一種重組表達淀粉酶的工程菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種重組表達淀粉酶的工程菌及其應(yīng)用。本發(fā)明通過將地衣芽孢桿菌的淀粉酶基因?qū)牒谇顾拗骷毎?，?gòu)建了重組表達該基因的黑曲霉工程菌。所述黑曲霉工程菌能高效表達淀粉酶，發(fā)酵酶活達1650U/mL。重組淀粉酶的最適作用pH為6.5，最適作用溫度為55℃，為耐高溫淀粉酶，可廣泛用于食品添加劑領(lǐng)域，尤其是啤酒生產(chǎn)領(lǐng)域。
【專利說明】一種重組表達淀粉酶的工程菌及其應(yīng)用
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】 本發(fā)明屬于微生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種重組表達淀粉酶的工程菌及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 淀粉酶是指能水解淀粉、糖原和有關(guān)多糖中的0-葡萄糖鍵的酶類總稱，根據(jù)作用 的方式可分為α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶廣泛分布于動物、植物和微生物。微 生物的酶幾乎都是分泌性的。α -淀粉酶既可以作用于直鏈淀粉，也可作用于支鏈淀粉，無 差別的切斷α-1，4_鏈。因此其特征是引起底物溶液粘度的急劇下降和碘反應(yīng)的消失，最 終產(chǎn)物在分解直鏈淀粉時以麥芽糖為主，此外，還有少量麥芽三糖及少量葡萄糖。另一方 面，在分解支鏈淀粉時，除麥芽糖、葡萄糖外，還生成分支部分具有α-1，6_鍵的α-極限糊 精。β_淀粉酶與α-淀粉酶的不同點在于從非還原性末端逐次以麥芽糖為單位切斷α-1， 4-葡聚糖鏈。主要見于高等植物中，但也有報告在細菌、牛乳、霉菌中存在。對于像直鏈淀 粉那樣沒有分支的底物能完全分解得到麥芽糖和少量的葡萄糖。作用于支鏈淀粉或葡聚糖 的時候，切斷至α-1，6-鍵的前面反應(yīng)就停止了，因此，生產(chǎn)分子量比較大的極限糊精。 [0003] 淀粉酶可廣泛應(yīng)用于麥芽糖、糖漿、糊精等的生產(chǎn)，在紡織工業(yè)中，淀粉酶可催化 織物上的淀粉漿料，由于淀粉酶的高效性及專一性，酶退漿的退漿率高，退漿快，污染少，產(chǎn) 品比酸法、堿法更柔軟，且不損傷纖維。在酒精生產(chǎn)和釀酒工業(yè)中使用霉菌淀粉酶能有效提 高糖化率，酒精出率和酶母的生長。淀粉酶還可應(yīng)用于出來淀粉生產(chǎn)過程中的廢水，減輕對 環(huán)境的污染。因此現(xiàn)在對淀粉酶的研究成為熱點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種重組表達淀粉酶的工程菌及其應(yīng)用。本發(fā)明通過將來 源于地衣芽孢桿菌/icAefli/h/wis)的淀粉酶基因轉(zhuǎn)化入黑曲霉 辦·#)中，構(gòu)建得到了高效重組表達淀粉酶的工程菌株，為實現(xiàn)淀粉酶的規(guī)?；a(chǎn)奠定 基礎(chǔ)。
[0005] 本發(fā)明一方面涉及一種重組表達載體，其攜帶有編碼淀粉酶的基因片段。
[0006] 所述基因的編碼核苷酸序列為SEQ ID NO: 1。
[0007] 所述基因編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO: 2。
[0008] 本發(fā)明另一方面提供了一種工程菌，其攜帶有上述重組表達載體。
[0009] 所述工程菌，為黑曲霉 Amy Amy)。
[0010] 所述工程菌在生產(chǎn)淀粉酶中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明通過將地衣芽孢桿菌的淀粉酶基因?qū)牒谇顾拗骷毎?，?gòu)建了重組表 達該基因的黑曲霉工程菌。所述黑曲霉工程菌能高效表達淀粉酶，發(fā)酵酶活達1650U/mL。 重組淀粉酶的最適作用pH為6. 5,最適作用溫度為55°C，為耐高溫淀粉酶，可廣泛用于食品 添加劑領(lǐng)域，尤其是啤酒生產(chǎn)領(lǐng)域。利用本發(fā)明所述淀粉酶進行糊化，比傳統(tǒng)的麥芽糊化方 法更簡單，原料液化效果好，麥汁組成合理，啤酒理化指標和口感質(zhì)量都得到明顯改善，尤 其是麥汁得率大幅度提1?。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1為本發(fā)明所述淀粉酶作用pH-相對酶活曲線； 圖2為本發(fā)明所述淀粉酶作用溫度-相對酶活曲線。

【具體實施方式】
[0013] 本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻 提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，這并不意味著將本發(fā)明限定于所述的任 何具體方法、實驗方案和試劑，因為它們可以改變。
