一種t-發(fā)卡結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的測(cè)定dna側(cè)翼未知序列的方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種利用限制性內(nèi)切酶、T-發(fā)卡結(jié)構(gòu)(HSO-T)和巢式PCR擴(kuò)增等技術(shù)，基于已知DNA序列擴(kuò)增其5′或3′端側(cè)翼未知序列的方法。該方法設(shè)計(jì)一條HSO-T的寡聚核苷酸序列；用單一限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA并經(jīng)rTaq或Ex?Taq修飾；HSO-T接頭與修飾后基因組連接；根據(jù)HSO-T序列合成引物THSO-F，根據(jù)已知DNA序列合成2條下游引物或2條上游引物；以連接物為模板，引物THSO-F和2條下游引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增獲得5′端未知序列；同理，引物HSO-F和2條上游引物進(jìn)行巢式PCR獲得3′端未知序列。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、應(yīng)用范圍廣、成本低廉、高效準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊應(yīng)的用前景。
【專利說明】一種T-發(fā)卡結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的測(cè)定DNA側(cè)翼未知序列的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種涉及限制性內(nèi)切酶(RestrictionEndonuclease)酶切、T-發(fā)卡結(jié)構(gòu)(T-Hairpin Structure)連接和巢式 PCR(NestPolymerase Chain Reaction)擴(kuò)增等技術(shù),基于已知DNA序列測(cè)定其側(cè)翼未知DNA序列的方法。
【背景技術(shù)】 [0002]在當(dāng)今的“基因大戰(zhàn)”中，新基因的發(fā)現(xiàn)與克隆已成為研究的熱點(diǎn)，側(cè)翼未知序列的擴(kuò)增在分子生物學(xué)研究中占有舉足輕重的地位，是結(jié)構(gòu)基因組研究以及功能基因組研究的基礎(chǔ)，可應(yīng)用于啟動(dòng)子克隆、獲得基因的排布信息、確定T-DNA插入位點(diǎn)、染色體定位、圖位克隆、基因表達(dá)調(diào)控研究、人工染色體PAC、YAC和BAC片段搭接等。目前已有的測(cè)定側(cè)翼未知序列的方法如隨機(jī)測(cè)序法、3'-和5' -RACE法以及基因組文庫(kù)進(jìn)行雜交篩選等，往往工程浩大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，應(yīng)用局限或特異性不高。近幾年，基于PCR技術(shù)克隆側(cè)翼未知序列的方法格外引人注目，該方法包括一類是依賴連接介導(dǎo)的PCR法，如T-1nker PCR法等，操作過程相對(duì)復(fù)雜，且擴(kuò)增長(zhǎng)度較短，非特異擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)較大；另一類是不需要酶切連接的PCR法，如Tail-PCR法等，也存在一定缺陷，比如新Alu-PCR擴(kuò)增區(qū)域包含較短的Alu重復(fù)序列時(shí)，往往得不到目的產(chǎn)物。由本研究發(fā)明兩種基于PCR的測(cè)定DNA側(cè)翼未知序列技術(shù)，操作簡(jiǎn)便、高效準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但仍存在一些不足。一種T載體介導(dǎo)PCR測(cè)定側(cè)翼未知序列方法，其連接不受限制性內(nèi)切酶的限制，通用性強(qiáng)，但以PUCm-T為接頭連接效率低，且購(gòu)買PUCm-T價(jià)格較貴；另一種以發(fā)卡結(jié)構(gòu)介導(dǎo)PCR測(cè)定側(cè)翼未知序列，小分子核苷酸鏈構(gòu)建的接頭結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，大幅度提高了 PCR擴(kuò)增的特異性和效率，但該方法受限制性內(nèi)切酶的限制，連接位點(diǎn)單一，限制其應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)便、應(yīng)用范圍廣、成本低廉、高效準(zhǔn)確的T-發(fā)卡結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的PCR擴(kuò)增方法，能夠基于已知DNA序列確定其5'或3'端側(cè)翼未知DNA序列。