)致殺菌劑用量上升，從而可能引起農(nóng)產(chǎn)品中殺菌劑的超標(biāo)，過量殺菌劑的投放，其一旦滲透進(jìn)土壤或地下水層也將污染生態(tài)環(huán)境。
[0003]隨著全社會(huì)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，農(nóng)藥殘留帶來的農(nóng)產(chǎn)品安全以及環(huán)境污染問題愈來愈受到關(guān)注。然而，從目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)現(xiàn)狀以及農(nóng)業(yè)技術(shù)水平來看，殺菌劑仍將繼續(xù)使用且使用量還會(huì)繼續(xù)上升。殺菌劑作為控制作物病害的有效手段，是目前及今后相對(duì)較長時(shí)期內(nèi)最主要的技術(shù)措施之一。因此，尋找殺菌劑的替代技術(shù)和方法，是目前最具有實(shí)際應(yīng)用前景的研究方向。
[0004]生物防治特別是微生物防治研究，是國內(nèi)外研究作物病害防治的熱點(diǎn)。微生物防治作物病害具有無毒、無污染的特 點(diǎn)，而且微生物菌劑生產(chǎn)簡便、田間操作與殺菌劑一樣方便。光合細(xì)菌是地球上最早出現(xiàn)的具有原始光能合成體系的原核生物，分布廣泛，遍及江河、沼澤、湖泊和海洋等，具有固氮、制氫、固碳、脫硫等作用。光合細(xì)菌生命力強(qiáng)，容易培養(yǎng)，生長速度繁殖快，本身無毒，富含蛋白質(zhì)、維他命、類胡蘿卜素等。目前已經(jīng)被廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)光合細(xì)菌在種植、養(yǎng)殖、新能源開發(fā)利用以及醫(yī)藥方面具有十分廣闊的前景。目前在黃瓜霜霉病防治方面，已有一些較好的微生物資源被挖掘，然而，尚無光合細(xì)菌應(yīng)用于黃瓜霜霉病的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生產(chǎn)成本低、拮抗效果好、高效、無毒、環(huán)保的紅假單胞菌菌株，還提供該菌株在抑制黃瓜霜霉病菌、促進(jìn)黃瓜生長中的應(yīng)用，使其能以環(huán)保、高效、低成本、方便快捷的操作實(shí)現(xiàn)抑制黃瓜病害的危害，促進(jìn)黃瓜等蔬菜的生長。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種兼性厭氧的紅假單胞菌菌株，所述紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sp.)菌株為保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)、且保藏號(hào)為CCTCC NO:M2012366的菌株(以下簡稱紅假單胞菌CCTCCM2012366)。紅假單胞菌CCTCC M2012366的保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏單位的地址位于中國武漢大學(xué)，保藏日期為2012年9月20日，該紅假單胞菌CCTCCM2012366 被命名為紅假單胞菌 S_1 (Rhodopseudomonas sp.S-1)。
[0007]經(jīng)過我們的檢測，本發(fā)明的紅假單胞菌CCTCC M2012366具有以下主要特征:
[0008]G-，個(gè)體形態(tài)為桿狀，V-P反應(yīng)陽性，甲基紅反應(yīng)陽性，不能利用淀粉，H2S反應(yīng)陽性，明膠液化陽性，吲哚反應(yīng)陽性，檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)陰性，脲酶實(shí)驗(yàn)陰性，過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陽性，3%NaCl中能生長，最適生長溫度為30°C~35°C，最適生長pH值為6.5~7.5，菌體的特征吸收峰為375nm、805nm和865nm,測定的16S rDNA序列長度為1389bp,在Genbank中的登錄號(hào)為KC491187。
[0009]滿足上述特征描述的紅假單胞菌CCTCC M2012366在下述應(yīng)用中的效果更好。
[0010]作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述的紅假單胞菌CCTCC M2012366在抑制黃瓜霜霉病菌中的應(yīng)用。
