稻瘟病抗性基因Pi63的功能特異性分子標(biāo)記及其方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了稻瘟病抗性基因Pi63的2對功能性分子標(biāo)記YRT3和YRT4及其方法與應(yīng)用，通過比對和分析多個水稻品種中Pi63等位基因及其編碼區(qū)上游序列，得到有別于感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pi63功能特異性位點2處；通過設(shè)計引物，分別得到SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，以及SEQIDNO.3和SEQIDNO.4；利用該引物擴(kuò)增水稻總DNA，分別得到Pi63功能特異性分子標(biāo)記YRT3和YRT4。本發(fā)明可在大量的水稻種質(zhì)資源中篩選、鑒定該功能性抗性基因，以及在分子標(biāo)記輔助選擇育種、基因聚合育種以及轉(zhuǎn)基因育種中的得到應(yīng)用。
【專利說明】稻瘟病抗性基因Pi63的功能特異性分子標(biāo)記及其方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及水稻稻瘟病抗性基因朽似(原編號Piym2)的2對功能性分子標(biāo)記及其方法與應(yīng)用 。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米為主要糧食。稻瘟病是水稻最主要的病害之一，全球每年因稻瘟病造成的稻谷減產(chǎn)達(dá)10%~30%，嚴(yán)重時達(dá)30%~50%，甚至顆粒無收。在我國稻瘟病常年發(fā)生面積在380萬畝左右，造成數(shù)億公斤的稻谷損失，直接威脅著國家的糧食安全。
[0003]培育和利用抗病品種一直被公認(rèn)為最經(jīng)濟(jì)有效和環(huán)境友好的稻瘟病防治措施。但是，由于稻瘟病菌群體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，加之其致病性易于發(fā)生變異，一些潛在的或新產(chǎn)生的致病小種的迅速繁殖，一個抗病品種往往推廣3飛年就發(fā)生感病化。因此，培育持久、廣譜抗稻瘟病的新品種是水稻抗病育種研究的重要方向，而廣泛挖掘、鑒定新的稻瘟病抗性基因，開展多基因聚合育種被認(rèn)為獲得持久、廣譜抗病品種的有效途徑。
[0004]傳統(tǒng)的水稻抗病育種依賴于抗性表型的鑒定，這不僅要求育種者具有豐富的經(jīng)驗和敏銳的洞察力，而且鑒定結(jié)果極易受環(huán)境條件和人為因素的影響，從而降低了目標(biāo)基因的選擇效率。另外，由于受可鑒別不同基因的鑒別菌系的限制，單純地依賴表型鑒定很難實現(xiàn)多個抗性基因的聚合。隨著分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展，其便捷、直接、不受環(huán)境影響的優(yōu)點使其應(yīng)用價值及前景越來越受到關(guān)注。開發(fā)并應(yīng)用與抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，特別是抗性基因本身序列分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，不僅可以大大提高抗源篩選、抗性基因鑒定及育種選擇效率，而且使得通過基因聚合手段培育持久、廣譜抗病良種成為可倉泛。
[0005]迄今，國內(nèi)外利用分子標(biāo)記技術(shù)已鑒定和定位70多個水稻稻瘟病抗性基因，克隆了 Pia、Pib、Pi ta、Pil、Pi9、Pi2、Piz_t、Pi_d2、Pi_d3、Pi36、Pi37、Pik、Pik_m、Pik-p、Pi5、Pia、Pit、Pish、pi21、Pbl 和/--似等 21 今基通,共節(jié)U欽對Pita、Pib、Pik、Pikm、Pikp、/^7 Jii 和/--激等基因的功能特異性標(biāo)記(Lei et al.2013 ；Ma et al.2013;國家水稻數(shù)據(jù)中心:http://www.ricedata.cn/gene/)。這為通過分子育種手段快速、高效培育持久、廣譜抗稻瘟病品種奠定了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0006]水稻稻瘟病抗性基因Pi63是本實驗室最近從云南地方粳稻品種羊毛谷(YMG)中克隆的一個高抗葉瘟和穗頸瘟的基因(曾用名參見專利號ZL 201210073815.3，發(fā)明名稱:稻瘟病抗性基因及其應(yīng)用)。該基因位于水稻第I染色體長臂的