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案:合成一條極易形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸序列(HSO-T)，經(jīng)變性、退火可形成穩(wěn)定的HSO-T接頭；基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列，合成特異性引物THS0-F，再根據(jù)已知的DNA序列，合成兩條特異性下游引物和兩條上游引物；選擇單一限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA，根據(jù)酶切產(chǎn)物末端的類型，選擇rTaq或Ex Taq進(jìn)行修飾，修飾后其3,端均被添加上堿基“A” ;將HSO-T接頭與經(jīng)Taq處理的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接；以連接物為模板，采用THSO-F和兩條下游引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，獲得已知DNA序列5'端側(cè)翼未知序列；同理，采用THSO-F和兩條上游引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，獲得3'端側(cè)翼未知序列:
[0005](I) T-發(fā)卡結(jié)構(gòu)及PCR引物的合成:根據(jù)原核生物回文結(jié)構(gòu)的原理，合成一條極易形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的、3'端含有“T”的寡聚核苷酸序列，命名為HSO-T (42bp);基于HSO-T序列，合成一條特異性PCR引物，命名為THSO-F (20bp)；[0006]HSO-T:5, -GACTACTGGCATGGGCGGATTACTCGCCCATGCCAGTAGTCT~3/
[0007]THSO-F: 5' -ACTCGCCCATGCCAGTAGTC-3'
[0008](2)上下游引物的合成:基于已知的DNA序列，合成兩條擴(kuò)增已知DNA序列5'端側(cè)翼未知序列的特異性下游引物，命名為Pr1-Rl和Pr1-R2，Pr1-R2距離已知DNA序列5'端30bp以上；同理，基于已知的DNA序列，合成兩條擴(kuò)增3'端側(cè)翼未知序列的上游引物，命名為Pr1-Fl和Pr1-F2, Pri_F2距離3'端30bp以上；
[0009](3)限制性內(nèi)切酶的選擇:分析已知DNA序列中限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，選擇在已知DNA序列中沒有酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶；本發(fā)明可供選擇的、產(chǎn)生5'端粘性末端的內(nèi)切酶有 EcoR I, HindIII, Bgl I1、Sal 1、BamH 1、Nco 1、Xba 1、Xho 1、Cla 1、Msp I 和Nde I等，產(chǎn)生平末端的酶有EcoR V、Sna B和Sca I等，產(chǎn)生3'端粘性末端的酶有Aat
I1、Bmt 1、Pst 1、Sac I 和 Sph I 等;
[0010](4)基因組DNA的酶切:采用步驟(3)選擇的單一限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行完全酶切，純化酶切產(chǎn)物；
[0011](5)酶切產(chǎn)物的修飾:基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，其酶切產(chǎn)物兩端有3種形式，分別為5'端粘性末端、3'端粘性末端和平末端；針對(duì)5'端粘性末端，利用rTaq或Ex Taq DNA聚合酶具有不依賴于模板的5' —3'核苷酸聚合活性，將粘性末端補(bǔ)齊，并在3/端添加上堿基“A”;針對(duì)平末端，直接利用該兩種酶在3'端添加上堿基“A”;針對(duì)3'端粘性末端，利用Ex Taq DNA聚合酶具有3' —5'核苷酸外切活性，將粘性末端切齊，再利用該酶均具有不依賴于模板的5' —3'核苷酸聚合活性，在3'端添加上堿基“A”；
[0012](6) HSO-T接頭與酶切修飾產(chǎn)物的連接=HSO-T經(jīng)變性、退火形成HSO-T接頭，將其與經(jīng)Taq處理的基因組酶切片段進(jìn)行連接，即可作為PCR擴(kuò)增的模板；