[0011]作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述的紅假單胞菌CCTCC M2012366在促進(jìn)黃瓜生長中的應(yīng)用。
[0012]上述的應(yīng)用中，優(yōu)選的，將所述紅假單胞菌CCTCC M2012366制備成光合細(xì)菌菌液直接噴施應(yīng)用或?qū)⒃摷t假單胞菌菌株制備成光合細(xì)菌發(fā)酵液后再進(jìn)行噴施應(yīng)用。所述光合細(xì)菌菌液及光合細(xì)菌發(fā)酵液的制備方法包括以下步驟:
[0013](I)活化:將所述 紅假單胞菌CCTCC M2012366的保存種按雙層平板培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至紅色單菌落出現(xiàn)；
[0014](2)種子培養(yǎng):將步驟(1)中培養(yǎng)得到的單菌落接入至血清瓶，用紅假單胞菌菌株種子培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期；
[0015](3)生產(chǎn)培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液接入至生產(chǎn)瓶(例如5L的生產(chǎn)瓶，該瓶可以為透明玻璃瓶)中，用紅假單胞菌菌株生產(chǎn)培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期得到光合細(xì)菌菌液，所述培養(yǎng)液的接入量不少于紅假單胞菌菌株生產(chǎn)培養(yǎng)基總體積的1% ;
[0016](4)光合細(xì)菌發(fā)酵液制備:將步驟(3)培養(yǎng)得到的光合細(xì)菌菌液進(jìn)行離心，收集離心后的上清液，再經(jīng)細(xì)菌過濾器過濾后得到光合細(xì)菌發(fā)酵液。
[0017]上述的應(yīng)用中，所述雙層平板培養(yǎng)法優(yōu)選是采用雙層PSB固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，所述雙層PSB固體培養(yǎng)基包含以下質(zhì)量的成分=K2HPO40.2g、KH2PO40.8g、MgSO40.2g、CaSO4.2H200.lg、NaMoO4.2H200.0033g、FeSO4.7H200.005g、酵母提取粉 L 5g 和瓊脂粉(agar) 13g/18g (雙層平板培養(yǎng)基上層培養(yǎng)基瓊脂粉18g/L、下層培養(yǎng)基瓊脂粉13g/L)、蒸餾水 1L，pH7.0 ~7.2。
[0018]上述的應(yīng)用中，所述紅假單胞菌菌株種子培養(yǎng)基、紅假單胞菌菌株生產(chǎn)培養(yǎng)基均優(yōu)選用PSB液體培養(yǎng)基，所述PSB液體培養(yǎng)基包含以下質(zhì)量的成分=K2HPO40.2g、KH2PO40.8g、MgSO40.2g、CaSO4.2H200.lg、NaMoO4.2H200.0033g、FeSO4.7H200.005g 和酵母提取粉(yeast extract) 1.5g、蒸懼水IL ;所述PSB液體培養(yǎng)基的pH值為7.0~7.2。
[0019]上述的應(yīng)用中，所述活化、種子培養(yǎng)和生產(chǎn)培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)溫度均控制在30°C~
350C，培養(yǎng)pH值為7.0~7.2，光照條件均控制為2000Lx~3000Lx。
[0020]上述的應(yīng)用中，所述步驟(3)中，培養(yǎng)液的接入量優(yōu)選為紅假單胞菌菌株生產(chǎn)培養(yǎng)基總體積的1%~3%。
