一種生物天然納米級無機載體材料的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明具體公開了一種生物天然納米級無機載體材料的制備方法，該制備方法包括了微細化、活化技術(shù)工藝基礎上的超分子組裝化學改性技術(shù)工藝。本發(fā)明所提供的天然基質(zhì)環(huán)境友好HP(Highporperty)材料，不僅具備固定化技術(shù)載體理想的上述條件，還具有獨特的（1）天然一維納米微粒物質(zhì)和納米級層、鏈狀微觀構(gòu)造；（2）富含有以碘、硒、鋅、鐵為代表的生命微量元素14種中的13種；（3）惰性，耐酸堿；耐高溫（1300℃）的三個性能。經(jīng)水動力柔性解聚分散和分離提純技術(shù)工藝實現(xiàn)微細與純化、“酸—熱—機械力化學”活化、超分子組裝化學改性等技術(shù)工藝，制備出高純、微納米生物分子固定化載體（支撐物）材料。
【專利說明】一種生物天然納米級無機載體材料的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種酶、細胞、亞細胞、微生物等生物分子實施固定化技術(shù)與應用的生物天然納米級無機載體(支撐物)材料的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物固定化技術(shù)(immobilizationof biological techology)是現(xiàn)代生物工程領(lǐng)域中的一項新興技術(shù)，它是固定化酶或固定化細胞等生物得到更廣泛、更有效使用的一種重要手段，因此，生物固定化技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)及其工業(yè)化環(huán)節(jié)中的一個核心技術(shù)。其中，隨著固定化技術(shù)的發(fā)展，固定化生物分子對載體的需求越來越迫切，新型載體的研制越來越重要，而且，研究異常活躍。
[0003]無機層狀材料作為生物分子的支撐載體，具有許多其他無機載體無法比擬的優(yōu)勢，對其研究是近來材料領(lǐng)域又一新熱點。無機層狀材料具有納米級特殊層狀結(jié)構(gòu)，層狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成層間距空間會隨著嵌入分子的大小而發(fā)生相應的變化，其不僅為生物分子提供了一個支撐載體，而且為生物化學反應提供了一個納米級反應空間。這一空間，不僅可以有效地保護生物分子，而且，層狀材料空曠界架，也不會堵塞生物分子的信號傳輸，表現(xiàn)出優(yōu)良載體的品性，除在高穩(wěn)定性和催化活性酶固定化作為優(yōu)良載體外，還將在細胞、亞細胞、微生物以及生物傳感、生物標識、藥物緩釋領(lǐng)域具有潛在的應用價值。
[0004]生命科學和生物技術(shù)與納米科學和技術(shù)并稱本世紀科學技術(shù)發(fā)展的兩大主流。生命科學的研究是人類活動過程的主要組成部分，納米科學和技術(shù)則是近期最活躍的領(lǐng)域之一，這兩個領(lǐng)域的研究與應用結(jié)合的生物納米技術(shù)，自然是引人關(guān)注的焦點。材料和材料科學是科學技術(shù)進步和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的先導和基礎，能為納米生物技術(shù)提供支撐載體的材料便成為焦點中的焦點。