[0014] 除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術(shù)術(shù)語和科學術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng) 域的普通計數(shù)人員通常所理解的相同含義。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 3nd Ed (Singleton et al.，2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale et al.，2003)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所使用的許多術(shù)語的一般性解釋。
[0015] 除非另作說明，核酸是按5'至:V方向從左至右書寫；氨基酸是按氨基至羧基的 方向從左至右書寫。
[0016] 如本文所用，術(shù)語"重組"當被用于指代細胞、核酸、蛋白或載體時，表示該細胞、核 酸、蛋白或載體已通過導入異源核酸或蛋白或者通過改變天然核酸或蛋白而被修飾。因此， 例如，重組細胞是表達在天然（非重組）形式的該細胞中不曾發(fā)現(xiàn)的基因，或者表達天然基 因。
[0017] 術(shù)語"蛋白質(zhì)"和"多肽"在本文中可以互換使用。本文使用氨基酸殘基的傳統(tǒng)的 單字母或三字母代碼。
[0018] 如本文所用，術(shù)語"基因"指參與生產(chǎn)多肽的DNA片段，包括編碼區(qū)之前和之后的 區(qū)域，以及各編碼片段（外顯子）之間的插入序列（內(nèi)含子）。
[0019] 術(shù)語"核酸"包括DNA、RNA，單鏈或雙鏈的，以及它們的化學修飾物。
[0020] 術(shù)語"核酸"和"多核苷酸"在本文中可以互換使用。
[0021] 術(shù)語"載體"指被設(shè)計用來將核酸導入一種或多種細胞類型的多核苷酸序列。載 體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌粒、序列盒以及類似物。
[0022] 術(shù)語"表達載體"表示包含DNA序列的DNA構(gòu)建物，所述DNA序列被可操縱的連接 于能夠影響該DNA在合適宿主中表達的合適的控制序列。此類控制序列可以包括完成轉(zhuǎn)錄 的啟動子、可選的控制轉(zhuǎn)錄的操縱子序列、編碼mRNA上合適的核糖體結(jié)合位點的序列、增 強子以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。
[0023] 術(shù)語"啟動子"表示參與結(jié)合RNA聚合酶以啟動基因轉(zhuǎn)錄的的調(diào)控序列。啟動子 可以是誘導型啟動子或組成型啟動子。
[0024] 與另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比較這兩個 序列時所述百分比的堿基或氨基酸殘基是相同的。
[0025] 由于遺傳密碼是簡并的，所以可以使用一種以上的密碼子來編碼特定的氨基酸， 本發(fā)明包括編碼特定的氨基酸序列的多核苷酸。
[0026] 術(shù)語"宿主菌株"或"宿主細胞"是指表達載體或DNA構(gòu)建物的合適宿主，所述表 達載體或DNA構(gòu)建物包含本發(fā)明的編碼脂肪酶的多核苷酸。具體而言，宿主菌株優(yōu)選地是 絲狀真菌細胞。該宿主細胞可以是野生型絲狀真菌宿主細胞或者經(jīng)遺傳修飾的宿主細胞。 術(shù)語"宿主菌株"或"宿主細胞"指由絲狀真菌菌株細胞所產(chǎn)生的細胞核原生質(zhì)體。
[0027] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。
[0028] 實施例1淀粉酶基因的克隆 將地衣芽孢桿菌過夜培養(yǎng)，取1. 5ml，12000rpm離心1分鐘，除上清；加入200 μ 1裂解 緩沖液（配方為：6〇11111^8-!1(：14!17.8，2〇1111恥-4(3，1111]\^0了4，1.5%505)，用移液器劇烈 吹打；加入66μ 1 5Μ高氯酸鈉溶液混勻，12000rpm離心10分鐘，取上清；加入等體積苯酚抽 提一次，12000rpm離心2分鐘，取上清；加入等體積異丙醇沉淀5分鐘，12000rpm離心5分 鐘；70%乙醇洗滌兩次；最后將干燥的DNA溶于ddH 20。
[0029] 以上述提取的基因組總DNA為模板，利用引物進行PCR擴增。PCR擴增條件為95°C 4min ;94°C 30S ;55°C 40S，72°C lmin 30 個循環(huán)；72°C 7min。利用凝膠回收試劑盒回收 PCR 擴增產(chǎn)物。
[0030] 將回收的擴增產(chǎn)物連接到PMD18T載體，得到的克隆載體命名為pMDT-Amy，送至北 京華大基因研究中心進行測序分析，該擴增產(chǎn)物的核苷酸序列為SEQ ID N0: 1，其編碼蛋白 的氨基酸序列為SEQ ID N0: 2。通過NCBI Blast比對分析發(fā)現(xiàn)，該序列與地衣芽孢桿菌的 淀粉酶序列相似性最高，為77%。
