一種甜菜內(nèi)生促生菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種甜菜內(nèi)生細(xì)菌AchromobactermarplatensisTNSC2011CGMCC?No.8192及其在甜菜栽培中的應(yīng)用。通過對(duì)所獲菌株進(jìn)行形態(tài)特征、生理生化特性及16SrDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析，初步確定了其分類地位；同時(shí)對(duì)該細(xì)菌TNSC2011的發(fā)酵液的抑菌率、促生性、穩(wěn)定性等特性進(jìn)行了深入研究，可有效促進(jìn)作物生長(zhǎng)，同時(shí)可將難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可被生物利用的可溶性磷酸鹽，提高光合作用，證明了編號(hào)為TNSC2011是一種優(yōu)良的內(nèi)生菌，通過將此內(nèi)生菌在甜菜栽培上的應(yīng)用獲得良好作用，具有突出的技術(shù)效果，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種甜菜內(nèi)生促生菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，具體說(shuō)，本發(fā)明涉及一種甜菜內(nèi)生促生菌及其應(yīng)用的【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]內(nèi)生菌普遍存在于植物體內(nèi)，與宿主形成和諧的共生體，產(chǎn)生大量次生代謝活性物質(zhì)。據(jù)報(bào)道，內(nèi)生菌可增強(qiáng)宿主的抗病性、提高植物的生產(chǎn)力、抗逆抗蟲、具有除草劑活性等特性。因此，內(nèi)生菌可作為生物促生中有潛力的因子，在生態(tài)農(nóng)業(yè)和生物農(nóng)藥研制方面具有重要的用途。植物內(nèi)生細(xì)菌如c可通過不同途徑促進(jìn)其宿主植物生長(zhǎng)，其作用與植物根圍細(xì)菌相似(/?^)，植物根圍促生細(xì)菌{Plant growth-promotingrhizobacteria，資觀、PGPR),生存于植物根際、根表,能夠直接或間接地促進(jìn)或調(diào)節(jié)植物以及作物生長(zhǎng)。植物內(nèi)生細(xì)菌能固定大氣中的氮供給其宿主植物利用；合成鐵載體能夠溶解并吸收土壤中鐵供給其宿主植物利用；合成植物激素促進(jìn)植物不同生長(zhǎng)階段的生長(zhǎng)，具有溶解礦物質(zhì)如磷的機(jī)制，使其更有利于植物利用；作用于生長(zhǎng)有關(guān)的酶使其調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。
[0003]甜菜內(nèi)生菌(Mndophyte )是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康甜菜各種組織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙的真菌、細(xì)菌和放線菌。甜菜內(nèi)生菌長(zhǎng)期生活在甜菜體內(nèi)的特殊環(huán)境中并與甜菜協(xié)同進(jìn)化。一方面甜菜為其提供生長(zhǎng)必需的能量和營(yíng)養(yǎng)；另一方面，內(nèi)生菌又可通過自身的代謝產(chǎn)物或借助于信號(hào)傳導(dǎo)作用對(duì)甜菜產(chǎn)生影響。研究表明有些植物內(nèi)生菌對(duì)其宿主植物有一定的促生作用，而在糖料作物上的增糖作用鮮有報(bào)道。
[0004]甜菜是世界及我國(guó)制糖工業(yè)的主要原料之一，在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。在新疆，發(fā)展甜菜生產(chǎn)，不僅能滿足人民對(duì)食糖消費(fèi)的需要，促進(jìn)輕工業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展，還可以充分利用和改良鹽堿地。目前甜菜糖業(yè)已經(jīng)成為新疆經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一。然而，目前新疆乃至全國(guó)甜菜單產(chǎn)逐漸提高，塊根中蔗糖含量卻大幅度下降，已成為限制我國(guó)甜菜糖業(yè)發(fā)展的瓶頸，究其原因十分復(fù)雜，各地原因不盡相同，但共性原因是品種選育滯后，過量施用氮素，還有當(dāng)?shù)氐臍夂蛞蛩?。