[0005]酶、細胞、亞細胞和微生物存在的活性和穩(wěn)定性以及催化性能對環(huán)境十分敏感，尤其是酶。酶高效專一的催化性能`，早已引起人們的廣泛關(guān)注。但是，酶作為催化劑在生化反應中的應用，還有一定的局限性。因為酶是蛋白質(zhì)，其高級結(jié)構(gòu)對環(huán)境十分敏感，各種因素如物理因素(溫度、壓力、電磁場)、化學因素(氧化、還原、有機溶劑、熱、金屬離子、pH)和生物因素(酶降解)均有可能使酶喪失活性，即使在最適條件下，酶也會失活，隨著反應時間的延長，反應速率下降，而且反應后回收困難。因此，對如何既能保持酶的這種高效專一催化活性，又能克服酶在應用上的局限性是人們夢寐以求的目標，眾多學者在此領(lǐng)域前赴后繼作出了大量工作，最終發(fā)現(xiàn)較為有效的解決途徑是進行酶的固定。
[0006]20世紀50年代發(fā)展起來的固定化技術(shù)，使固定化酶與游離酶相比，具有以下優(yōu)
占-
^ \\\.(O易于分離；
(2)提聞了酶的穩(wěn)定性；
(3)提高了酶的效率，降低成本；
(4)生產(chǎn)工藝由原先的分批法發(fā)展為連續(xù)化、自動化。[0007]酶的固定方法很多，按照用于結(jié)合的化學反應類型，大致可分為三類:非共價結(jié)合法、化學結(jié)合法及包埋法。
[0008]固定化酶雖然有很多游離酶無法比擬的優(yōu)勢，然而，酶固定化對載體材料具有很高的要求，如要有良好的強度、良好的熱穩(wěn)定性、化學穩(wěn)定性、良好的抗微生物及酶的結(jié)合能力等。載體材料的價格還直接影響固定化酶能否真正應用到實際生產(chǎn)中。
[0009]由于難以找到理想的載體材料，再加上酶在固定化過程中不可避免地損失部分活力，甚至當固定方法不得當時，會損失絕大數(shù)活力等原因，到目前為止，也只有十幾種固定酶應用于生產(chǎn)中，因此，開發(fā)更簡便、更適用的固定化方法以及性能優(yōu)異的載體材料，使更多的固定化酶和細胞取得工業(yè)規(guī)模的應用，仍然是這個領(lǐng)域追求的目標。
[0010]早在20世紀60年代，基于層狀硅酸鹽礦物原料易得，價格低廉，作為被選的酶支撐體層狀材料，并吸引學者的關(guān)注。由于當時的技術(shù)局限性，學界僅利用了外表面的吸附作用，并沒有充分利用層狀材料內(nèi)表面積和層間保護作用，因而，沒有引起科學界更廣泛的注意和應用。隨著上世紀80年代后期納米科學的興起，納米插層技術(shù)、剝離技術(shù)的提高，層狀材料作為酶支撐載體又重新引起人們極大興趣，并總結(jié)出以下優(yōu)勢:
(1)可利用層狀材料較多，而且還具光、電、磁等性能；
(2)層狀材料的層間距可以根據(jù)客體分子大小進行調(diào)整，對固定后生物分子的結(jié)構(gòu)不會明顯的擾動；
(3)層狀材料為固定后生物分子提供了一個保護性微環(huán)境，可以有效抑制生物分子降解。
[0011 ] 于是，利用層狀材`料構(gòu)建功能性的生物支撐載體與復合材料成為了當前材料領(lǐng)域的一個研究熱點。
[0012]HP材料，除了具備上述層狀材料的一般優(yōu)勢外，還具有以下三點特質(zhì):
①天然一維納米微粒物質(zhì)；
②具層、鏈、纖維狀晶體構(gòu)造與納米級孔、穴通道的微觀構(gòu)造；
③含以碘、硒、鋅、鐵為代表的生物體必需營養(yǎng)微量元素14種的13種。
[0013]這些特質(zhì)，使層狀材料在納米尺度、構(gòu)造、結(jié)構(gòu)強度，和提供生物營養(yǎng)物質(zhì)等方面有了質(zhì)的提高，使其不僅在活性生物酶高穩(wěn)定性催化功能得到大幅提升，而且在細胞、半細胞、微生物領(lǐng)域獲得重要應用，并且是優(yōu)良的生化反應器、生物傳感器的優(yōu)良材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提出一種酶、細胞、亞細胞、微生物等生物分子實施固定化技術(shù)與應用的生物天然納米級無機載體材料的制備方法。
[0015]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用技術(shù)方案如下:
