含有蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因bki1的植物表達(dá)載體的構(gòu)建的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及含有蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKI1的植物表達(dá)載體的構(gòu)建。所構(gòu)建的植物表達(dá)載體pOX-BKI1是由蘋果BKI1基因插入植物表達(dá)載體pRI101AN質(zhì)粒進(jìn)行重組反應(yīng)得到。將該植物表達(dá)載體用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，BKI1基因在CaMV35S啟動(dòng)子的啟動(dòng)下過量表達(dá)，阻斷了油菜素甾醇的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對(duì)植物生長發(fā)育產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用，抑制了植物莖及主干的伸長，起矮化植株的作用。
【專利說明】含有蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKM的植
物表達(dá)載體的構(gòu)建
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及蘋果油菜素留醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKIl及其植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]油菜素甾醇(Brassinosteroids, BRs)是一種廣泛存在于植物中的類固醇激素,在植物的生長發(fā)育過程中起重要作用。調(diào)控了植物生長發(fā)育的各個(gè)過程，包括細(xì)胞的伸長、細(xì)胞的分裂、衰老、維管束的分化、雄性育性和光形態(tài)建成，以及對(duì)生物和非生物脅迫的抗性
坐寸o
[0003]油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑由多基因參與，其中，細(xì)胞膜上的BKIl蛋白是該信號(hào)途徑的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子，BKIl作為BRIl的底物，當(dāng)細(xì)胞中甾類分子濃度低時(shí)，BKIl于質(zhì)膜上和BRIl的同源二聚體相互作用，抑制BRII與BAKl的相互作用，對(duì)BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起到抑制作用。當(dāng)甾類分子與BRIl 的胞外域結(jié)合時(shí)，誘導(dǎo)BRIl的磷酸化，BKIl與BRIl分離，從而激活BR信號(hào)傳遞途徑，這與BR生物合成的反饋抑制相一致。過量表達(dá)BKII基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表現(xiàn)為株型矮化(Wang et al.，2006)。
[0004]蘋果是世界性果樹，其產(chǎn)量名列果品的前三名。我國是蘋果生產(chǎn)大國，栽培面積約2000萬畝，產(chǎn)量超過2985萬噸，面積和產(chǎn)量均居世界第一位。隨著蘋果產(chǎn)業(yè)的逐年擴(kuò)大和集約化生產(chǎn)的需要，培養(yǎng)矮化新品種是目前蘋果產(chǎn)業(yè)的育種目標(biāo)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種新的蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKIl(BRII kinase inhibitorl)。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供含有該蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKIl的植物表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)問題可通過如下技術(shù)方案解決:
[0008]蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKI1，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKIl的克隆方法如下:以蘋果幼嫩葉片為材料，利用CTAB法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計(jì)特定引物擴(kuò)增蘋果油菜素留醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKIl:
[0010]上游引物:5’ -ATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3 ’
[0011]下游引物:5’ -TCAAATCTCATGACTGACCA-3 ’
[0012]以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)，產(chǎn)物連接到pGM_T載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行 序列測定，得到序列如SEQ ID N0.1所示的蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKII。
