基于滾環(huán)擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于滾環(huán)擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，在洗凈的金電極上滴加捕獲探針，冰箱中過夜后取出封閉，在金電極上滴加待測樣品，反應(yīng)完后再滴加環(huán)化DNA，反應(yīng)，滾環(huán)擴增，再加入金納米探針，雜交，進行DPV信號檢測。本發(fā)明選用沙門菌高度保守的invA基因，設(shè)計與其特異性結(jié)合的探針，結(jié)合滾環(huán)擴增與金納米技術(shù)，利用電化學(xué)技術(shù)檢測沙門菌invA基因，靈敏度上有了極大的改善，使得檢測的線性范圍達到100aM～10pM，靈敏度為：100aM。污染牛奶中沙門菌檢測范圍為20～6×108CFU?mL-1的沙門菌，最低檢測限為20CFU?mL-1。本發(fā)明構(gòu)建了快速和超靈敏檢測沙門菌的方法，極大提高了檢測的靈敏度，具有檢測設(shè)備小型化、簡便快速和檢測成本低的特點。
【專利說明】基于滾環(huán)擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種沙門菌基因的檢測方法，尤其涉及一種基于滾環(huán)擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，屬于生物檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]沙門氏菌屬腸桿菌科，是革蘭陰性腸道桿菌，它是食源性疾病中最重要的致病菌之一。沙門氏菌感染后主要引起食物中毒、胃腸炎、傷寒和副傷寒。有研究表明，沙門氏菌的侵襲蛋白與其致病性密切相關(guān)，決定著細(xì)菌進入宿主上皮細(xì)胞的能力。它主要由一系列基因編碼，其中invA是編碼沙門菌侵染上皮細(xì)胞表面蛋白的基因，與該菌致病性密切相關(guān)，是沙門菌特有的。
[0003]目前，最常用的腸道致病菌檢測方法主要有三種:傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)(PCR)。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定法是將細(xì)菌分離培養(yǎng)后通過菌落計數(shù)和菌落形態(tài)、染色特征、生化反應(yīng)等方法對細(xì)菌進行鑒定，該方法是細(xì)菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但是其耗時費力。ELISA方法是基于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)檢測，與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定方法相比較，縮短了檢測時間，但是仍然需要細(xì)菌培養(yǎng)這一步，至少需要24~48小時才能得出準(zhǔn)確的結(jié)果，而且該方法的檢測限一般為> IO5CFU mL—1，難以滿足低濃度細(xì)菌的檢測。PCR技術(shù)與上述兩種方法相比較，優(yōu)點是較高的靈敏度，但是PCR結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性；目前實驗室主要用凝膠電泳技術(shù)來檢測PCR擴增的片段，但是凝膠電泳技術(shù)的分辨率較低且需要較高精確度的熱循環(huán)儀，因此限制了 PCR技術(shù)在實驗室檢測細(xì)菌的廣泛運用。另一方法，不使用熱循環(huán)儀的核酸依賴的擴增(NASBA)和自主序列復(fù)制系統(tǒng)(ASR)，在特異性上又大打折扣，主要是由于必須用一個相對較低的溫度40°C來進行擴增。鏈置換擴增術(shù)(SDA)利用四種引物在等溫條件下擴增，很大程度上克服了這些缺陷，但是仍然存在薄弱的環(huán)節(jié):必須利用昂貴的修飾核苷酸作為底物來進行擴增反應(yīng)。