一種酶、細胞、亞細胞、微生物等生物分子實施固定化技術(shù)與應用的生物天然納米級無機載體材料的制備方法，其特征在于該制備方法包括了微細化、活化技術(shù)工藝基礎上的超分子組裝化學改性技術(shù)工藝。
[0016]進一步的，該方法包括超分子組裝化學改性技術(shù)工藝。
[0017]進一步的，該方法具體流程是:微細化、活化、改性技術(shù)工藝。
[0018]生物固定化技術(shù)(immobilized biotechnology)是現(xiàn)代生物科學領(lǐng)域的重要新技術(shù)，它是通過化學和物理的手段將游離的酶或細胞、微生物定位于限定區(qū)域內(nèi)，使其保持活性并可反復利用。固定生物技術(shù)具生物密度高、反應迅速、生物流失少、產(chǎn)物易分離以及反應過程易控制等優(yōu)點，是一種高效低耗、運轉(zhuǎn)管理容易和具有應用前途的新技術(shù)。
[0019]生物固定化技術(shù)除無載體固定外，其余無論吸附法、共價結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法和系統(tǒng)截留，都與載體有著密切關(guān)聯(lián)。理想的固定化載體應是:(I)對酶、細胞和微生物無毒性；(2)傳質(zhì)性能好、性質(zhì)穩(wěn)定、不易被生物分解；(3)強度高、壽命長；(4)價格低廉等。
[0020]本發(fā)明所提供的天然基質(zhì)環(huán)境友好HP (High porperty)材料,不僅具備固定化技術(shù)載體理想的上述條件，還具有獨特的(I)天然一維納米微粒物質(zhì)和納米級層、鏈狀微觀構(gòu)造；(2)富含有以碘、硒、鋅、鐵為代表的生命微量元素14種中的13種；(3)惰性，耐酸堿；耐高溫(1300°C)的三個性能。經(jīng)水動力柔性解聚分散和分離提純技術(shù)工藝實現(xiàn)微細與純化、“酸一熱一機械力化學”活化、超分子組裝化學改性等技術(shù)工藝，制備出高純、微納米生物分子固定化載體(支撐物)材料。并可作為生物反應器、生物傳感器的功能性材料。為解決生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的共性關(guān)鍵一功能材料問題提供了技術(shù)支持，為發(fā)展生物產(chǎn)業(yè)提供了先導與基礎。
【具體實施方式】
[0021]下面將結(jié)合具體實施方法來詳細說明本發(fā)明，在本發(fā)明的示意性實施及說明用來解釋本發(fā)明，但并不作為對本發(fā)明的限定。
[0022]實施例1:
1、HP材料的剝離與重組
HP材料的微觀層間以弱的靜電力或范德華力結(jié)合，當在層間引入分子或者離子時，會引起層間距離(層間域)增大；當增大到一定程度時，層層之間作用力逐漸減弱至最后消失，導致層狀材料以單片狀態(tài)存在于溶液中，這一過程成為層狀材料的剝離。然后，通過生物分子與片層結(jié)構(gòu)單元的靜電引力，進行界`面組裝，達到與引入生物分子的重組。剝離后重組的驅(qū)動力是生物分子與片層結(jié)構(gòu)單元的靜電引力，而其所帶正負電荷是可以通過體系PH進行調(diào)控，成為影響復合結(jié)構(gòu)和性能的重要因素。剝離插層重組條件相對溫和，并可以獲得結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和對生物分子損傷小的產(chǎn)物，因而，備受生物產(chǎn)業(yè)界的青睞。
[0023]HP材料具有一定的膨脹性、層板電荷密度低，層間作用力較弱，在水介質(zhì)中自發(fā)出現(xiàn)溶脹剝離現(xiàn)象，表現(xiàn)出高分散特性?；贖P材料在水介質(zhì)中的自發(fā)膨脹剝離性質(zhì)，生物分子和較大體積高分子才可以通過于層間域進行離子交換而進入層間。但是，HP材料僅有的自發(fā)剝離性缺乏人為的設計與技術(shù)裁剪，而且濃度低，能組裝的客體分子數(shù)量有限，因而，應用仍受到限制。