[0013](7)目的DNA片段的PCR擴(kuò)增:以步驟(6)的連接物為模板，THSO-F和Pr1-Rl作為上下游引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；再以該輪PCR產(chǎn)物為模板，THSO-F和Pri_R2為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；將兩輪PCR(巢式PCR)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析；根據(jù)巢式PCR原理驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物是否為目的DNA片段，從而獲得已知DNA序列5'端側(cè)翼未知序列；
[0014]同理，以步驟(6)的連接物為模板，Pr1-Fl和THSO-F作為上下游引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；再以該輪PCR產(chǎn)物為模板，Pr1-F2和THSO-F為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；將兩輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，從而獲得已知DNA序列3'端側(cè)翼未知序列。
[0015]THSO-PCR擴(kuò)增側(cè)翼未知DNA序列操作流程如圖1所示(以Xba I酶切為例)。
[0016]本發(fā)明的有益效果:
[0017](I)操作簡(jiǎn)便。與隨機(jī)測(cè)序法相比，避免了對(duì)基因組進(jìn)行大規(guī)模的測(cè)序，也無需進(jìn)行繁瑣的計(jì)算和排序工作，從而節(jié)省了大量的人力、時(shí)間和財(cái)力。
[0018](2)引物特異性強(qiáng)。本發(fā)明通過利用寡聚核苷酸的T-發(fā)卡結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的PCR方法，把隨機(jī)引物的擴(kuò)增轉(zhuǎn)變成特異性引物的擴(kuò)增，大幅度提高了 PCR擴(kuò)增的特異性和效率。HSO-T接頭是一個(gè)反向重復(fù)序列，故只需一條引物THSO-F即可用于5'端或3'端側(cè)翼未知DNA序列。
[0019](3)應(yīng)用范圍廣。在已知部分DNA序列的基礎(chǔ)上，T-發(fā)卡結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的PCR擴(kuò)增可應(yīng)用于各種不同基因的5'端或3'端側(cè)翼未知DNA序列的測(cè)定。
[0020](4)操作限制少。只要有90bp左右的已知DNA序列就足夠操作，且在3'端堿基“T”的設(shè)計(jì)，基因組DNA酶切不受限制性內(nèi)切酶的限制。
[0021](5)結(jié)果驗(yàn)證簡(jiǎn)捷。巢式PCR擴(kuò)增可快速驗(yàn)證其擴(kuò)增的產(chǎn)物是否為目標(biāo)DNA片段，具有簡(jiǎn)捷、準(zhǔn)確和實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)。
[0022](6)未知序列長(zhǎng)度不限。由于基因組DNA的酶切位點(diǎn)是隨機(jī)分布的，本發(fā)明可獲取未知序列長(zhǎng)達(dá)幾Kb的片段，而且序列的準(zhǔn)確性和真實(shí)性不會(huì)因長(zhǎng)度的增加而受到影響，并可應(yīng)用于染色體步移獲得更長(zhǎng)的DNA序列。
[0023](7)成本低廉。本發(fā)明的核心還是簡(jiǎn)單的PCR擴(kuò)增，HSO-T接頭和THSO-F具有通用性，無需昂貴的儀器和試劑盒。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1:THSO-PCR擴(kuò)增側(cè)翼未知DNA序列示意圖
[0025]圖2:宇佐美曲霉EOOl環(huán)氧化物水解酶基因(Auseh2)5'端側(cè)翼的測(cè)序結(jié)果
[0026]圖3:宇佐美曲霉EOOl環(huán)氧化物水解酶基因(Auseh2)3'端側(cè)翼的測(cè)序結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實(shí)施例僅用于詳細(xì)說明本發(fā)明，而不用于限制 本發(fā)明的范圍。
[0028]實(shí)施例1
[0029]宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001Auseh2基因的5'端側(cè)翼未知DNA序列的測(cè)定:
[0030](I) HSO-T 接頭的構(gòu)建:HS0-T(100iimol / L) 2 y L，ddH208 y L，充分混勻；用卩0?基因擴(kuò)增儀94°C變性3min，緩慢降溫(1°C / s)至25°C后恒溫退火30min。
[0031](2)基因組DNA酶切產(chǎn)物的制備:選用Xba I對(duì)宇佐美曲霉基因組DNA進(jìn)行酶切。構(gòu)建如下酶切體系:10XM Bufferl ii L，Xba 10.5u L,0.1M BSAl y L,基因組 DNA5 y L，ddH202.5 u L ;37°C 反應(yīng) 4h。
