一種蝙蝠蛾擬青霉菌粉的特異pcr鑒真方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蝙蝠蛾擬青霉菌粉的特異PCR鑒真方法。其技術方案是以樣品的基因組DNA為模板，采用本發(fā)明設計的特異PCR引物，進行一次單管特異PCR反應，擴增冬蝙蝠蛾擬青霉的特征性持家基因，實際擴增片斷為231bp，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，判斷樣品的真實性。本發(fā)明可特異性識別蝙蝠蛾擬青霉菌粉，只需DNA提取、PCR擴增和電泳檢測三步即可完成對樣品的真實性檢測，操作簡單、易于掌握、準確性高。
【專利說明】—種蝙蝠蛾擬青霉菌粉的特異PCR鑒真方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于保健食品鑒真領域，具體涉及蝙蝠蛾擬青霉菌粉的鑒真方法。
【背景技術】
[0002]蝙蝠蛾擬青霉是從冬蟲夏草原草中分離得到的重要藥用真菌，可產生蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖等多種重要的功效性成分，具有增強免疫力、緩解體力疲勞等保健功能，其有效作用已獲得民間的廣泛認可。
[0003]自2001年被列入中國衛(wèi)生部發(fā)布的“可用于保健食品的真菌菌種名單”以來，蝙蝠蛾擬青霉作為保健食品生產原料受到廣泛關注，尤其是在其發(fā)酵菌絲體的基礎上已開發(fā)出多種不同類型的保健食品。據(jù)統(tǒng)計，2012年我國生產蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵菌絲體原料3000噸，產值已達到50億元。然而，目前尚沒有專門用于蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵菌絲體真假鑒別和質量控制的標準方法，產品質量難以保證，極大限制了蝙蝠蛾擬青霉產業(yè)的升級和規(guī)范發(fā)展。
[0004]因此，在蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵菌粉生產和流通過程中，亟需一種有效、快速、準確的鑒真方法，以實現(xiàn)對其品質的控制和管理。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種可用于蝙蝠蛾擬青霉菌粉鑒真的可靠方法。
[0006]為達到上述目的，本發(fā)明設計了蝙蝠蛾擬青霉性持家基因的特異PCR引物，通過一次單管PCR反應，擴增蝙蝠蛾擬青霉特征性持家基因，實際擴增片斷為231bp。
[0007]用于蝙蝠蛾擬青霉菌粉鑒真`的引物序列如下:
上游引物 CICC- Pae -Fl:5’ - GAGCATGGTCTCGACTCT -3’
下游引物 CICC- Pae -Rl:5，- CGAAGGGACCAGCACGG -3，。
[0008]本發(fā)明采用的技術方案如下:
1)犾取樣品基因組DNA；
2)采用上述引物在PCR儀上進行PCR擴增；
PCR擴增反應體系為 25μ?，其中 IOXTaq reaction buffer 2.5μ?，2 條引物(10 μ mol/L)各 ?μ?，10 μ mol/L 的 dNTP 2μ?, 2.5U 的 Taq 酶 0.5μ?, DNA 模板 1.Ομ?, ddH20 17μ?。
[0009]PCR擴增的反應條件為:95°C預變性5min，進入循環(huán):95°C 30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，共35個循環(huán)，然后72°C延伸5min。
[0010]3) PCR擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠進行檢測。
[0011]4)樣品的真實性判斷
在紫外燈下查看電泳條帶，在231bp處有明亮條帶的為蝙蝠蛾擬青霉菌粉,無條帶者為偽品。
[0012]本發(fā)明經過充分的前期試驗篩選和優(yōu)化，得到的引物特異性強，PCR擴增條件簡單，采用一次單管特異PCR反應后，通過電泳檢測便可鑒別產品真?zhèn)?，操作簡單，成本低，準確度高，具有很好的應用前景。
[0013]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為蝙蝠蛾擬青霉基因特異性引物設計示意圖,其中有下劃線的部分為擴增片段對應的核苷酸序列，有下劃線的斜體部分為所設計的引物特異性結合位點。