[0031] 實施例2表達載體的構(gòu)建 以質(zhì)粒pMDT-Amy為模板，利用引物進行PCR擴增，PCR擴增條件是95°C 4min ;94°C 30S ;55°C 40S，72°C 1. 2min 30 個循環(huán)；72°C 7min。凝膠回收擴增產(chǎn)物;feo RI 和 Not I 雙 酶切。對表達質(zhì)粒PPIC9K也進行feo RI和Not I雙酶切；用T4連接酶把上述雙酶切產(chǎn) 物4°C連接過夜。最后，把連接產(chǎn)物導入大腸桿菌BL21。相應(yīng)的陽性克隆表達質(zhì)粒命名為 pPIC_Amy〇
[0032] 實施例3黑曲霉工程菌的構(gòu)建 將表達質(zhì)粒pPIC-Amy用I酶切電泳鑒定后，經(jīng)乙醇沉淀濃縮，測定DNA濃度，以 3 μ g/ μ L濃度稀釋質(zhì)粒片段保存?zhèn)溆谩Ｖ苽浜谇笹S115電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，最后重懸于1 mL預(yù)冷的電泳緩沖液中（配方為：lmM MgCl2,10mM HEPES，250mM蔗糖，pH 7. 8)。在80 μ L 感受態(tài)細胞中加入5yL線性化重組質(zhì)粒；電轉(zhuǎn)化(條件為1500ν、200Ω、25μΡ);最后涂布 于麗平板（麗培養(yǎng)基組分：1. 34%ΥΝΒ，4Χ1(Γ5%生物素，0. 5%甲醇)，挑選一個重組菌株，命 名為 Aspergillus niger kmy-l。
[0033] 實施例4發(fā)酵和酶學性質(zhì)測定 將黑曲霉工程菌Amy-Ι接種于5ml BMGY (培養(yǎng)基配方為：1%酵母提取物，2%蛋白陳， 1. 34%YNB，4X10-5%生物素，1%甘油），30°C培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，把菌體加入50ml BMMY誘導培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方為：1%酵母提取物，2%蛋白陳，1. 34%ΥΝΒ，4ΧΚΓ5%生物 素，0. 5%甲醇)，每12小時補加50μ L甲醇，誘導培養(yǎng)5天，200rpm，離心5分鐘，取發(fā)酵液 上清液，進行酶學性質(zhì)和耐受性分析。經(jīng)測定發(fā)酵液上清的酶活為1650U/mL，說明本發(fā)明構(gòu) 建的黑曲霉工程菌能高效重組表達淀粉酶。
[0034] 、最適pH分析 用 pH 值分別為 2· 0、2· 5、3· 0、3· 5、4· 0、4· 5、5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、7· 0、7· 5、8· 0 的緩沖液 進行稀釋測定，在溫度55°C條件下測定酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活，做pH-相 對酶活曲線。結(jié)果如圖1所示，本發(fā)明所述淀粉酶的最適作用pH值為6. 5,且在pH5. 5-7. 0 范圍內(nèi)能保持80%以上的酶活性。
[0035] 、最適溫度分析 分別在 30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、7(TC，ρΗ5· 5 的條件下測定酶 活，以最高酶活為100%，計算相對酶活，做溫度-相對酶活曲線。結(jié)果如圖2所示，本發(fā)明所 述淀粉酶的最適作用溫度為55°C，且在55-67°C范圍內(nèi)能保持70%以上的酶活性。
[0036] 實施例5淀粉酶在啤酒生產(chǎn)中的應(yīng)用 在啤酒生產(chǎn)工藝中，用本發(fā)明的耐高溫淀粉酶替代麥芽，用于啤酒輔料液化，具體工藝 過程如下： 1) 在原料中加入0. 5%耐高溫淀粉酶進行糊化，具體條件：50°C 10s ;95°C 25s ;100°C 10s ； 2) 然后進行糖化，具體條件：37°C 20s ;50°C 60s ;68°C 60s ; ;78°C過濾，大米比例為 30-40%，淀粉酶添加量為12U/g大米，糊化pH7. 5,料水比6 :1，平均糖化時間45min。
[0037] 利用本發(fā)明所述淀粉酶進行糊化，比傳統(tǒng)的麥芽糊化方法更簡單，原料液化效果 好，麥汁組成合理，啤酒理化指標和口感質(zhì)量都得到明顯改善，尤其是麥汁得率大幅度提 商。 SEQUENCE LISTING 〈11〇>青島蔚藍生物集團有限公司 〈120> -種重組表達淀粉酶的工程菌及其應(yīng)用 <160> 2 <170> Patentln version 3. 