目前?guó)內(nèi)外都廣泛使用各種類型的增糖劑，這些增糖劑包括植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、微量元素、微生物等，其增糖的基本原理是促進(jìn)甜菜根葉生長(zhǎng)，提高植株光合強(qiáng)度，增加干物質(zhì)和糖分積累，增強(qiáng)抗病力，抑制植株地上部葉片生長(zhǎng)，促進(jìn)地下部塊根生長(zhǎng)和根內(nèi)糖分積累，降低氮素代謝及光合產(chǎn)物消耗，促進(jìn)更多光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)至根部，并以糖分的形式積累起來(lái)。
[0005]當(dāng)前 ，生產(chǎn)上增糖劑仍然是以化學(xué)增糖劑為主。大量使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)破壞生態(tài)平衡，造成農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥污染，不但損害了人和動(dòng)物的健康，而且引起土壤微生物的種群數(shù)量減少，土壤肥力降低；另一方面引發(fā)病原菌產(chǎn)生耐藥性，令防治效果難度加大。因此，我們迫切需要使用對(duì)自然生態(tài)無(wú)危害的生物促生方法來(lái)減少化學(xué)農(nóng)藥使用量。由于內(nèi)生菌定殖于植物內(nèi)部，所以甜菜內(nèi)生菌是理想的候選生物促生菌。目前植物內(nèi)生菌研究已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，而有關(guān)甜菜內(nèi)生菌的促生作用未見報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)未見有關(guān)甜菜內(nèi)生菌的促生作用的研究的現(xiàn)狀，本發(fā)明旨在提供一種甜菜內(nèi)生細(xì)菌及其應(yīng)用，本發(fā)明基于植物內(nèi)生菌與植物和諧聯(lián)合的關(guān)系，在甜菜中分離出一批產(chǎn)IAA的微生物菌株，從中篩選出一株編號(hào)為TNSC2011的菌株，可有效促進(jìn)作物生長(zhǎng)，同時(shí)可將難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可被生物利用的可溶性磷酸鹽，提高光合作用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種內(nèi)生菌在甜菜栽培上的應(yīng)用。通過試驗(yàn)驗(yàn)證，采用本發(fā)明提供的甜菜內(nèi)生細(xì)菌marplatensis是一種具有促進(jìn)甜菜生長(zhǎng)提高甜菜含糖率的方法，獲得良好的技術(shù)效果，作為甜菜促生內(nèi)生菌具有廣泛而適用的價(jià)值。
[0007]本發(fā)明采用主要的技術(shù)方案:
通過在甜菜體內(nèi)產(chǎn)IAA微生物的篩選，獲得一株具有較強(qiáng)促生活性的菌株編號(hào)為TNSC2011。通過對(duì)所獲菌株進(jìn)行形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析，初步確定了其分類地位；同時(shí)對(duì)該細(xì)菌TNSC2011的發(fā)酵液的抑菌率、促生性、穩(wěn)定性等特性進(jìn)行了深入研究，可有效促進(jìn)作物生長(zhǎng)，同時(shí)可將難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可被生物利用的可溶性磷酸鹽，提高光合作用，證明了編號(hào)為TNSC2011是一種優(yōu)良的內(nèi)生菌，通過將此內(nèi)生菌在甜菜栽培上的應(yīng)用獲得良好作用，具有突出的技術(shù)效果。
[0008]本發(fā)明具體提供的一種甜菜內(nèi)生細(xì)菌JcAroffioAacier通過在甜菜中分離、篩選和培養(yǎng)，獲得一批產(chǎn)IAA的微生物菌株,從中篩選出一株編號(hào)為TNSC2011的菌株，經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定，雇!予Achromobacter marplatensis。