[0021]上述的應(yīng)用中，所述步驟(4)中，離心時(shí)的轉(zhuǎn)速優(yōu)選控制在4000rpm~6000rpm,離心時(shí)間優(yōu)選控制在5min~8min。[0022]通過對(duì)上述制備方法進(jìn)行優(yōu)化，包括對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及培養(yǎng)工藝參數(shù)的優(yōu)化，能使本發(fā)明的紅假單胞菌CCTCC M2012366生長更加迅速，從而縮短生產(chǎn)時(shí)間(全流程時(shí)間一般僅需24天左右)；工藝成本及產(chǎn)品價(jià)格更為低廉，便于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中進(jìn)行推廣；應(yīng)用方法更為簡便，易于操作，培養(yǎng)結(jié)束后，菌體數(shù)量可以達(dá)到2.0X IO9個(gè)/mL以上，培養(yǎng)完成后出瓶可以直接分裝成液體菌劑。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)成本低、高效、無毒、環(huán)保的紅假單胞菌CCTCC M2012366，該菌株可通過簡單、快捷、低成本的操作方法制備得到光合細(xì)菌菌液和光合細(xì)菌發(fā)酵液，該菌株菌液和發(fā)酵液可促進(jìn)黃瓜生長，發(fā)酵液可高效抑制黃瓜霜霉病菌，應(yīng)用時(shí)不僅操作簡單、方便、工藝成本低，而且具有明顯的防治黃瓜霜霉病效果和促生長效果，為今后黃瓜等蔬菜的種植創(chuàng)造了更加優(yōu)異的生長環(huán)境。
[0024]一種紅假單胞菌菌株(Rhodopseudomonas sp S-1),其保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，地址為中國武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC NO:M2012366，保藏日期為2012年9月24日。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明應(yīng)用實(shí)施例1中各處理組對(duì)黃瓜幼苗的累積生物量的影響。
[0026]圖2為本發(fā)明應(yīng)用實(shí)施例1中各處理組對(duì)黃瓜幼苗根活力的影響。
[0027]圖3為本發(fā)明應(yīng)用實(shí)施例1中各處理組對(duì)黃瓜幼苗生長素(IAA)含量的影響。
[0028]圖4為本發(fā)明應(yīng)用實(shí)施例1中各處理組對(duì)黃瓜幼苗過氧化物酶活性的影響。
[0029]圖5為本發(fā)明應(yīng)用實(shí)施例1中各處理組對(duì)黃瓜幼苗過氧化氫酶活性的影響。
`[0030]圖6為本發(fā)明應(yīng)用實(shí)施例2中各組光合細(xì)菌發(fā)酵液菌劑對(duì)黃瓜霜霉病菌的抑制率曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0031]以下結(jié)合說明書附圖和具體優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0032]實(shí)施例:
[0033]一種本發(fā)明的兼性厭氧的紅假單胞菌菌株，其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO:M2012366的菌株。該紅假單胞菌CCTCC M2012366被命名為紅假單胞菌 S_1 (Rhodopseudomonas sp.S-1)。
[0034]經(jīng)過我們的檢測，本實(shí)施例的紅假單胞菌CCTCC M2012366具有以下主要特征:
[0035]G-，個(gè)體形態(tài)為桿狀，V-P反應(yīng)陽性，甲基紅反應(yīng)陽性，不能利用淀粉，H2S反應(yīng)陽性，明膠液化陽性，吲哚反應(yīng)陽性，檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)陰性，脲酶實(shí)驗(yàn)陰性，過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陽性，3%NaCl中能生長，最適生長溫度為30°C~35°C，最適生長pH值為6.5~7.5，菌體的特征吸收峰為375nm、805nm和865nm,測定的16S rDNA序列長度為1389bp,在Genbank中的登錄號(hào)為KC491187。
[0036]上述本實(shí)施例的紅假單胞菌M2012366主要通過以下方法篩選得到:將采自湖南省植物保護(hù)研究所水塘的水樣5.0mL加入到120mL PSB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5d~7d后得到深紅色混合菌液，用接種環(huán)挑取適量的菌液劃線于PSB雙層平板培養(yǎng)基中，30°C ±2°C，約3000Lx，光照培養(yǎng)5d~7d后，獲得大量深紅色的單菌落；用滅菌牙簽挑取外形規(guī)整、光滑且較大的單菌落至PSB液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)5d~7d獲得深紅色菌液，劃線、挑取單胞富集獲得菌液、重復(fù)3次；梯度稀釋法稀釋平板培養(yǎng)法測定最終富集獲得的菌液中菌株的生物量，后續(xù)試驗(yàn)中菌液濃度調(diào)整至約2X 109cfu/mL。
[0037]本實(shí)施例的紅假單胞菌CCTCC M2012366可用于抑制黃瓜霜霉病菌，還可用于促進(jìn)黃瓜生長。應(yīng)用時(shí)，先將紅假單胞菌CCTCC M2012366制備成光合細(xì)菌發(fā)酵液，再進(jìn)行噴施應(yīng)用，該光合細(xì)菌發(fā)酵液的制備方法包括以下步驟:[0038](I)活化:將本實(shí)施例的紅假單胞菌CCTCC M2012366的超低溫保存種按雙層平板培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度控制在30°C~35°C，培養(yǎng)pH值為7.0~7.2，光照條件控制為2000Lx~3000Lx，培養(yǎng)至紅色單菌落出現(xiàn)；該雙層平板培養(yǎng)法是采用雙層PSB固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，雙層PSB固體培養(yǎng)基包含以下成分=K2HPO40.2g、KH2PO40.8g、MgSO40.2g、CaSO4.2Η200.lg、NaMo04.2Η200.0033g、FeS04.7Η200.005g、酵母提取粉 1.5g和瓊脂 13g/18g(雙層平板培養(yǎng)基上層培養(yǎng)基瓊脂粉18g/L、下層培養(yǎng)基瓊脂粉13g/L)、蒸餾水lL，pH7.0~
7.2 ；
[0039](2)種子培養(yǎng):將步驟(1)中培養(yǎng)得到的單菌落接入至血清瓶，用紅假單胞菌菌株種子培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期；紅假單胞菌菌株種子培養(yǎng)基選用PSB液體培養(yǎng)基，PSB液體培養(yǎng)基包含以下質(zhì)量的成分=K2HPO40.2g、KH2PO40.8g、MgSO40.2g、CaSO4.2Η200.lg、NaMoO4.2Η200.0033g、FeSO4.7Η200.005g 和酵母提取粉 1.5g、蒸餾水 IL ;所述 PSB 液體培養(yǎng)基的PH值為7.0~7.2 ;培養(yǎng)溫度控制在30°C~35°C，培養(yǎng)pH值為7.0~7.2，光照條件控制為2000Lx~3000Lx ；
[0040](3)生產(chǎn)培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液接入至生產(chǎn)瓶(例如5L的生產(chǎn)瓶，該瓶可以為透明玻璃瓶)中，用紅假單胞菌菌株生產(chǎn)培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，培養(yǎng)液的接入量為紅假單胞菌菌株生產(chǎn)培養(yǎng)基總體積的1% ;紅假單胞菌菌株生產(chǎn)培養(yǎng)基選用PSB液體培養(yǎng)基，PSB液體培養(yǎng)基包含以下質(zhì)量的成分=K2HPO40.2g、KH2PO40.8g、MgSO40.2g、CaSO4.2H200.lg、NaMoO4.2H200.0033g、FeSO4.7H200.005g 和酵母提取粉 1.5g、蒸餾 IL ;培養(yǎng)溫度控制在30°C~35°C，培養(yǎng)pH值為7.0~7.2，光照條件控制為2000Lx~3000Lx ；
[0041](4)光合細(xì)菌發(fā)酵液制備:將步驟(3)培養(yǎng)得到的光合細(xì)菌菌液進(jìn)行離心，離心時(shí)的轉(zhuǎn)速控制在6000rpm,離心時(shí)間優(yōu)選控制在5min,收集離心后的上清液,再經(jīng)細(xì)菌過濾器過濾后得到光合細(xì)菌發(fā)酵液。
[0042]應(yīng)用實(shí)施例1:光合細(xì)菌在促進(jìn)黃瓜苗期生長發(fā)育中的應(yīng)用。