5 <210> 1 <211> 476 <212> PRT <213> amylase enzyme sequence <400> 1 Met Gin Tyr Phe Glu Trp Phe Leu Pro Lys Val Ala Leu His Gly Lys 15 10 15 Arg Leu Lys Asn Glu Ser Glu Tyr Leu Ala Glu Leu Gly lie Pro Pro 20 25 30 Phe Trp lie Pro Pro Ala Tyr Lys Lys Pro Phe Gin Asp Asp Val Gly 35 40 45 Tyr Gly Val Lys Glu Leu Ser Glu Phe Gly Glu Phe Asn Glu Lys Gly 50 55 60 Thr Val Arg Thr Lys Asn Gly Thr Lys Gly Glu Leu Gin Ser Ala lie 65 70 75 80 Asn Ser Leu His Ser Arg Asp lie Asn Val Tyr Gly Asp Val Val lie 85 90 95 Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Tyr Val Thr Ala Val Glu 100 105 110 Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Thr Ser Gly Glu Gin Arg lie 115 120 125 Lys Ala Trp Thr His Phe Gin Phe Pro Gly Arg Gly Arg Lys Tyr Ser 130 135 140 Asp Phe Lys Phe Phe Trp Tyr His Phe Asp Gly Thr Asp Leu Glu Lys 145 150 155 160 Ser Arg Lys Leu Asn Arg lie Tyr Lys Phe Gin Gly Lys Ala Trp Asp 165 170 175 Leu Lys Phe Ser Lys Val Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Phe Thr Tyr Ala 180 185 190 Asp lie Asp Tyr Asp Leu Pro Glu Ala Thr Ala Glu lie Lys Arg Trp 195 200 205 Gly Thr Gly Ser Pro Lys Glu Leu Gin Leu Asp Gly Phe Arg Leu Glu 210 215 220 Pro Phe Lys His lie Lys Phe Ser Phe Leu Arg Asp Trp Val Lys Leu 225 230 235 240 Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Lys Glu Pro Lys Tyr Trp 245 250 255 Glu Lys Glu Phe Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe 260 265 270 Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Gin Phe His Ala Glu 275 280 285 Ser Thr Gin Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys Phe Leu Asn Gly Thr 290 295 300 Ala Leu Ser Lys His Pro Glu Lys Val Val Thr Phe Val Asp Asn Leu 305 310 315 320 Asp Thr Gin Pro Gly Gin Ser Val Gly Ser Leu Val Gin Thr Trp Phe 325 330 335 Lys Pro Leu Ala Tyr Pro Leu Phe Leu Thr Arg Glu Ala Gly Tyr Pro 340 345 350 Gin lie Phe Ser Glu Asp Met Phe Gly Thr Lys Gly Ala Ser Gin Arg 355 360 365 Glu lie Pro Ala Leu Lys His Lys Phe Lys Pro Phe Leu Lys Ala Arg 370 375 380 Lys Lys Ser Glu Lys Gly Ala Gin His Asp Tyr Leu Glu Pro Leu Asn 385 390 395 400 lie Val Gly Arg Arg Arg Glu Gly Asp Arg Leu Val Glu Asn Ser Gly 405 410 415 Phe Ala Ala Phe Lys Thr Asp Gly Leu Gly Gly Thr Lys Lys Met Phe 420 425 430 Phe Gly Arg Gin Asn Ala Gly Lys Thr Trp His Glu Phe Thr Gly Asn 435 440 445 Arg Phe Asp Ser Val Val lie Asn Ala Lys Gly Arg Gly Glu Phe His 450 455 460 Val Lys Gly Gly Ser Leu Ser lie Ser Phe Lys Lys 465 470 