[0024]針對以上局限性，對活性酶等生物載體材料的制備實施方案為以下技術(shù)措施:達到微納米化、大比表面積、高活性中心、高分散與充分相容性等優(yōu)化性能，而成為優(yōu)質(zhì)生物分子載體材料。
[0025](I)HP材料的水介質(zhì)柔性粉碎超微化技術(shù)工藝(包括采用軟化學方法)。
[0026]通過制備超微HP材料載體，采用水介質(zhì)柔性粉碎，進行工序參數(shù)調(diào)整，達到設計粒度為SOOnm— I μ m的指標，使生物分子不進入孔穴與通道，生物分子固定在載體表面，消除由孔隙在所造成的內(nèi)擴散影響，由于超微化后的吸附表面積大，使生物分子極易吸附于載體表面，在獲得很高比活性且穩(wěn)定的固定化酶等生物分子的同時，解決了生物分子濃度低的問題。
[0027](2) HP材料的“熱一酸一機械力化學”活化對生物分子承載力提升
為了提高組裝客體分子數(shù)量，對HP材料采用“酸活化一熱活化一機械力化學活化”的體系性技術(shù)工藝，在12%體積百分比Hcl條件下，浸淋HP材料，除去雜質(zhì)和“H+”置換“Al+3” “Mg+2”等，使表面和負電活性提高，從而增加對客體分子大劑量的承載；通過2500C 土 10°C的熱處理活化，將HP材料內(nèi)表面所持多種類型水進行驅(qū)趕，騰出為水分子占據(jù)的內(nèi)、外比表面積，使HP材料的內(nèi)、外比表面積大幅增加，從而使組裝生物分子數(shù)量也進一步得到大幅度增加；“機械力化學活化”是應用球磨裝置或電碾在常溫下，經(jīng)過4h的機械力化學反應，HP材料物料撞擊過程中，物料表面由于平衡晶格的破壞而制造出大量的晶格缺陷，這些缺陷處是電荷不平衡的活性中心，是提高比活性和穩(wěn)定性的基礎。
[0028](3)無機超分子插層化學組裝HP材料的改性
HP材料作為高性能生物材料，與生物高分子構(gòu)成復合材料，首先要解決相容性和分散性問題，否則無法發(fā)揮其相應功能，甚至其的添加、介入、復合，反而成為了引入缺陷。HP材料是“親水”的極性微粒物質(zhì)，與生物高分子相容并均勻分散，就必須進行改性，通俗意義上就是改“親水”為“疏水”。
[0029]應用無機超分子插層組裝化學技術(shù)，采用軟化學條件，利用PH材料層、鏈、介孔構(gòu)造，應用烷基銨鹽改性劑，完成對HP材料改性，實現(xiàn)HP材料作為高分子復合材料的目的，與生物基體高度相容，在生物基體中均勻分散，達到有效的催化高穩(wěn)定和生物生理的功能作用。
[0030]超分子化學是基于分子間的非共價鍵相互作用而形成分子聚集體的化學。超分子化學不同于基于原子構(gòu)建分子的傳統(tǒng)分子化學，是分子以上層次的化學，它主要研究兩個或多個分子通過分子間的非`共價弱鍵相互作用，如氫鍵、范德華力，偶極一偶極相互作用，親水/疏水相互作用以及它們之間協(xié)同作用而生成分子聚集體的結(jié)構(gòu)與功能，將單分子拓展至分子組裝體。開拓了創(chuàng)造新物質(zhì)與新材料及新功能的嶄新發(fā)展空間。
[0031]“分子自組裝”與“分子識別與位點識別”是兩個最重要的要素?！胺肿幼越M裝”是指不借助外力指導或操縱下，直接通過非共價鍵相互作用而進行的系統(tǒng)構(gòu)建。分子識別與位點識別是指以特定空間環(huán)境為前提，使幾種相同或不同分子間作用力協(xié)同作用于一定部位，形成催化的聯(lián)系?！胺肿幼R別”可以定義為某給定受體對作用物選擇性結(jié)合并產(chǎn)生某種特定功能的過程，分子識別是在超分子水平上進行信息處理的基礎。納米超分子的研究是超分子的一個全新、正在開拓的領(lǐng)域。