基因簇，編碼一個典型的CC-NBS-LRR類抗性蛋白。它在進(jìn)化上屬于一個相對古老的基因，尚未應(yīng)用于水稻育種實踐。為了加快基因在育種中的應(yīng)用進(jìn)程，降低育種成本，開發(fā)出可以準(zhǔn)確有效的鑒定該基因的功能性分子標(biāo)記顯得尤為重要。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的首要目的是提供鑒定稻瘟病抗性基因的功能特異性分子標(biāo)記YRT3或YRT4。
[0008]本發(fā)明的另一個目的是提供利用所述稻瘟病抗性基因朽似的功能性分子標(biāo)記YRT3或YRT4鑒別或篩選含有稻瘟病抗性基因Ρ?63的水稻品種的方法。
[0009]本發(fā)明的另一個目的是提供稻瘟病抗性基因似的功能性分子標(biāo)記YRT3和YRT4的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
功能性分子標(biāo)記YRT3是用引物對SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2從水稻基因組DNA中擴(kuò)增出來的核苷酸序列，經(jīng)特異限制性內(nèi)切酶消化后電泳檢測，與從特定水稻品種中擴(kuò)增出來的稻瘟病抗性基因呈現(xiàn)一致的帶型；
功能性分子標(biāo)記YRT4是用引物對SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4直接從水稻基因組DNA中擴(kuò)增出核苷酸序列，經(jīng)電泳檢測，與從特定水稻品種擴(kuò)增出來的稻瘟病抗性基因Ρ?63呈現(xiàn)一致的帶型；
其中，所述的特定水稻為水稻品種為羊毛谷(YMG)。
[0011]所用引物對的核苷酸序列如下所示:
SEQ ID N0.1:CCTGCATGGTCTGGCAGAGTCA
SEQ ID N0.2:AGTGAAGTAAGCCCACCAAGGCAA
SEQ ID N0.3:CGCGTGCCCTGCAATACAAACG
SEQ ID N0.4:CTCCATGGTCCCAAGGGCGGTA ；
所述的特異限制性內(nèi)切酶為Ase I。
[0012]所述的稻瘟病抗性基因的功能性分子標(biāo)記YRT3或YRT4的篩選方法是:通過多個水稻稻瘟病抗性基因朽似的等位基因序列與SEQ ID N0.5序列做比對的方法，分析得到能區(qū)分其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pi63功能特異性位點(氨基酸位點N698 (SEQ ID N0.7)和轉(zhuǎn)座子插入序列SEQ ID N0.6)，在通過設(shè)計分別得到SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2及SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4引物，對水稻總DNA擴(kuò)增，分別得到Pi63的功能性分子標(biāo)記YRT3和YRT4。
[0013]所述的篩選方法包括以下具體步驟:
(1)通過PCR擴(kuò)增獲得多個水稻品種的A?似等位基因的編碼區(qū)DNA序列；
(2)利用多序列比對軟件工具，將步驟(1)所獲得的序列翻譯成蛋白序列后進(jìn)行比對，得到/--似型抗性基因所特異的2個多態(tài)性位點，即氨基酸位點N698和如SEQ ID N0.6所示的編碼區(qū)上游轉(zhuǎn)座子插入序列；
(3)根據(jù)步驟(2)得到的2個多態(tài)性位點分別設(shè)計出引物對SEQID N0.1和SEQ IDN0.2及SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4 ;并用這2對引物分別對不同水稻品種的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物A和擴(kuò)增產(chǎn)物B ;然后對擴(kuò)增產(chǎn)物A進(jìn)行酶切、電泳，對擴(kuò)增產(chǎn)物B進(jìn)行直接電泳，通過比較驗證分別得到與稻瘟病抗性基因呈特異性帶型的核苷酸片段YRT3和YRT4 ； (4)對步驟(3)所獲得的分子標(biāo)記在不同水稻品種中進(jìn)行驗證，確定的功能特異性分子標(biāo)記YRT3和YRT4。[0014]上述的篩選方法，步驟(1)中所述的水稻品種為羊毛谷(YMG)、齊頭白谷、93-11(揚稻6號)、黃皮糯、老造谷、細(xì)麻線、Fujisaka 5、Tsuyuake> K59、墨米、Nipponbare東農(nóng)363和麗江新團(tuán)黑谷(LTH)；