[0015]圖2為PCR擴增產物在2%瓊脂糖凝膠中的電泳圖譜，1-DL2000 Marker, 2_蝙蝠蛾擬青霉菌粉，3-冬蟲夏草菌粉，4-亞香棒蟲草，5-蛹蟲草菌粉，6-陰性對照，7- DL2000Marker。
[0016]具體實施案例
下面結合實施案例對本發(fā)明進行具體說明，實施案例是為了進一步闡述本發(fā)明，而不會給本發(fā)明造成任何限制。
[0017]實施例一:PCR引物的設計及其對樣品的檢測
I蝙蝠蛾擬青霉P基因特異PCR引物的設計
根據(jù)GenBank上公開登錄的蝙蝠蛾擬青霉β -tubulin基因序列信息進行引物設計(見附圖1)。
[0018]參考序列的GenBank登錄號為:AY624217。
[0019]在18-35處設計上游引物，命名為CICC- Pae -Fl0序列為:5’_ GAGCATGGTCTCGACTCT -3，。
[0020]在233-249處設計下游引物，命名為CICC- Pae -R1。序列為:5’_ CGAAGGGACCAGCACGG -3，。
[0021]2樣品的檢測 2.1樣品的收集
購買市售蝙蝠蛾擬青霉菌粉、冬蟲夏草菌粉、亞香棒蟲草、北冬蟲夏草菌粉。
[0022]2.2樣品基因組DNA提取
采用改良CTAB法提取基因組DNA，并使用OMEGA公司生產的DNA純化試劑盒對其進行純化。
[0023]2.3基因組DNA的多重PCR擴增
PCR擴增反應體系為 25μ?，其中 IOXTaq reaction buffer 2.5μ?，2 條引物(10 μ mol/L)各 ?μ?，10 μ mol/L 的 dNTP 2μ?, 2.5U 的 Taq 酶 0.5μ?, DNA 模板 1.Ομ?, ddH20 17μ?。
[0024]PCR擴增的反應`條件為:95°C預變性5min，進入循環(huán):95°C 30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共35個循環(huán)，然后72°C延伸5min。
[0025]2.4 PCR產物檢測
PCR擴增產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，在231bp處出現(xiàn)明亮條帶的為蝙蝠蛾擬青霉菌粉，無條帶為其他樣品(詳見附圖2)。
【權利要求】
1.一種蝙蝠蛾擬青霉菌粉的鑒真方法，其特征在于:經過一次簡單的特異PCR反應檢測蝙蝠蛾擬青霉特征性持家基因。
2.按照權利要求1所述的蝙蝠蛾擬青霉菌粉鑒真方法，其特征在于:用于檢測蝙蝠蛾擬青霉持家基因的特異PCR引物為:
上游引物 CICC- Pae -Fl:5’ - GAGCATGGTCTCGACTCT -3’
下游引物 CICC- Pae -Rl:5’ - CGAAGGGACCAGCACGG -3’。
3.按照權利要求2所述的蝙蝠蛾擬青霉菌粉鑒真方法，其特征在于:PCR擴增反應體系為 25μ?，其中 IOXTaq reaction buffer 2.5μ?，2 條引物(10 μ mol/L)各 ?μ?，10 μ mol/L的 dNTP 2μ?, 2.5U 的 Taq 酶 0.5μ?, DNA 模板 1.Ομ?, ddH20 17μ?。
4.按照權利要求3所述的蝙蝠蛾擬青霉菌粉鑒真方法，其特征在于:所述PCR擴增的反應條件為:95°C預變性5min，進入循環(huán):95°C 30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，共35個循環(huán)，然后72°C延伸5min。
5.按照權利要求3所述的蝙蝠蛾擬青霉菌粉鑒真方法，其特征在于:所述PCR擴增的反應條件為:95°C預變性5min，進入循環(huán):95°C 30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，共35個循環(huán)，然后72°C延伸5min。
6.按照權利要求5所述的蝙蝠蛾擬青霉菌粉鑒真方法，其特征在于:在231bp處有電泳條帶的樣品為蝙蝠 蛾擬青霉菌粉。
【文檔編號】C12Q1/68GK103614484SQ201310667351
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權日:2013年12月11日
【發(fā)明者】程池, 扎西才吉, 李輝, 姚粟, 劉洋, 白飛榮 申請人:中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院, 玉樹藏族自治州三江源藥業(yè)有限公司