[0032]插層組裝化學是在保持層狀主體骨架的前提下，引入功能性客體，形成具有主客體特征插層結(jié)構(gòu)和超分子化學組裝。插層組裝化學是超分子化學組裝原理指導下的通過插層組裝與分子復合，以一種更為便捷、經(jīng)濟的手段制備性能優(yōu)化的功能材料，其中，包括層狀前體、層狀主體對層間客體的識別，層內(nèi)限域空間的化學反應行為與操縱等重要內(nèi)容。
[0033]實踐證明，軟化學方法制備納米復合功能材料，與傳統(tǒng)高溫固相反應制備方法相t匕，是較為理想的方法。軟化學方法是在較低溫度環(huán)境中進行，可制得多種具有“介穩(wěn)”狀態(tài)的復合材料而具潛力。由于軟化學技術(shù)是一類在溫和條件下實現(xiàn)的化學反應過程，易于實現(xiàn)對其化學反應過程、路徑和機理的控制，從而可根據(jù)需要控制反應過程的條件，對產(chǎn)物的組份和結(jié)構(gòu)進行設計，進而達到“剪裁”其物理性質(zhì)的目的。其優(yōu)點在于將新材料制備的前沿技術(shù)從高溫、高壓、高真空、高能和昂貴的物理方法中解脫出來。軟化學方法的關(guān)鍵在于前驅(qū)體的分子設計與制備技術(shù)。
[0034]HP材料的微觀構(gòu)造除層、鏈、纖維狀晶體結(jié)構(gòu)外，尚存在許多納米級孔穴與通道，而使其為“介孔固體”。盡管其為無序介孔固體，但與體相材料相比，表面積增大與活性部分增多是顯著優(yōu)勢，仍有可利用的部分，而且微粒間尚有次生空隙。目前，學界認為，不能單純以平均孔徑尺寸來表征，孔隙率也是評價介孔固體的重要參數(shù)，還有介孔固體的孔徑分布也是評價介孔固體的一個參數(shù)。還認為:孔徑大于2nm，并具有顯著表面效應的多孔固體可定義為介孔固體。
[0035]HP材料“有機化”改性劑選擇了帶有陽離子官能團的烷基銨鹽(alkylammonium)表面活性劑，烷基銨鹽有效地將HP材料中水合無機陽離子交換出來，進入HP材料的片層空間(層間域)，擴大層間距離的同時，降低電層的表面能。另外，烷基銨鹽能與生物分子鏈有較強的物理或化學作用，提高HP材料片層與生物基體間的親和力，從而實現(xiàn)分子水平上設計材料與顯著的生物生理綜合功能，以及在生物基體中的相容與均勻分散。
[0036]因而，本項目的無機超分子插層組裝化學的改性技術(shù)，耦合了無機超分子插層組裝化學技術(shù)和60°C—80°C溫度的低溫度軟化學方法，利用了 HP材料層、鏈與介孔構(gòu)造的界面效應，并選用高成熟度的烷基銨鹽改性劑等多項前沿技術(shù)與材料功能，為實現(xiàn)HP材料在生物基體中的充分相容與均勻分散提供了技術(shù)支持。
[0037]2、應用實例
HP材料作為生物活性藥物復合制劑的載體在以下獸用生物藥品的創(chuàng)制方面進行了應
用:
I)在截短側(cè)耳素發(fā)酵、純化和結(jié)晶工藝技術(shù)過程中應用。截短側(cè)耳素的創(chuàng)制首次采用核物理的誘變方法，已篩選到優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)菌`株并優(yōu)化發(fā)酵工藝，穩(wěn)定的傳代、在國內(nèi)首次得到20000U/ml高產(chǎn)菌種。
[0038]2)苦豆子堿有效單體的提取。
[0039]3)酸棗仁結(jié)構(gòu)改造產(chǎn)物的制備。
[0040]上述生物藥物創(chuàng)制均應用了經(jīng)超微化、聯(lián)合活化和改性的HP材料，均利用了其天然生態(tài)基質(zhì)、比表面積大、納米微粒物質(zhì)和構(gòu)造以及富含多種生命營養(yǎng)微量元素等特征，通過吸附、非共價結(jié)合、化學結(jié)構(gòu)、包埋等方法，保持了生物藥物的穩(wěn)定性及活性，并促進了復合生物制劑的抗病毒、抗菌性能。
[0041]3、生物分子插層復合物的結(jié)構(gòu)表征