步驟(3)中所述的PCR擴(kuò)增，其中擴(kuò)增產(chǎn)物A的PCR反應(yīng)體系如下:2 X PCR Bufferfor KOD FX 10 μ I,dNTPs (2mM each) 4 μ?，引物(lOpmol, F+R) I μ I, KOD FX酶(IU/μ I, TOYOBO) 0.4 μ I, DNA 模板(IOOng/μ I) 2 μ?，加 ddH20 至 20 μ 1，擴(kuò)增反應(yīng)條件:94°C 2 min ；98°C 10 s — 59°C 1.5 min — 68°C 5 min，35 個循環(huán)；68°C 5 min, 10°C保存；擴(kuò)增產(chǎn)物B的PCR反應(yīng)體系如下:2 X PCR Buffer for KOD FX 10 μ I, dNTPs (2mMeach) 4 μ?，引物(lOpmol, F+R) I μ I, KOD FX 酶(IU/μ 1，TOYOBO) 0.4 μ I, DNA 模板(100ng/yl)2 “1，加(1(1!120至20 μ 1，擴(kuò)增反應(yīng)條件:94°C 2 min ；98°C 10 s — 59°C40s — 68°C 5 min，35 個循環(huán)；68°C 5 min，10°C保存；
步驟(3)中所述的擴(kuò)增產(chǎn)物A的大小為1449 bp (SEQ ID N0.5中第1554位至3002位核苷酸)，經(jīng)Ase I酶切后成為2個片段(大小為541 bp, SEQ ID N0.5中第1554位至2094位核苷酸和908 bp, SEQ ID N0.5中第2095位至3002位核苷酸)；擴(kuò)增產(chǎn)物B的大小為421 bp (SEQ ID N0.6中第215位至635位核苷酸)。本發(fā)明還提供利用所述的稻瘟病抗性基因/的功能性分子標(biāo)記YRT3或YRT4鑒別或篩選含有稻瘟病抗性基因朽似的水稻品種的方法: 以待測水稻植株或品種的總DNA為模板，采用如SEQ ID N0.1和2所示序列的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1449 bp,并經(jīng)特異性酶AseI酶切后成為2個片段，大小為908 bp和541bp，則待測水稻植株或品種含有稻瘟病抗性基因Ρ?63 ；
以待測水稻植株或品種的總DNA為模板，采用如SEQ ID N0.3和4所示序列的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為421 bp，則待測水稻植株或品種含有稻瘟病抗性基因A?似；
本發(fā)明還提供所述的稻瘟病抗性基因/的功能性分子標(biāo)記YRT3或YRT4的應(yīng)用，包括利用YRT3或YRT4在大量的水稻種質(zhì)資源中篩選、鑒定該功能抗性基因，以及在分子標(biāo)記輔助育種、基因聚合育種以及轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明具有如下明顯的有益效果:
Ρ?63來源于對稻瘟病菌表現(xiàn)廣譜抗性的云南地方水稻品種羊毛谷YMG，是我國自主克隆的一個同時抗葉瘟和穗頸瘟的新基因(專利號ZL 201210073815.3)。該基因?qū)儆谕耆剐曰?，具有廣譜高抗的優(yōu)點，而且屬于進(jìn)化上相對古老的基因，目前在栽培品種中尚未發(fā)現(xiàn)該基因。因此，基因在水稻育種中具有廣泛的應(yīng)用價值。
[0016]本發(fā)明通過比較不同水稻品種的A?似等位基因編碼區(qū)及其上游的轉(zhuǎn)座子序列，基于朽似基因特有的DNA和氨基酸序列位點開發(fā)出兩套功能特異性分子標(biāo)記(YRT3和YRT4)。應(yīng)用這兩套分子標(biāo)記，以常規(guī)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)輔以限制性內(nèi)切酶酶切，不僅能準(zhǔn)確區(qū)分不同水稻品種資源的朽似基因型，而且能快捷有效從育種群體中篩選到攜帶目標(biāo)基因的個體。對多個群體(如YMG/LTH的重組自交系、YMG/LTH的BC5F2、YMG/C039的F2群體)進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇的實踐證實這兩套分子標(biāo)記遺傳穩(wěn)定，不受環(huán)境因素的影響，可以百分之百地鑒定朽似基因。