[0004]生物學(xué)研究領(lǐng)域中經(jīng)常遇到一些不能直接擴增的待測分子，且由于其濃度較低而無法檢測，因而信號放大技術(shù)對不能進行直接擴增的低濃度待測分子的檢測顯得尤為重要。核酸分子體外擴增是生物技術(shù)研究的重要手段，如用于病毒檢測和遺傳病點突變檢測方面的連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、支鏈DNA信號放大系統(tǒng)(bDNA)和侵染探針技術(shù)(Invader)；用于快速準(zhǔn)確檢測和定量分析RNA的NASBA和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA);用于檢測目的DNA片段的Qi3復(fù)制等。目前為止，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和滾環(huán)擴增(rolling circleamplification, RCA)仍是使用較多的擴增技術(shù)。RCA是新近發(fā)展起來的一種恒溫核酸擴增方法。以環(huán)狀DNA為模板，通過一個短的DNA引物(與部分環(huán)狀模板互補)，在酶催化下將dNTPs轉(zhuǎn)變成單鏈DNA，此單鏈DNA包含成百上千個重復(fù)模板片段。這種方法不僅可以直接擴增DNA和RNA，還可以實現(xiàn)對靶核酸的信號放大，靈敏度達到一個拷貝的核酸分子，因此在核酸檢測中具有很大的應(yīng)用價值和潛力。RCA技術(shù)的優(yōu)勢是:高靈敏度、高特異性、簡單、易操作、多元性、高通量。
[0005]納米顆粒是一種人工合成的微小顆粒，它的形態(tài)可能是乳膠體、聚合物、陶瓷顆粒、金屬顆粒和碳顆粒。1996年，Mirkin等人(Mirkin, C.A., et al ；)發(fā)現(xiàn)表面修飾有核酸探針的13nm金顆粒溶液中加入與修飾核酸互補配對的目標(biāo)核酸分子時，由于金顆粒聚集導(dǎo)致溶液的顏色由紅變藍。自此利用納米顆粒來進行生物分子檢測的研究得到廣泛應(yīng)用。目前通用的方法主要分為兩種，一種是利用在金或銀納米顆粒修飾核酸探針，根據(jù)溶液的顏色變化來檢測目標(biāo)核酸分子，優(yōu)點是檢測方法簡單，但是所用的納米顆粒成本較高?’另一種是利用在顆粒表面修飾核酸分子，通過不同的核酸擴增手段后加入熒光探針來進行目標(biāo)分子檢測，優(yōu)點是檢測的靈敏度高，但是熒光探針的成本也較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于構(gòu)建快速和超靈敏檢測沙門菌invA基因的方法，選用沙門菌高度保守的invA基因，設(shè)計與其特異性結(jié)合的探針，利用滾環(huán)擴增與金納米技術(shù)，用電化學(xué)策略檢測沙門菌，提供一種檢測設(shè)備小型化、簡便快速、靈敏度高、檢測成本低的檢測方法。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種基于滾環(huán)擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，包括以下步驟:
[0008]1)將裸金電極拋光，洗滌，然后浸入食人魚溶液中10~15min，再取出清洗、干燥；
[0009]2)將巰基標(biāo)記的捕獲探針滴加于上述金電極上，置于4°C冰箱中過夜；
[0010]3)將步驟2中的金電極取出，沖洗，用6-巰基-1-己醇封閉I~1.5h，再次沖洗金電極，然后用鮭魚精DNA和2%BSA混合溶液封閉金電極30~40min ；
[0011]4)將步驟3中封閉后的金電極取出沖洗，在金電極上滴加待測樣品溶液，37°C反應(yīng)I~1.5h，然后在金電極上滴加提前制備好的環(huán)化DNA，37°C反應(yīng)I~1.5h ;
[0012]5)將步驟4中的金電極取出沖洗，加入含dNTP、phi29DNA聚合酶的滾環(huán)擴增反應(yīng)液，37 °C滾環(huán)擴增I~1.5h ;
[0013]6)將步驟5中的金電極取出沖洗，加入用2XSSC雜交液配制的金納米探針，37°C雜交I~1.5h，用DEA緩沖液清洗電極；
[0014]7)在步驟6中的金電極上加入用含有0.8%BSA的DEA緩沖液配制的1.25 μ g/mL的ST-AP，37°C反應(yīng)30~45min，用DEA緩沖液沖洗后，置入用DEA緩沖液配制的0.75mg/mL的α -NP底物溶液中進行差動脈沖伏安法DPV信號檢測，所得信號用標(biāo)準(zhǔn)曲線法或標(biāo)準(zhǔn)對照法即可得到待檢樣品中沙門菌的濃度。
[0015]所述步驟I中金電極拋光用粒度為0.05 μ m的氧化鋁粉，所述的食人魚溶液為濃H2SO4IH2O2體積比為3:1的溶液。