475 〈210〉 2 〈211〉 1431 〈212〉 DNA <213> amylase gene sequence 〈400〉 2 atgcagtatt ttgagtggtt cttgcccaaa gttgcccttc atgggaaacg cttgaaaaat 60 gaatccgaat atttggctga actcggtatt cctcccttct ggattccccc ggcatataag 120 aaaccctttc aagacgatgt aggctacggc gttaaagaac tgtctgaatt cggggagttt 180 aatgaaaaag ggacggttcg gaccaaaaac ggcacaaagg gagaactgca atctgcgatc 240 aacagtcttc attcccggga catcaacgtt tacggcgatg tagtcatcaa ccacaaaggc 300 ggcgctgatg cgaccgaata tgtaacggct gttgaagtcg atcccgccga ccgcaaccgc 360 gtaacatcag gagaacagcg aatcaaagcg tggacacatt ttcaattccc ggggcgcggc 420 aggaaataca gcgatttcaa attcttttgg taccattttg acggaaccga tttggaaaag 480 tcccgaaagc tgaaccgcat ctataagttt caaggaaagg catgggattt gaaattttcc 540 aaagttaacg gcaactatga ttactttacc tatgccgaca tcgattatga tcttcccgaa 600 gccacggcag aaataaagag atggggaacg gggtctccca aagagctgca attggacgga 660 ttccgccttg aacccttcaa acacattaaa ttttcttttt tgcgggattg ggtcaaactt 720 gtcagggaaa aaacagggaa ggaaatgttt aaggaaccta aatattggga gaaagaattc 780 ggtgcgctgg aaaactattt gaacaaaaca aactttaatc attcagtgtt tgacgtgccg 840 cttcattacc agttccatgc tgaatcgaca cagggaggtg gctatgatat gaggaaattc 900 ctgaacggaa cagccctttc caagcatccc gaaaaggtgg ttacgtttgt tgataacctt 960 gatacacagc cggggcaatc ggttgggtcc cttgtccaaa catggtttaa gccgctggct 1020 taccctttgt ttttgacaag agaagcaggc tacccgcaga ttttttccga ggatatgttc 1080 gggacgaaag gagcctcgca gcgcgaaatt cctgccctga aacacaaatt caaacctttc 1140 ttaaaagcga gaaaaaaatc tgagaaggga gcacagcatg attatttgga acctcttaac 1200 attgtcggca ggaggaggga aggcgacagg ttggttgaaa attccgggtt tgcggcgttt 1260 aaaacagacg gtctcggcgg gacaaagaaa atgtttttcg gccggcaaaa cgccgggaag 1320 acatggcatg aatttaccgg aaaccgtttc gattctgttg tcatcaatgc aaaagggaggl380 ggagagtttc acgttaaagg gggatccctt tcgatctctt ttaaaaaata g 1431
【權(quán)利要求】
1. 一種重組表達載體，其攜帶有編碼淀粉酶的基因片段。
2. 如權(quán)利要求1所述表達載體，其特征在于，所述基因的編碼核苷酸序列為SEQ ID NO: 1〇
3. 如權(quán)利要求2所述表達載體，其特征在于，所述基因編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO: 2〇
4. 一種工程菌，其攜帶有權(quán)利要求1所述重組表達載體。
5. 如權(quán)利要求4所述的工程菌，為黑曲霉Amy (Aspergillus nigerAmy)。
6. 權(quán)利要求5所述工程菌在生產(chǎn)淀粉酶中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/80GK104059935SQ201310666291
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】李佩佩, 許麗紅, 王華明 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司