[0032](3)酶切基因組修飾:酶切產(chǎn)物 20 U L, 10XPCR Buffer2.5 U L, dNTP0.5 U L, rTaq或Ex Taq0.25 u L, ddH201.75 u L ;使用PCR基因擴(kuò)增儀在72°C反應(yīng)10min ;修飾后酶切產(chǎn)物命名為Auseh2-DM。
[0033](4) Auseh2-DM 與 HSO-T 接頭的連接=IOXT4DNA Ligase Bufferl U L,HS0-T3u L,Auseh2-DM5 u L, T4DNA Ligasel u L ;16°C反應(yīng)4h或過夜，即可作為PCR擴(kuò)增的模板。
[0034](5)已知序列下游引物的合成:基于已知的Auseh2基因序列，合成兩條擴(kuò)增已知DNA序列5丨端側(cè)翼未知序列的特異性下游引物，命名為EH-Rl和EH-R2，其中EH-R2距離已知DNA序列5'端30bp以上:
[0035]EH-Rl:5' -TGAGGGAAGCTGTTGATG-3'
[0036]EH-R2:5' -CTCCTCGATTTGCTCGTCTGA-3'
[0037](6)Auseh2 的 5'端DNA序列擴(kuò)增:10XPCR Buffer2.5 u L, dNTPl.5 u L, THSO-PCR模板 2 ii L, THS0-F0.5u L, EH-R10.5 u L, ddH2017.75 u L, rTaq 酶 0.25 y L ；94 °C 5min,30 個(gè)循環(huán)(94 °C, 30s ；51 °C,30s ;72 °C，lmin20s)，72 °C IOmin,經(jīng)第一輪 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物命名為 5 ' -Auseh2-0ut ； 10 X PCR Buffer2.5 u L, dNTPl.5u L,5 ' -Auseh2_0ut2 u L,THSO-F0.5u L, EH-R20.5 u L, ddH2017.75 u L, rTaq 酶 0.25 y L ；94 °C 5min, 30 個(gè)循環(huán)(94 °C, 30s ；51 °C, 30s ;72 °C，lmin20s)，72 °C IOmin,經(jīng)第二輪 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物命名為5' -Auseh2-1n。
[0038](7)5' -Auseh2_In的克隆和測(cè)序:將5' -Auseh2_In按照割膠回收試劑盒說明書上的操作步驟分別進(jìn)行割膠回收，將純化的產(chǎn)物克隆到PUCm-T載體上進(jìn)行測(cè)序，Auseh2基因5'端DNA未知序列的測(cè)結(jié)果如圖2所示。
[0039]實(shí)施例2
[0040]宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001Auseh2基因的3'端側(cè)翼未知DNA序列的測(cè)定:
[0041](I)HSO-T接頭與基因組DNA酶切產(chǎn)物的制備及連接方法同實(shí)施例1。
[0042](2)已知序列上游引物的合成:基于已知的Auseh2基因序列，合成兩條擴(kuò)增已知DNA序列3丨端側(cè)翼未知序列的特異性下游引物，命名為EH-Fl和EH-F2，其中EH-F2距離已知DNA序列3'端30bp以上:
[0043]EH-Fl:5' -TCATGATGCTTGCAAAGCC-3'
[0044]EH-F2:5' -GGAGAGAAGTTCCTCGAT-3'
[0045](3)Auseh2 的 3'端DNA序列擴(kuò)增:10XPCR Buffer2.5 u L, dNTPl.5 u L, THSO-PCR模板 2 ii L, THSO-F0.5u L, EH-F10.5 u L, ddH2017.75 u L, rTaq 酶 0.25 y L ；94 °C 5min,30 個(gè)循環(huán)(94 °C, 30s ；51 °C,30s ;72 °C，lmin20s)，72 °C IOmin,經(jīng)第一輪 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物命名為 3 ' -Auseh2-0ut ； 10 X PCR Buffer2.5 u L, dNTPl.5u L,3 ' -Auseh2_0ut2 u L,THS0-F0.5u L, EH-F20.5u L, ddH2017.75 u L, rTaq 酶 0.25 y L ；94 °C 5min, 30 個(gè)循環(huán)(94 °C, 30s ；51 °C, 30s ;72 °C，lmin20s)，72 °C IOmin,經(jīng)第二輪 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物命名為3' -Auseh2-1n。