[0017]應(yīng)用基因功能特異性分子標(biāo)記對目標(biāo)基因進(jìn)行回交或者常規(guī)雜交轉(zhuǎn)育，以及與其他抗性基因聚合，其育種選擇目標(biāo)明確，可以大大節(jié)約時間和成本，提高抗稻瘟病育種效率。本發(fā)明的分子標(biāo)記由于源自基因內(nèi)部功能特異性位點之多態(tài)性，不存在不良性狀的遺傳累贅問題。另外，本發(fā)明的標(biāo)記由于朽似基因尚未在栽培品種中被應(yīng)用，在栽培稻中具有廣泛的適用性。因此，本發(fā)明提供的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，對于加速水稻稻瘟病抗性基因Pi63在水稻育種中的應(yīng)用具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為朽似及其不同品種中等位基因部分氨基酸序列比對結(jié)果。
[0019]圖2為分子標(biāo)記YRT3和YRT4在不同水稻品種中的檢測結(jié)果。
[0020]其中，a為YRT3檢測結(jié)果；b為YRT4檢測結(jié)果；M.Maker; 1-17分別為YMG，LTH，93-11, Fujisaka 5, Tsuyuake, K59,齊頭白谷，墨米，Kinmaze, Aichi Asahi, C039,南京11，Nipponbare，黃皮糯，老造谷，細(xì)麻線和東農(nóng)363。
[0021]圖3為分子標(biāo)記YRT3和YRT4在重組自交系群體中的檢測結(jié)果。
[0022]其中，a為 YRT3 檢測結(jié)果；b 為 YRT4 檢測結(jié)果；M: Maker ; 1:YMG ;2:LTH ;3_5 和13-17:不含有/--似基因的家系；6-12:含A?似基因的家系；R:抗??；S:感病。
[0023]圖4為分子標(biāo)記YRT3和YRT4在YMG和LTH的BC5F2單株中的檢測結(jié)果。
[0024]其中，a為 YRT3 檢測結(jié)果；b 為 YRT4 檢測結(jié)果；M:Maker; 1:YMG ;2:LTH ;3_5:含/--似基因的純合單株；6-14:含A?似基因的雜合單株；15-17:不含A?似基因的單株；+:含/--似基因；-:不含/--似基因；R:抗病；S:感病。
[0025]圖5為分子標(biāo)記YRT3和YRT4在YMG和C039的F2單株中的檢測結(jié)果。
[0026]其中，a為 YRT3 檢測結(jié)果；b 為 YRT4 檢測結(jié)果；M:Maker ; 1:YMG ;2:C039 ;3_6:含/--似基因的純合單株；7-14:含A?似基因的雜合單株；15-17:不含A?似基因的單株；+:含/--似基因；-:不含/--似基因。
【具體實施方式】
[0027]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法(例如:山崎義人、高坂淖爾編著.稻瘟病與抗病育種(凌忠專、孫昌其譯).農(nóng)業(yè)出版社，1990 ;凌忠專著.稻瘟病研究論文集.中國農(nóng)業(yè)出版社.2005;路鐵鋼等編著.分子遺傳學(xué).高等教育出版社，2008)。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028]實施例1 及其等位基因氨基酸序列比對及特異氨基酸位點的鑒定
通過PCR擴(kuò)增、測序方法，從羊毛谷(YMG)、齊頭白谷、93-11 (揚稻6號)、黃皮糯、老造谷、細(xì)麻線、Fujisaka 5、Tsuyuake、K59、墨米、東農(nóng)363和麗江新團(tuán)黑谷(LTH)基因組DNA中獲得等位基因編碼區(qū)DNA序列，從水稻數(shù)據(jù)庫中獲得參考品種Nipponbare的3個基因0s01g57280、L0C_ 0s01g57310和Pish編碼區(qū)DNA序列。利用軟件工具Pr imerPremier 5將DNA序列翻譯成氨基酸序列，然后利用軟件工具將所獲得氨基酸序列進(jìn)行多序列比對分析，鑒定到/--似基因所特有的4個氨基酸位點N698、Y1003、A1031和Vl 177(圖1)。
[0029]實施例2 'Pi63基因編碼區(qū)上游序列分析
利用常規(guī)PCR手段擴(kuò)增 A?似基因編碼區(qū)上游序列，經(jīng)測序得到1597bp序列。通過NCBI BLAST 比對(http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBI ast&PAGE_TYPE = BI astSearch&SHOW_DEFAULTS = on&LINK_L0C=blasthome),在編碼區(qū)上游發(fā)現(xiàn)一個715bp大小的TIR類型的轉(zhuǎn)座子,但未發(fā)現(xiàn)在水稻中存在該轉(zhuǎn)座子的同源序列。