生物分子插層進入層狀結(jié)構(gòu)HP材料層間域前后，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化情況，一般用光譜手段，而插層后所形成的復合結(jié)構(gòu)，一般用X衍射手段進行測試；插層后形貌的變化，用電鏡手段進行觀察。
[0042]I)光譜方法
目前報導檢測生物酶或蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的手段主要是:紫外光譜(Uv — Vis)、紅外透射吸收光譜(FT — IR)、熒光光譜(RF)等。
[0043]2) X射線衍射
生物分子是否已經(jīng)引入到層狀HP材料層間、X射線衍射提供了最直接的證明，當結(jié)晶良好，經(jīng)常會出現(xiàn)一系列的衍射峰。這些衍射峰的歸屬根據(jù)布拉格公式進行計算。
[0044]HP材料層間引入十六烷基三甲基銨(HPTMA+)離子后，HP材料親水表面變成疏水表面，使其通過疏水作用固定苦豆子堿，根據(jù)層間距的變化，可以證明苦豆子堿吸附固定在表面或內(nèi)部構(gòu)造上。根據(jù)X射線衍射結(jié)果，不僅可以證明插層是否成功，而且還可以擬合出插層復合物的結(jié)構(gòu)。
[0045]若采用同樣結(jié)構(gòu)的層狀材料固定不同用量的葡萄糖氧化酶分子的X射線衍射結(jié)果。制樣方法是:將固定化樣品分散在Ph=4的乙酸緩沖溶液中，然后輔在玻璃片上，空氣干燥后測試。從衍射圖上可以看出，當負載量為97%時，復合物的層間距為44A°，扣除掉該材料層板本身厚度9.6A。，增加的層間距為44A°，這一層間距小于生物分子本身70 A°的尺寸，證明生物分子吸附在載體的表面。
[0046]3)電鏡方法
生物分子插層入層狀HP材料后，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可以通過電鏡(TEM、STM)進行直接觀察；而且，通過電鏡方法，也可以直接觀察到生物分子插層后，層間距的變化。電鏡方法是表征生物分子插層最直觀的一種方法。
[0047]4)元素分析
元素分析是通過表征插層復合物的元素組成，來進一步確定插層成功的一種輔助方法，而且可以定量地確定插層物的量。
[0048]以上對本發(fā)明實施例所提供的技術(shù)方案進行了詳細介紹，本文中應用了具體個例對本發(fā)明實施例的原理以及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只適用于幫助理解本發(fā)明實施例的原理；同時， 對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明實施例，在【具體實施方式】以及應用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應理解為對本發(fā)明的限制。
【權(quán)利要求】
1.一種酶、細胞、亞細胞、微生物等生物分子實施固定化技術(shù)與應用的生物天然納米級無機載體材料的制備方法，其特征在于該制備方法包括了微細化、活化技術(shù)工藝基礎上的超分子組裝化學改性技術(shù)工藝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:該方法包括超分子組裝化學改性技術(shù)工藝。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:該方法具體流程是:微細化、活化、改性技術(shù)工藝。
【文檔編號】C12N11/14GK103805592SQ201310670571
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】曹發(fā)魁, 史振業(yè), 孫礦生 申請人:甘肅金宇生態(tài)環(huán)境工程有限公司