[0043]選用直徑為9cm的滅菌培養(yǎng)皿中加墊6張滅菌濾紙，加入無菌水，無菌水的量以浸透濾紙且能浸沒1/2顆黃瓜種子為宜。將黃瓜種子平鋪于濕潤的紗布上4°C冷藏過夜，打破種子休眠后平鋪于上述培養(yǎng)皿中；置于光照培養(yǎng)箱，25°C, 16h光照，8h黑暗培養(yǎng)，直至種子萌發(fā)。種子發(fā)芽至幼苗并長至4cm左右時(shí)，移栽入水培盒中。水培盒中添入Hoagland 水培營養(yǎng)液，營養(yǎng)液的配方為:Ca(NO3)2945mg/L，KN0360 7mg/L, NH4NO3115mg/L,NH3H2PO3136mg/L, MgS0449 3mg/L,鐵鹽溶液 2.5mL (七水硫酸亞鐵 2.78g，EDTA-2Na3.73g，蒸餾水 500mL，pH5.5)，微量元素 5mL(K10.83mg/L，Η3Β036.2mg/L，MnS0422.3mg/L, ZnS048.6mg/L, NaMoO30.25mg/L, CuSO40.025mg/L, CuCl20.025mg/L), pH:6.0。
[0044]將實(shí)施例中制備的光合細(xì)菌發(fā)酵液加入水培營養(yǎng)液中作為處理C，光合細(xì)菌菌液加入水培營養(yǎng)液中作為d處理，另設(shè)不加光合細(xì)菌發(fā)酵液處理的空白水培營養(yǎng)液作為處理a,設(shè)PSB液體培養(yǎng)基加入到水培營養(yǎng)液中作為處理b對(duì)照，處理濃度為12.5mL/L (具體指的是12.5ml發(fā)酵液配IL的營養(yǎng)液，a, b兩個(gè)處理是對(duì)應(yīng)C、d處理中發(fā)酵液或菌液加入的量添加)。在0d、3d、6d、9d、12d、15d分別測定a、b、c、d四個(gè)處理組中黃瓜幼苗的生物量(參見圖1)、根活(參見圖2)、生長素(IAA)(參見圖3)、過氧化物酶活力(參見圖4)、過氧化氫酶活力(參見圖5)等指標(biāo)，各指標(biāo)測定重復(fù)三次，測定結(jié)果分別如圖1~圖5所示。
[0045]由圖1可見，本實(shí)施例中的光合細(xì)菌發(fā)酵液及光合細(xì)菌菌液在施用于黃瓜幼苗時(shí)，能夠顯著提高黃瓜幼苗的累積生物量。由圖2可見，本實(shí)施例中的光合細(xì)菌發(fā)酵液及光合細(xì)菌菌液在施用于黃瓜幼苗時(shí)，能夠顯著提升黃瓜幼苗的根活力。由圖3可見，本實(shí)施例中的光合細(xì)菌發(fā)酵液及光合細(xì)菌菌液在施用于黃瓜幼苗時(shí)，能夠明顯提高黃瓜幼苗中生長素(IAA)的含量。由圖4可見，本實(shí)施例中的光合細(xì)菌發(fā)酵液及光合細(xì)菌菌液在施用于黃瓜幼苗時(shí)，能夠提高黃瓜幼苗過氧化物酶活性。由圖5可見，本實(shí)施例中的光合細(xì)菌發(fā)酵液及光合細(xì)菌菌液在施用于黃瓜幼苗時(shí)，能夠提高黃瓜幼苗過氧化氫酶活性。
[0046]應(yīng)用實(shí)施例2:光合細(xì)菌發(fā)酵液在抑制黃瓜霜霉病中的應(yīng)用。
[0047]取實(shí)施例制備的光合細(xì)菌發(fā)酵液，等比稀釋成以下梯度的菌劑:稀釋5倍、稀釋10倍、稀釋20倍、稀釋40倍、稀釋80倍。采用聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織FA0( 1982年)推薦的葉盤漂浮法，用移液器將稀釋后的光合細(xì)菌發(fā)酵液菌劑移至直徑6cm的培養(yǎng)皿中，每皿10mL，空白對(duì)照加去離子水；將黃瓜葉盤背面朝上漂浮在培養(yǎng)皿上，用移液器將黃瓜霜霉病的孢子囊懸浮液接種至葉盤中心，IOyL/葉盤，重復(fù)試驗(yàn)3次。然后將各處理組置于20°C溫度下按每天16小時(shí)光照和8小時(shí)黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)IOd~14d，調(diào)查各葉盤的發(fā)病情況。
[0048]以DPS軟件(vl2.01)計(jì)算稀釋倍數(shù)對(duì)數(shù)值與相對(duì)防效概率值之間的線性回歸方程及IC5tl等，結(jié)果如表1和圖6所示。
[0049]表1:不同稀釋倍數(shù)光合細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)理黃瓜霜霉病病的抑制率
【權(quán)利要求】
1.一種兼性厭氧的紅假單胞菌菌株，其特征在于:所述紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sp.)菌株為保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心、且保藏號(hào)為CCTCC NO:M2012366的菌株。