[0030] 實施例3 'Pi63基因特異性分子標(biāo)記開發(fā)及檢測
利用存在于A?似基因的特異氨基酸位點N698 (Ρ?63蛋白中對應(yīng)的密碼子為AAT，其余品種為GAT)，根據(jù)CAPS標(biāo)記設(shè)計原理，利用在線軟件dCAPS Finder 2.0 (http://helix, wustl.edu/dcaps/dcaps.html)和 Primer-BLAST (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index, cgi? LINK_LOC=BlastHome)設(shè)計引物 YRT3,該引物對的核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。YRT3的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:2 X PCRBuffer for KOD FX 10 μ I, dNTPs (2mM each) 4 μ?，引物(lOpmol, F+R) I μ I, KODFX 酶(lU/μΙ, TOYOBO) 0.4 μ 1，DNA 模板(IOOng/μ I) 2 μ?，加 ddH20 至 20 μ I。擴(kuò)增反應(yīng)條件:94°C 2 min ；98°C 10 s — 59°C 1.5 min — 68°C 5 min，35 個循環(huán)；68°C 5min，10°C保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制系性內(nèi)切酶消化，反應(yīng)體系為:10 XFastDigest? green buffer 2 μ I,限制性內(nèi)切酶AseI I “1,加(1(1!120至25 “1,于37。〇消化4小時。酶切消化產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠檢測，PCR擴(kuò)增得到的片段大小為1449 bp(SEQ ID N0.5中第1554位至3002位核苷酸)，經(jīng)限制酶消化后出現(xiàn)541 bp (SEQ ID N0.5中第1554位至2094位核苷酸)和908 bp (SEQ ID N0.5中第2095位至3002位核苷酸)的兩條帶，即為朽似基因的特異性分子標(biāo)記YRT3的檢測結(jié)果。
[0031]根據(jù)InDel/Insert設(shè)計原理，基于/--似基因編碼區(qū)上游存在的轉(zhuǎn)座子序列設(shè)計特異性引物YRT4，該引物對的核苷酸序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。SEQ IDN0.3序列位于轉(zhuǎn)座子內(nèi)，SEQ ID N0.4位于轉(zhuǎn)座子下游。YRT4的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:2 XPCR Buffer for KOD FX 10 μ I, dNTPs (2mM each) 4μ1，引物(lOpmol, F+R) I μ I, KODFX 酶(lU/μΙ, TOYOBO) 0.4 μ I, DNA 模板(IOOng/μ I) 2 μ 1，加 ddH20 至 20 μ I。擴(kuò)增反應(yīng)條件:94°C 2 min ；98°C 10 s — 59°C 40s — 68°C 5min，35 個循環(huán)；68°C 5 min,10°C保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠檢測，PCR擴(kuò)增得到大小為421bp(SEQ IDN0.6中第215位至635位核苷酸)的片段，即為基因的特異性分子標(biāo)記YRT4的檢測結(jié)果。
[0032]實施例4 ,Pi63基因特異功能性分子標(biāo)記在不同水稻品種中的檢測
提取17個不同水稻品種的基因組DNA，以此為模板，利用實施例3中描述的PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件，分別利用功能性分子標(biāo)記YRT3和YRT4進(jìn)行擴(kuò)增，YRT3的擴(kuò)增產(chǎn)物需經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化。經(jīng)瓊脂凝膠電泳檢測，電泳結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯示只有的供體YMG中含有朽似基因，其他品種中不含有該基因。分子標(biāo)記YRT3和YRT4可以特異地鑒定/--似基因。