[0046](4)3' -Auseh2_In的克隆和測(cè)序:將3' -Auseh2_In按照割膠回收試劑盒說明書上的操作步驟分別進(jìn)行割膠回收，將純化的產(chǎn)物克隆到PUCm-T載體上進(jìn)行測(cè)序，Auseh2基因3'端DNA未知序列的測(cè)結(jié)果如圖3所示。
【權(quán)利要求】
1.一種T-發(fā)卡結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的測(cè)定DNA側(cè)翼未知序列的方法,其特征在于:合成一條極易形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸序列(HSO-T)，經(jīng)變性、退火可形成穩(wěn)定的HSO-T接頭；基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列，合成特異性引物THS0-F，再根據(jù)已知的DNA序列，合成兩條特異性下游引物和兩條上游引物；選擇單一限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA，根據(jù)酶切產(chǎn)物末端的類型，選擇rTaq或Ex Taq進(jìn)行修飾，修飾后其3'端均被添加上堿基“A”;將HS0-T接頭與經(jīng)Taq處理的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接；以連接物為模板，采用THSO-F和兩條下游引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，獲得已知DNA序列5，端側(cè)翼未知序列；同理，采用THSO-F和兩條上游引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，獲得3'端側(cè)翼未知序列: (1)T-發(fā)卡結(jié)構(gòu)及PCR引物的合成:根據(jù)原核生物回文結(jié)構(gòu)的原理，合成一條極易形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的、3'端含有“T”的寡聚核苷酸序列，命名為HSO-T (42bp);基于HSO-T序列，合成一條特異性PCR引物，命名為THSO-F (20bp)；
HSO-T: 5' -GACTACTGGCATGGGCGGATTACTCGCCCATGCCAGTAGTCT-3'
THSO-F: 5' -ACTCGCCCATGCCAGTAGTC-3' (2)上下游引物的合成:基于已知的DNA序列，合成兩條擴(kuò)增已知DNA序列5'端側(cè)翼未知序列的特異性下游引物，命名為Pr1-Rl和Pr1-R2，Pri_R2距離已知DNA序列5'端30bp以上；同理，基于已知的DNA序列，合成兩條擴(kuò)增3'端側(cè)翼未知序列的上游引物，命名為 Pr1-Fl 和 Pr1-F2, Pri_F2 距離 3'端 30bp 以上； (3)限制性內(nèi)切酶的選擇:分析已知DNA序列中限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，選擇在已知DNA序列中沒有酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶；本發(fā)明可供選擇的、產(chǎn)生5'粘性末端的內(nèi)切酶有 EcoR I, HindIII, Bgl I1、Sal 1、BamH 1、Nco 1、Xba 1、Xho 1、Cla 1、Msp I 和 Nde I等，產(chǎn)生平末端的酶有EcoR V、Sna B和Sca I等，產(chǎn)生3'粘性末端的酶有Aat I1.Bmt 1、Pst 1、Sac I 和 Sph I 等； (4)基因組DNA的酶切:采用步驟(3)選擇的單一限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行完全酶切，純化酶切產(chǎn)物； (5)酶切產(chǎn)物的修飾:基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，其酶切產(chǎn)物兩端有3種形式，分別為5'粘性末端、3'粘性末端和平末端；針對(duì)5'粘性末端，利用rTaq或Ex TaqDNA聚合酶具有不依賴于模板的5' —3'核苷酸聚合活性，將粘性末端補(bǔ)齊，并在3'端添加上堿基“A”;針對(duì)平末端，直接利用該兩種酶在3'端添加上堿基“A”;針對(duì)3'粘性末端，利用Ex Taq