[0009]具體的,本發(fā)明提供的一種甜菜內(nèi)生細(xì)菌菌株編號(hào)為TNSC2011。該菌株已于申請(qǐng)日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國(guó)際保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101。保藏日期是2013年9月16日，保藏號(hào)是CGMCC N0.8192。經(jīng)微生物學(xué)鑒定為JcAroffioAaci er marpla ten si s 0該菌株最適生長(zhǎng)條件為:溫度29.50C，培養(yǎng)基采用胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件:pH7.2，時(shí)間48h;該菌株菌落中等且平滑，呈透明、白色、表面濕潤(rùn)、邊緣整齊，生長(zhǎng)較快；通過革蘭氏染色，鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)該菌株為革蘭氏陰性菌.經(jīng)微生物學(xué)鑒定為
菌，細(xì)胞桿狀，0.8-1.0umX1.5-2um，革藍(lán)氏陰性(_)，不產(chǎn)芽抱，菌落較小且平滑，呈透明、白色、表面濕潤(rùn)、邊緣整齊。依照第九版《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》({Bergey, s Manual of Sys tema tic Bac terio -logy)))和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)TNSC2011菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測(cè)定，生理生化檢測(cè)確定TNSC2011菌株為無(wú)色桿菌屬中的成員。通過BLAST同源比對(duì)，菌株TNSC2011的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析后，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，該菌株 TNSC2011 與 JcAroffioAacier marpla tens is B2 (EU150134)處于最小分支，是其近似種；進(jìn)而將該菌株TNSC2011確定為Ackromobactor marpla tensis0
[0010]本發(fā)明提供的內(nèi)生促生菌TNSC2011培養(yǎng)時(shí)使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉；使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、甘油、甘露醇、麥芽糖；使用的無(wú)機(jī)組分包括包括但不限于氯化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鈉、氫二鉀、磷酸三鈣、二水氯化鈣、七水合硫酸鎂、七水和硫酸亞鐵。本發(fā)明的根際促生菌發(fā)酵可在20-37°C，pH5.5-9.1的環(huán)境下進(jìn)行。并且該內(nèi)生促生菌TNSC2011能高產(chǎn)吲哚乙酸并能利用難溶性磷酸鹽為磷源進(jìn)行生長(zhǎng)。
[0011]本發(fā)明提供的甜菜內(nèi)生菌TNSC2011有分泌IAA的能力:
當(dāng)在 GPB 培養(yǎng)液 DFsalts minimal medium (IL): 4.0g KH2PO4, 6.0gNa2HPO4, 0.2gMgS04.7H20, 2.0g glucose, 2.0g gluconic acid, 2.0g citricacid;痕量兀素:Img FeSO4.7H20, IOmgH3BO3, 11.1mg MnSO4.H2O, 124.6mg ZnSO4.7H20, 78.22mgCuSO4.5H20, IOmg MoO3; pH7.2; and2.0g (NH4) 2S04 中加入 L-色氨酸 100 μ g.ml/1，在48-120h促生菌均產(chǎn)生大量的ΙΑΑ，在96h分泌的激素達(dá)到最高值，高達(dá)141.73 Pg(mL -OD600unit) ―1 (每0D_發(fā)酵液的激素含量)；促生內(nèi)生菌TNSC2011有分泌植物激素GA的能力，在培養(yǎng)48-120h促生菌均產(chǎn)生大量的GA，在120h三株菌分泌的激素(GA)達(dá)到最高值，達(dá)到1531.42M-g CmL.0D600 unit) ^10 [0012]進(jìn)一步,本發(fā)明提供甜菜內(nèi)生細(xì)菌在甜菜栽培上的應(yīng)用。該細(xì)菌TNSC2011菌株對(duì)于甜菜具有促進(jìn)生長(zhǎng)增加含糖率的作用，獲得良好的技術(shù)效果O