[0033]實施例5 ,Pi63基因在YMG/LTH的重組自交系群體(RILs)中的檢測
對來自于YMG ( ^ )和LTH (早)的267個RILs家系(F12代)進(jìn)行實施例3中描述的檢測過程。在所檢測267個家系中，利用標(biāo)記YRT3檢測出有127個家系出現(xiàn)YMG的帶型；利用標(biāo)記YRT4同樣檢測出有127個家系出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，與親本YMG的帶型一致。檢測結(jié)果符合孟德爾遺傳比1:1 (127:140)，部分檢測結(jié)果如圖3所示。[0034]實施例6 ,Pi63基因在YMG/LTH的BC5F2群體中的檢測
對來自于YMG ( ^ )和LTH (早)的47個BC5F2單株進(jìn)行實施例3中描述的檢測過程。在所檢測的47個單株中，利用標(biāo)記YRT3檢測出/--似/朽似基因型單株12個，Ρ?63/Ρ?63雜和基因型單株25 Λ',Pi63/pi63基因型單株10個；利用標(biāo)記YRT4檢測出含有/--似基因的單株25個。兩對分子標(biāo)記檢測結(jié)果完全一致，且檢測結(jié)果符合孟德爾遺傳比1:2:1(12: 25:10)，部分檢測結(jié)果如圖4所示。
[0035]實施例7 -.Ρ?63基因在YMG/C039的F2群體中的檢測 對來自于YMG ( ^ )和C039 (早)的87個F2單株進(jìn)行實施例3中描述的檢測過程。在所檢測的87個單株中，利用標(biāo)記YRT3檢測出基因型單株22個，Ρ?63/Ρ?63雜和基因型單株52 Λ',Pi63/pi63基因型單株13個；利用標(biāo)記YRT4檢測出含有/--似基因的單株74個。兩對分子標(biāo)記檢測結(jié)果完全對應(yīng)，且檢測結(jié)果符合孟德爾遺傳比1:2:1(22:52:13)，部分檢測結(jié)果如圖5所示。
[0036]實施例8:YMG/LTH的RILs和BC5F2群體的稻瘟病抗性鑒定
待水稻長至3葉一心期時，利用稻瘟病鑒別菌株CH43對YMG/LTH的267個RILs家系和47個BC5F2單株進(jìn)行稻瘟病噴霧接種鑒定，以抗病親本YMG和感病親本LTH作對照。水稻稻瘟病抗性測定按0-5級分級標(biāo)準(zhǔn):0-3級為抗病R，4-5為感病S。結(jié)果發(fā)現(xiàn)267個RILs家系中，127個含有朽似基因的家系都表現(xiàn)為抗病反應(yīng)，其余140個不含有朽似基因的家系均表現(xiàn)感病，這與實施例5中分子標(biāo)記檢測結(jié)果一致。47個BC5F2單株中，37個表現(xiàn)抗病，10個表現(xiàn)為感病，與實施例6中分子標(biāo)記檢測結(jié)果完全對應(yīng)，即含有/^63基因的單株表現(xiàn)為抗病反應(yīng)，不含有/基因的單株表現(xiàn)感病，部分抗性表型結(jié)果如圖3和圖4所示。經(jīng)稻瘟病菌的抗性鑒定，分子標(biāo)記結(jié)果與抗性結(jié)果完全吻合，說明本發(fā)明所提供的特異鑒定Ρ?63基因的功能性分子標(biāo)記可以準(zhǔn)確鑒定Pi63基因。
[0037]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例中品種和群體的限制，其他的任何未違背本發(fā)明精神實質(zhì)及原理下所做的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本和發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.稻瘟病抗性基因Pi63的功能特異性分子標(biāo)記YRT3或YRT4，其特征在于:分子標(biāo)記YRT3是通過正向引物如SEQ ID N0.1所示序列和反向引物如SEQ ID N0.2所示序列從水稻總DNA中擴(kuò)增出來的核苷酸序列，并經(jīng)特異性酶切后再電泳檢測到的與稻瘟病抗性基因Ρ?63呈特異性帶型的分子標(biāo)記；分子標(biāo)記YRT4是通過正向引物如SEQ ID N0.3所示序列和反向引物如SEQ ID N0.4所示序列從水稻總DNA中擴(kuò)增出來的核苷酸序列，經(jīng)直接電泳檢測到的與稻瘟病抗性基因呈特異性帶型的分子標(biāo)記； 其中，所述的水稻為水稻品種為羊毛谷(YMG)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的稻瘟病抗性基因似的功能性分子標(biāo)記YRT3或YRT4，其特征在于:所述的稻瘟病抗性基因A?