[0016]所述的巰基標(biāo)記的捕獲探針序列為:5’ -SH-(CH2)6- TTTTTTTTTAATACCGGCCTTCAAATCGGCATC-3’，用于制備金納米探針的用巰基標(biāo)記的信號探針序列為:5’ -SH-(CH2)6-TTTTTTTCAGAACTCACCTGTTAGTTTTTT-biotin-3’，制作環(huán)化模板 DNA 時所用的待環(huán)化模板 DNA 序列為:5’ -p-CTCAGCTGTGTAA CAACATGAAGATTGTAGGTCAGAACTCACCTGTTAGAAACTGTGAAGATC GCTTATTATG TCCTATC-3'，探針 2 序列:5’ - AATACTCATCTGTTTACCGGGCA TAAAAAAAAACACAGCTGAGGATAGGACAT-3，。
[0017]所述步驟3至6中金電極的沖洗按照如下步驟完成:先用含0.005%吐溫20的Tris-HCl緩沖液沖洗三次，然后再用Tris-HCl緩沖液沖洗三次，Tris-HCl緩沖液為含有
0.1M 氯化鈉、5mM 氯化鎂、20mM Tris-HCl, ρΗ7.4。
[0018]所述步驟3中的鮭魚精DNA和2%BSA混合溶液按濃度為10mg/ml的鮭魚精DNA與2%BSA體積比為1:80混合配制。
[0019]所述步驟5中的滾環(huán)擴增反應(yīng)液中含50mM Tris, IOmM氯化鎂，33mM醋酸鉀，ImM二硫蘇糖醇，0.1%吐溫-20，pH7.5。
[0020]所述步驟6中的2 X SSC雜交液含有0.3M氯化鈉，0.03M檸檬酸三鈉，pH7.4 ;所述DEA緩沖液為含有0.1M 二乙醇胺，ImM氯化鎂，IOOmM氯化鉀，pH9.6。
[0021]該方法沙門菌特異性的invA基因檢測的線性范圍為IOOaM~ΙΟρΜ，最低檢測限為=IOOaM0
[0022]有益效果:本發(fā)明選用沙門菌高度保守的invA基因，設(shè)計與其特異性結(jié)合的探針，結(jié)合滾環(huán)擴增與金納米技術(shù)，基于其信號放大作用，利用電化學(xué)技術(shù)檢測沙門菌，檢測限上有了極大的改善，invA基因檢測靈敏度達到IOOaM~ΙΟρΜ，最低檢測限為:100aM。污染牛奶中沙門菌檢測范圍為20~6 X IO8CFU ml/1的沙門菌，最低檢測限為20CFU mL—1。本發(fā)明構(gòu)建了快速和超靈敏檢測沙門菌invA基因的方法，極大提高了檢測的靈敏度，在檢測上不需要昂貴的儀器設(shè)備，具有檢測設(shè)備小型化、簡便快速、靈敏度高和檢測成本低的特點。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明的檢測原理示意圖；
[0024]圖2為本發(fā)明的沙門菌invA基因濃度與電流信號線性關(guān)系圖；
[0025]圖3為本發(fā)明的傳感器特異性考察圖，其中Comp I ement為沙門菌靶序列，Non-complement為作為對照的非完全互補序列，Blank為空白對照；
[0026]圖4為本發(fā)明的沙門菌濃度與電流信號線性關(guān)系圖。
【具體實施方式】
[0027]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明:
[0028]本發(fā)明中的ST-AP 為 Streptavidin-alkaline Phosphatase,中文名稱為親和素標(biāo)記堿性磷酸酶，購自Sigma公司(美國)。
[0029]本發(fā)明中的α-NP為a-Naphthyl Phosphate,中文名稱為1-萘基磷酸酯,購自Sigma公司(美國)。
[0030]本發(fā)明中的BSA為bovine serum albumin,中文名稱為小牛血清白蛋白，購自Sigma公司(美國)。
[0031]實施例一、制備環(huán)化DNA
[0032]將100nmol5’端磷酸化的待環(huán)化模板DNA與IOOnmol探針2混合于100 μ L連接緩沖液中(ρΗ7.5，50mM Tris, IOmM MgCl2, IOmM 二硫蘇糖醇，0.5mM ATP)，接著加入 0.2U 的T4DNA連接酶，于37°C連接反應(yīng)60分鐘；65°C 10分鐘滅活T4DNA連接酶，得到的環(huán)化模板DNA在-20 V下保存?zhèn)溆谩Ｋ玫? ’端磷酸化的待環(huán)化模板DNA序列為:5 ’ -p-CTCAGCTGTGTAACAACATGAAGATTGTAGGTCAGAACTCACCTGTTAGAAACTGTGAAGAT CGCTTATTA TGTCCTATC-3',探針 2 序列為:5’ - AATACTCATCTGTTTACCG GGCATAAAAAAAAACACAGCTGAGGATAGGACAT-3’。[0033]實施例二、金納米粒子和金納米探針的制備