[0013]本發(fā)明進(jìn)一步提供了菌種甜菜內(nèi)生細(xì)菌marpla tens is TNSC2011CGMCC N0.8192的保存條件，采用TSA培養(yǎng)基成分:TSA胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，葡萄糖 2.5g，氯化鈉 5g K2HPO4 2.5g PH=7.0 定容至 1000ml ;培養(yǎng)條件:28°C, PH=7.0。
[0014]通過實(shí)施本發(fā)明具體的
【發(fā)明內(nèi)容】
，可以達(dá)到以下有益效果:
本發(fā)明分離篩選提供的甜菜內(nèi)生細(xì)菌JcAroffioAacier marpla tensisTW^Q2S) 11 CGMCCN0.8192是一種優(yōu)良的內(nèi)生促生菌，該內(nèi)生促生菌TNSC2011能高產(chǎn)吲哚乙酸并能利用難溶性磷酸鹽為磷源進(jìn)行生長(zhǎng)，具有強(qiáng)的分泌IAA的能力和具有比較強(qiáng)的分泌植物激素GA的能力，通過在甜菜栽培上的應(yīng)用，獲得促進(jìn)生長(zhǎng)增加含糖率的作用，獲得良好的技術(shù)效果。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1 顯不為甜菜內(nèi)生細(xì)菌 Achromobacter marpla ie/?5,i5,TNSC2011 CGMCC N0.8192的菌落形態(tài)圖。
[0016]圖2 顯不為甜菜內(nèi)生細(xì)菌 Achromobacter marpla ie/?5,i5,TNSC2011 CGMCC N0.8192的生長(zhǎng)曲線圖。
[0017]圖3 顯不為甜菜內(nèi)生細(xì)菌marpla ie/?5,i5,TNSC2011 CGMCC N0.8192的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹圖。
[0018]圖4 顯不為甜菜內(nèi)生細(xì)菌 Achromobacter marpla ie/?5,i5,TNSC2011 CGMCC N0.8192對(duì)甜菜內(nèi)源激素indole acetic acid (IAA)的影響圖。
[0019]圖5 顯不為甜菜內(nèi)生細(xì)菌marpla tens is TNSC2011 CGMCC N0.8192對(duì)甜菜內(nèi)源激素abscisic acid (ABA)的影響圖。
[0020]圖6 顯不為甜菜內(nèi)生細(xì)菌 JcAroffioAacier marpla tens is TNSC2011 CGMCC N0.8192對(duì)甜菜內(nèi)源激素gibberellic acid (GA)的影響圖。
[0021 ]圖 7 顯不為甜菜內(nèi)生細(xì)菌 Achromobacter marpla ie/?5,i5,TNSC2011 CGMCC N0.8192對(duì)甜菜內(nèi)源激素zeatin riboside (ZR)的影響圖。
[0022]圖 8 顯不為甜菜內(nèi)生細(xì)菌 Achromobacter marpla ie/?5,i5,TNSC2011 CGMCC N0.8192生長(zhǎng)與溶磷的關(guān)系圖。[0023]圖9 顯不為甜菜內(nèi)生細(xì)菌 Achromobacter marp I at en s i sH2Q\\ CGMCC N0.8192溶磷與pH的關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面，舉實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。
[0025]本發(fā)明中涉及到的主要原輔材料、試劑和儀器設(shè)備:
本發(fā)明選用的培養(yǎng)基及其它材料:DFsalts minimal medium (IL): 4.0g KH2PO4, 6.0gNa2HPO4, 0.2gMgS04.7H20, 2.0g glucose, 2.0g gluconic acid, 2.0g citricacid;痕量兀素:Img FeSO4.7H20, IOmgH3BO3, 11.1mg MnSO4.H2O, 124.6mg ZnSO4.7H20, 78.22mgCuSO4.5H20, IOmg MoO3; pH7.2; and2.0g (NH4)2SO4 中加入 L-色氨酸 100 μ g.mL'0.7mmol.l1 磷酸緩沖液(ρΗ6.9):用 0.2606g.I/1 Na2HPO4.Iffi2O 調(diào) 0.1092g.L-1NaH2PO4.2H20 至 ρΗ6.9。