DNA聚合酶具有3' —5'核苷酸外切活性，將粘性末端切齊，再利用該酶均具有不依賴于模板的5' —3'核苷酸聚合活性，在3'端添加上堿基“A”； (6)HSO-T接頭與酶切修飾產(chǎn)物的連接=HSO-T經(jīng)變性、退火形成HSO-T接頭，將其與經(jīng)Taq處理的基因組酶切片段進(jìn)行連接，即可作為PCR擴(kuò)增的模板； (7)目的DNA片段的PCR擴(kuò)增:以步驟(6)的連接物為模板，THSO-F和Pr1-Rl作為上下游引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；再以該輪PCR產(chǎn)物為模板，THSO-F和Pri_R2為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；將兩輪PCR (巢式PCR)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析；根據(jù)巢式PCR原理驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物是否為目的DNA片段，從而獲得已知DNA序列5'端側(cè)翼未知序列； 同理，以步驟(6)的連接物為模板，Pr1-Fl和THSO-F作為上下游引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；再以該輪PCR產(chǎn)物為模板，Pr1-F2和THSO-F為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；將兩輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，從而獲得已知DNA序列3'端側(cè)翼未知序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，操作過程中所使用的反應(yīng)體系和條件如下:
(1)HSO-T接頭的構(gòu)建:HSO-T (IOOiimol / L)2u L, ddH208 y L，混勻；使用 PCR 基因擴(kuò)增儀94°C變性3min，緩慢降溫(I。。/ s)至25°C后，恒溫退火30min ； (2)基因組DNA的酶切:酶切反應(yīng)體系和條件為:10XBufferliiL，限制性內(nèi)切酶.0.5u L，基因組DNA5 u L, ddH202.5 y L ;30或37°C反應(yīng)4h ;其中IOXBuffer的類型和酶切溫度需與所選內(nèi)切酶相匹配； (3)酶切產(chǎn)物的修飾:酶切產(chǎn)物20ii L，10XPCR Buffer2.L，dNTP0.L，rTaq 或 ExTaq0.25 u L, ddH201.75 u L ;使用 PCR 基因擴(kuò)增儀 72°C反應(yīng)10min ； (4)酶切修飾產(chǎn)物與HSO-T接頭的連接:酶切修飾產(chǎn)物5iiL，HSO-T接頭3iiL，IOXLigase bufferl u L, T4DNA Ligasel u L ;16°C反應(yīng) 4h 或過夜，即可作為 PCR 擴(kuò)增的模板； (5)已知DNA序列5'端側(cè)翼未知序列的PCR擴(kuò)增:10 X PCR Buffer2.5 u L,dNTPl.5u L,連接物 2 ii L，THS0-F0.5 u L, Pr1-Rl0.5 u L, ddH2017.75 u L, rTaq 酶.0.25u L ;第一輪 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物命名 為 5' -1st-Out ； 10XPCR Buffer2.5 u L, dNTPl.5 u L,.5' -lst-0ut2 u L, THS0-F0.5 u L, Pr1-R2 0.5 u L, ddH2017.75 u L, rTaq 酶 0.25 y L,第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物命名為5, -2nd-1n ； (6)已知DNA序列V端側(cè)翼未知序列的PCR擴(kuò)增:10X PCR Buffer2.5 u L,dNTPl.5u L,連接物 2 ii L，THS0-F0.5 u L, Pr1-Fl0.5 u L, ddH2017.75 u L, rTaq 酶.0.25u L ;第一輪 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物命名為 3' -1st-Out ； 10 XPCR Buffer2.5 u L, dNTPl.5 u L,.3' -lst-0ut2 u L, THS0-F0.5 u L, Pr1-F20.5 u L, ddH2017.75 u L, rTaq 酶 0.25 y L,第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物命名為3' -2nd-1n。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103627808SQ201310666359
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】鄔敏辰, 汪俊卿, 胡蝶, 朱利娟, 李劍芳 申請(qǐng)人:江南大學(xué)