2.一種如權(quán)利要求1所述的紅假單胞菌菌株在抑制黃瓜霜霉病菌中的應(yīng)用。
3.—種如權(quán)利要求1所述的紅假單胞菌菌株在促進(jìn)黃瓜生長中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述紅假單胞菌菌株制成光合細(xì)菌菌液直接噴施應(yīng)用或?qū)⒃摷t假單胞菌菌株制備成光合細(xì)菌發(fā)酵液后再進(jìn)行噴施應(yīng)用，所述光合細(xì)菌菌液及光合細(xì)菌發(fā)酵液的制備方法包括以下步驟: (1)活化:將所述紅假單胞菌菌株的保存種按雙層平板培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至紅色單菌落出現(xiàn)； (2)種子培養(yǎng):將步驟(1)中培養(yǎng)得到的單菌落接入至血清瓶，用紅假單胞菌菌株種子培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期； (3)生產(chǎn)培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液接入至生產(chǎn)瓶中，用紅假單胞菌菌株生產(chǎn)培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期得到光合細(xì)菌菌液，所述培養(yǎng)液的接入量不少于紅假單胞菌菌株生產(chǎn)培養(yǎng)基總體積的1% ； (4)光合細(xì)菌發(fā)酵液制備:將步驟(3)培養(yǎng)得到的光合細(xì)菌菌液進(jìn)行離心，收集離心后的上清液，再經(jīng)細(xì)菌過濾器過濾后得到光合細(xì)菌發(fā)酵液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述雙層平板培養(yǎng)法是采用雙層PSB固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，所述雙層PSB固體培養(yǎng)基包含以下質(zhì)量的成分=K2HPO40.2g、KH2PO40.8g、MgSO40.2g、CaSO4.2H200.lg、NaMoO4.2H200.0033g、FeSO4.7H200.005g、酵母提取粉1.5g、瓊脂粉13g/18g、蒸餾水1L，pH7.0~7.2。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述紅假單胞菌菌株種子培養(yǎng)基、紅假單胞菌菌株生產(chǎn)培養(yǎng)基均選用PSB液體培養(yǎng)基，所述PSB液體培養(yǎng)基包含以下質(zhì)量的成分=K2HPO40.2g、KH2PO40.8g、MgSO40.2g、CaSO4.2Η200.lg、NaMoO4.2Η200.0033g、FeSO4.7Η200.005g、酵母提取粉1.5g、蒸餾水IL ;所述PSB液體培養(yǎng)基的pH值為7.0~7.2。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于:所述活化、種子培養(yǎng)和生產(chǎn)培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)溫度均控制在30°C~35°C，光照條件均控制為2000Lx~3000Lx。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于:所述步驟(3)中，培養(yǎng)液的接入量為紅假單胞菌菌株生產(chǎn)培養(yǎng)基總體積的1%~3%。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于:所述步驟(4)中，離心時(shí)的轉(zhuǎn)速控制在4000rpm~6000rpm,離心時(shí)間控制在5min~8min。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103602622SQ201310660114
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】劉勇, 張德詠, 彭靜, 張松柏, 高陽, 張卓, 程菊娥, 譚新球, 成飛雪, 朱春暉, 楊春曉 申請(qǐng)人:湖南省植物保護(hù)研究所