[0026]主要儀器與試劑:TG328A型分析天平，AB204-N型電子天平，PHS-3TC (0.01級(jí))精密數(shù)顯酸度計(jì)，101-2型干燥箱，UV-2100分光光度計(jì)，HYG-1I回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜，LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌器，超凈工作臺(tái)，3K15臺(tái)式冷凍離心機(jī)；甘油，牛肉膏，酵母膏，氯化鈉，氫氧化鈉，葡萄糖，硫酸鎂，硫酸鋅，硫酸亞鐵，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，瓊脂，鹿糖，次氯酸鈉，PCR預(yù)混液(TaKaRa Biotechnology),其余試劑均為分析純。
[0027]本發(fā)明中選用的所有原輔材料，以及選用的菌種培養(yǎng)方法都為本領(lǐng)域熟知選用的，本發(fā)明中涉及到的％都為重量百分比，除非特別指出除外。
[0028]實(shí)施例一:甜菜內(nèi)生細(xì)菌JcAr Aac ter marpla tensisTW^Q2S) 11 CGMCC N0.8192的分離、篩選及鑒定
(I)菌種的分離和篩選
從健康甜菜中通過梯度稀釋法分離出多株產(chǎn)IAA的細(xì)菌，從中篩選出一株編號(hào)為TNSC2011的菌株，可有效促進(jìn)作物生長(zhǎng)，同時(shí)可將難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可被生物利用的可溶性磷酸鹽，提高光合作用。通過在甜菜栽培中應(yīng)用，具有突出的促生作用。
[0029]該菌株菌落較小且平滑，呈透明、白色、表面濕潤(rùn)、邊緣整齊，生長(zhǎng)較快；通過革蘭氏染色，鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)該菌株為革蘭氏陰性菌.經(jīng)微生物學(xué)鑒定為
菌，細(xì)胞桿狀，0.8-1.0umX1.5-2um，革藍(lán)氏陰性(_)，不產(chǎn)芽抱，菌落中等且平滑，不透明、白色、表面濕潤(rùn)、邊緣整齊。參見附圖1。該菌嚴(yán)格好氧，氧化酶陽(yáng)性；不能利用葡萄糖、木糖產(chǎn)酸，不能水解淀粉。依照第九版《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》({Bergey, s Manual of Sys tema ti c Bac teri o -logy)))和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)TNSC2011菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測(cè)定，生理生化檢測(cè)確定TNSC2011菌株為無(wú)色桿菌屬中的成員。通過BLAST同源比對(duì)，菌株TNSC2011的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析后，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，該菌株 TNSC2011 與 JcAroffioAacier marpla tens is B2 (EU150134)處于最小分支，是其近似種；進(jìn)而將該菌株TNSC2011確定為Ackromobactor marpla tensis0
[0030]通過上述對(duì)TNSC2011菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測(cè)定，并對(duì)菌株TNSC2011的形狀、大小、生理生化反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明的TNSC2011菌株生物學(xué)特性如表1所示。
[0031]表1:菌株TNSC2011的生理生化特性
【權(quán)利要求】
1.一種甜菜內(nèi)生細(xì)菌其特征在于，所述的甜菜內(nèi)生細(xì)菌 ^cAzy遍9/?況 ter marpla tens is TNSC2011 的菌種保藏號(hào)為 CGMCC N0.8192。
2.—種如權(quán)利要求1所述的甜菜內(nèi)生細(xì)菌ma rpla te/?6,i6,TNSC2011在甜菜栽培上的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103642733SQ201310660475
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】史應(yīng)武, 高雁, 楊紅梅, 張濤, 林青, ?，|, 李玉國(guó), 歐提庫(kù)爾瑪合木提, 婁愷 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所