[0034](1)用王水浸泡所有器皿24小時，用雙蒸水將其沖洗干凈備用。
[0035](2)配制1OOmL0.01%的HAuCl4.4Η20去離子水溶液，置于加熱磁力攪拌器上攪拌，待溶液煮沸后迅速加入4mLl%檸檬酸三鈉溶液。金納米粒子溶液顏色首先變黑，再逐漸變?yōu)榫萍t色。繼續(xù)攪拌8~10分鐘后，關(guān)閉熱源并繼續(xù)攪拌冷卻至室溫，放入4°C冰箱內(nèi)備用。
[0036](3)取9 μ LlOO μ M巰基標(biāo)記的信號探針加入300 μ L上述步驟2中的金納米粒子溶液中，在磁力攪拌器上4°C過夜攪拌12小時。所述的信號探針序列為:5’ -SH-(CH2)6-TTTTTTTCAGAACTCACCTGTTAGTTTTTT-biotin-3’。
[0037](4)在上述步驟3中過夜攪拌的金納米粒子溶液中加入0.5M NaCl老化，攪拌12小時。
[0038](5)步驟4中的溶液停止攪拌后收集至離心管8000rpm離心30分鐘，去除上清液，所得的DNA修飾的金納米探針溶于2 X SSC溶液(pH7.4，含有0.3M氯化鈉，0.03M檸檬酸三鈉)中放置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0039]實施例三、制備待檢樣品
[0040]一、提取用作PCR模板的基因組DNA
[0041]由于沙門菌感染很多是食源性的，因此通?？梢杂檬称坊蛘呒S便作為檢測源。
[0042]用食品檢測:在無菌條件下進行操作，將待檢食品放入勻漿機中攪成勻漿，取25g(或mL)待檢樣品的勻漿用225mL緩沖蛋白胨水(BP)稀釋成1: 10的均質(zhì)勻漿液。取1mL均質(zhì)勻衆(zhòng)液置于離心管中，12000r/min離心5min,滅菌生理鹽水洗漆2次,最后用0.25mL蒸餾水懸浮，置于100°C水浴中孵育15分鐘然后立即置于冰中。在4°C以12000r/min離心10分鐘后，將上清液轉(zhuǎn)移至新管中，該上清液中即含有可以直接用作PCR模板的基因組DNA。
[0043]用糞便檢測:取腹灣患者糞便標(biāo)本200mg,使用QIAamp DNA Stool MiniKit (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA, Cat N0.51504)試劑盒進行 DNA 的分離提取,具體步驟按照說明書操作。
[0044]二、擴增得到待檢的PCR產(chǎn)物樣品
[0045]配制PCR反應(yīng)液，含有:取步驟一中來源于食品或者糞便的含有基因組DNA的上清液 5.0 μ L，20 μ M 的正反向引物各 L O μ L，25 μ L 的 Premix Taq(l.25U DNApolymerase, 2XTaq buffer, 0.4mM dNTPs)和 18 μ L 水，PCR 反應(yīng)的最終體積為 50 μ L。根據(jù)沙門菌高度保守的invA基因，利用NCBI網(wǎng)站的Primer Blast模塊設(shè)計invA基因的擴增引物，正向引物序列為:5 ’ -GCATCCGCA TCAATAATACCG-3 ’，反向引物序列為:5’ -TTCTCTGGATGGTATGCCC-3’。PCR反應(yīng)條件如下:95°C預(yù)變性1分鐘；接著95°C變性30秒，51°C退火30秒，72°C引物延伸30秒，35個循環(huán)，最后72°C延伸4分鐘。擴增產(chǎn)物保藏于4°C冰箱備用，即得到待檢樣品。
[0046]實施例四、基于滾環(huán)擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，按照以下步驟進行:
[0047]1)將裸金電極用粒度為0.05 μ m的氧化鋁粉拋光，超聲清洗，然后浸入食人魚溶液中(濃H2S04:H202=3:1) 10~15min，用去離子水清洗金電極后室溫自然干燥；[0048]2)將10 μ L的IOOnM巰基標(biāo)記的捕獲探針滴加于上述金電極上，置于4°C冰箱中過夜。所述的疏基標(biāo)記的捕獲探針序列為:
[0049]5，-SH-(CH2) 6 - TTTTTTTTTAATACCGGCCT TCAAATCGGCATC-3，。
[0050]3)將步驟2中的金電極取出，沖洗，用6-巰基-1-己醇封閉I~1.5h，再次沖洗金電極，然后用鮭魚精DNA和2%BSA混合溶液封閉金電極30~40min ;所述的鮭魚精DNA和2%BSA混合溶液按濃度為10mg/mL的鮭魚精DNA與2%BSA體積比為1:80混合配制；
[0051]4)將步驟3中封閉后的金電極取出沖洗，在金電極上滴加10 μ L待測樣品溶液37°C反應(yīng)I~1.5h，然后在金電極上滴加10 μ L提前制備好的環(huán)化DNA，37 °C反應(yīng)I~
1.5h ；
[0052]5)將步驟4中的金電極取出沖洗，加入10μ L含ImM dNTP,0.2U phi29DNA聚合酶的滾環(huán)擴增反應(yīng)液(含50mM Tris, IOmM氯化鎂，33mM醋酸鉀，ImM 二硫蘇糖醇，0.1%吐溫-20，ρΗ7.5)，37°C滾環(huán)擴增 I ~1.5h ;
[0053]6)將步驟5中的金電極取出沖洗，加入用2 X SSC雜交液配制的金納米探針，37°C雜交I~1.5h，用DEA緩沖液清洗電極；所述的2 X SSC雜交液含有0.3M氯化鈉，0.03M檸檬酸三鈉，pH7.4 ;所述DEA緩沖液為含有0.1M 二乙醇胺，ImM氯化鎂，IOOmM氯化鉀，pH9.6 ；
[0054]所述步驟3至6中金電極的沖洗按照如下步驟完成:先用含0.005%吐溫20的Tris-HCl緩沖液沖洗三次，然后再用Tris-HCl緩沖液沖洗三次，Tris-HCl緩沖液含有0.1M氯化鈉、5mM 氯化鎂、20mM Tris-HCl, pH7.4 ；
[0055]7)在步驟6中的金電極上加入用含有0.8%BSA的DEA緩沖液配制的1.25 μ g/mL的ST-AP，37°C反應(yīng)30~45min，先用含有0.005%吐溫20的DEA緩沖液沖洗三次，再用不含吐溫20的DEA緩沖液沖洗三次，置入DEA緩沖液配制的0.75mg/mL的α -NP底物溶液中進行DPV信號檢測，所得信號用標(biāo)準(zhǔn)曲線法或標(biāo)準(zhǔn)對照法即可得到待檢樣品中沙門菌的濃度。
[0056]電化學(xué)檢測DPV信號，DPV信號和沙門菌invA基因的濃度線性關(guān)系圖如圖2所示，計算得到其線性關(guān)系為:ip (A)=0.14XlgC+0.72，其中ip為電流信號強度，C為沙門菌invA基因濃度。根據(jù)得到的電流信號強度值，即可換算得到待檢樣品中的沙門菌invA基因的濃度值。
[0057]為了研究傳感器的特異性，非完全互補的合成DNAs被用來驗證。使用該方法分別檢測待檢樣品、非完全互補序列(序列為5’ - AGCGCAGCTGCGCAAT AGAATTGAAGAGGATTATGATGGCTACGTGAA - 3’)和空白對照，得到利用該方法檢測的傳感器特異性考察圖，如圖3所示，從特異性考察圖中可以看出非完`全互補序列的DPV響應(yīng)值明顯低于靶DNA，信號值與空白信號相近。這些結(jié)果表明設(shè)計的傳感器能有效區(qū)分不同的DNA序列，表現(xiàn)出良好的選擇性。
【權(quán)利要求】
1.一種基于滾環(huán)擴增和金納米對沙門菌irwA基因檢測的方法，包括以下步驟: 1)將裸金電極拋光，洗滌，然后浸入食人魚溶液中10~15min，再取出清洗、干燥； 2)將巰基標(biāo)記的捕獲探針滴加于上述金電極上，置于4°C冰箱中過夜； 3)將步驟2中的金電極取出，沖洗，用6-巰基-1-己醇封閉I~1.5h，再次沖洗金電極，然后用鮭魚精DNA和2%BSA混合溶液封閉金電極30~40min ； 4)將步驟3中封閉后的金電極取出沖洗，在金電極上滴加待測樣品溶液，37°C反應(yīng)I~1.5h，然后在金電極上滴加提前制備好的環(huán)化DNA，37°C反應(yīng)I~1.5h ; 5)將步驟4中的金電極取出沖洗，加入含dNTP、phi29DNA聚合酶的滾環(huán)擴增反應(yīng)液，37°C滾環(huán)擴增I~1.5h ; 6)將步驟5中的金電極取出沖洗，加入用2X SSC雜交液配制的金納米探針，37°C雜交I~1.5h，用DEA緩沖液清洗電極； 7)在步驟6中的金電極上加入含有0.8%BSA的DEA緩沖液配制的1.25 μ g/mL的ST-AP，37°C反應(yīng)30~45min，用DEA緩沖液沖洗后，置入用DEA緩沖液配制的0.75mg/mL的α -NP底物溶液中進行示差脈沖伏安法DPV信號檢測，所得信號用標(biāo)準(zhǔn)曲線法或標(biāo)準(zhǔn)對照法即可得到待檢樣品中沙門菌的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于滾環(huán)擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，其特征在于:所述步驟I中金電極拋光用粒度為0.05 μ m的氧化鋁粉，所述的食人魚溶液為濃H2SO4 = H2O2，體積比為 3:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于滾環(huán)擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，其特征在于:所述的巰基標(biāo)記的捕獲探針序列為:5 ’ -SH- (CH2) 6 - TTTTTT TTTAATACCGGCCTTCAAATCGGCATC-3’，用于制備金納米探針的用巰基標(biāo)記的信號探針序列為:5’ -SH-(CH2) 6-TTTTTTTCAGAACTCACCTGTTAGTTTT TT-biotin-3，，制作環(huán)化 DNA 時所用的待環(huán)化模板 DNA 序列為:5’ -p-CTC AGCTGTGTAACAACATGAAGATTGTAGGTCAGAACTCACCTGTTAGAAACTGTGAAGATCGCTTATTATG TCCTATC-3'，探針 2 序列為:5’ - AATACTCATC TGTTTACCGGGCATAAAAAAAAACACAGCTGAGGATAGGACAT-3，。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于滾環(huán)擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，其特征在于:所述步驟3至6中金電極的沖洗按照如下步驟完成:先用含0.005%吐溫20的Tris-HCl緩沖液沖洗三次，然后再用Tris-HCl緩沖液沖洗三次，Tris-HCl緩沖液為含有0.1M 氯化鈉、5mM 氯化鎂、20mM Tris-HCl, ρΗ7.4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于滾環(huán)擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，其特征在于:所述步驟3中的鮭魚精DNA和2%BSA混合溶液按濃度為10mg/ml的鮭魚精DNA與2%BSA體積比為1:80混合配制。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于滾環(huán)擴增和金納米對沙門菌irwA基因檢測的方法，其特征在于:所述步驟5中的滾環(huán)擴增反應(yīng)液中含50mM Tris, IOmM氯化鎂，33mM醋酸鉀，ImM二硫蘇糖醇，0.1%吐溫-20，pH7.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于滾環(huán)擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，其特征在于:所述步驟6中的2XSSC雜交液為含有0.3M氯化鈉，0.03M檸檬酸三鈉，pH7.4 ;所述DEA緩沖液為含有0.1M 二乙醇胺，ImM氯化鎂，IOOmM氯化鉀，pH9.6。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于滾環(huán)擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，其特征在于:沙門菌特 異性的irwA基因檢測的線性范圍為IOOaM~ΙΟρΜ，最低檢測限為:IOOaM0
【文檔編號】C12R1/42GK103614483SQ201310665170
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】丁世家, 周欽, 李劍波, 程偉, 顏玉蓉, 朱丹, 申波, 雷品華, 張偉, 李佳迅, 董芳 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)