似的DNA序列如SEQ ID N0.5所示，所述的稻瘟病抗性基因/--似的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的稻瘟病抗性基因似的功能性分子標(biāo)記YRT3或YRT4，其特征在于:通過引物對SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2從水稻總DNA中擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物大小為1449 bp，并經(jīng)特異性酶AseI酶切后成為2個片段，大小為908 bp和541bp ;通過引物對SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4從水稻總DNA中擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物大小為421 bp。
4.一種利用權(quán)利要求1~3任一項所述的稻瘟病抗性基因朽似的功能性分子標(biāo)記YRT3或YRT4鑒別或篩選含有稻瘟病抗性基因似的水稻品種的方法，其特征在于: 以待測水稻植株或品種的總DNA為模板，采用如SEQ ID N0.1和2所示序列的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1449 bp,并經(jīng)特異性酶AseI酶切后成為2個片段，大小為908 bp和541bp，則待測水稻植株或品種含有稻瘟病抗性基因Ρ?63 ;或 以待測水稻植株或品種的總DNA為模板，采用如SEQ ID N0.3和4所示序列的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為421 bp，則待測水稻植株或品種含有稻瘟病抗性基因/--似。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:采用如SEQID N0.1和2所示序列的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述的PCR擴(kuò)增，其中擴(kuò)增產(chǎn)物A的PCR反應(yīng)體系如下:2X PCR Bufferfor KOD FX 10 μ I, dNTPs (2 mM each) 4 μ?，引物(I Opmol, F+R) I μ I, KOD FX酶(I U/μ I, TOYOBO) 0.4 μ?，DNA 模板(100 ng/μ I) 2 μ?，加 ddH20 至 20 μ?，擴(kuò)增反應(yīng)條件:94°C 2 min ；98°C 10 s — 59°C 1.5 min — 68°C 5 min，35個循環(huán)；68°C 5 min,10°C保存；采用如SEQ ID N0.3和4所示序列的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下:2X PCR Buffer for KOD FX 10 μ l,2mM dNTPs 4 μ 1，IOpmol 引物 I μ I, IU/μ I KODFX 酶 0.4 μ l，100ng/y I DNA 模板 2 μ?，加 ddH20 至 20 μ 1，擴(kuò)增反應(yīng)條件:94°C 2 min ；98°C 10 s — 59°C 40 s — 68°C 5 min，35 個循環(huán)；68°C 5 min，l(TC保存。
6.權(quán)利要求1~3任一項所述的稻瘟病抗性基因似的功能性分子標(biāo)記YRT3或YRT4的應(yīng)用，其特征在于:利用所述的稻瘟病抗性基因的功能性分子標(biāo)記YRT3或YRT4在分子標(biāo)記輔助育種、基因聚合育種以及轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103642803SQ201310669214
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】萬建民, 雷財林, 馬建, 馬小定, 程治軍, 王久林, 張欣, 郭秀平, 王潔, 趙志超, 吳赴清, 林啟冰 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所