[0013]上述的蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKI1，所述的蘋果為“寒富”蘋果。
[0014]含有蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKIl的植物表達(dá)載體的構(gòu)建，方法如下:
[0015]I)提取蘋果葉片中的總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；
[0016]2)以cDNA為模板，通過設(shè)計(jì)的特定引物，PCR擴(kuò)增得到上游和下游分別引入Nde I和EcoR I酶切位點(diǎn)的BKIl基因；
[0017]其中，所述的特定引物是:
[0018]上游引物P1: 5 ’ -CGCATATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3 ’ ；
[0019]下游引物P2:5 ’ -GGGAATTCTCAAATCTCATGACTGACCA-3 ’ ； [0020]3)將帶有酶切位點(diǎn)的BKIl基因，連接到克隆載體pGM-T上，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒PGM-BKIl ；
[0021]4)限制性內(nèi)切酶Nde I和EcoR I分別對(duì)提取的陽性質(zhì)粒pGM_BKIl和表達(dá)載體pRI IOlAN進(jìn)行雙酶切，將得到的BKII基因片段插入到表達(dá)載體pRI IOlAN中，構(gòu)建含有蘋果油菜素留醇途徑號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKIl的植物表達(dá)載體pOX-BKIl。
[0022]本發(fā)明的有益效果:
[0023]1.本發(fā)明構(gòu)建的含有蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKIl的植物表達(dá)載體，為首次報(bào)道，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得BKIl超表達(dá)新種質(zhì)。
[0024]2.本發(fā)明提供的蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKIl是一個(gè)新的蘋果油菜素甾醇負(fù)調(diào)控因子BKIl編碼基因，該基因?yàn)橛筒怂冂薮夹盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要成員之一。通過實(shí)驗(yàn)，將蘋果BKII基因轉(zhuǎn)入煙草中，使其在煙草中表達(dá)，至轉(zhuǎn)基因煙草植株開花后調(diào)查其株高，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草植株主干的伸長與對(duì)照相比，顯著受到了抑制；同樣，將蘋果BKIl基因轉(zhuǎn)入‘寒富’蘋果，使其在蘋果中超量表達(dá)，在大田培養(yǎng)4個(gè)月的轉(zhuǎn)基因蘋果與對(duì)照相比，表現(xiàn)顯著的矮化趨勢。說明超量表達(dá)蘋果BKIl基因起到了矮化植株的功能。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為植物表達(dá)載體pOX-BKIl構(gòu)建方法示意圖。
[0026]圖2為實(shí)施例1制備的蘋果BKIl基因的PCR擴(kuò)增電泳圖；
[0027]其中，M:1OObp Marker ；1, 2 =BKIl 基因；3:清水對(duì)照；。
[0028]圖3a為引入Nde I和EcoR I酶切位點(diǎn)的BKII基因的PCR擴(kuò)增電泳圖；
[0029]M: IOObp Ladder DNA marker ；1:BKI1 基因。
[0030]圖3b為pGM-BKIl質(zhì)粒經(jīng)Nde I和EcoR I雙酶切后的電泳檢測圖；
[0031]M:1OObp Ladder DNA marker ；2:從 pGM-BKIl 質(zhì)粒上酶切下來的 BKIl 基因。
[0032]圖3c為pOX-BKIl表達(dá)載體質(zhì)粒經(jīng)Nde I和EcoR I雙酶切后的電泳檢測圖；
[0033]M:IOObp Ladder DNA 11^^61';3:從口0)(-131(11表達(dá)載體質(zhì)粒上酶切下來的131(11基因。
[0034]圖4為轉(zhuǎn)基因煙草植株BKIl基因表達(dá)檢測的RT-PCR擴(kuò)增電泳圖；
[0035]M:IOObp Marker; 1:對(duì)照植株；2:轉(zhuǎn)基因植株。
【具體實(shí)施方式】[0036]實(shí)施例1:蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKIl編碼區(qū)序列的克隆
[0037]植物材料為“寒富”蘋果。
[0038]1.總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄成cDNA
[0039](I)取自然條件下正常生長的幼嫩葉片(0.05~0.lg)，在液氮中研碎，迅速移入
1.5ml離心管中；
[0040](2)加入600 u L預(yù)熱的2%CTAB提取緩沖液(預(yù)熱前加入0.4%P_巰基乙醇；40URNA酶抑制劑)，65°C保溫20~30min，期間顛倒幾次；
[0041](3)加入600 V- L氯仿/異戍醇(24:1),輕輕顛倒若干次，10000r/min離心IOmin ；
[0042](4)把上清液(約500ii L)移入新的1.5ml離心管，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒若干次，10000r/min離心IOmin ；
[0043](5)取上清液(約400 iiL)移入新的1.5mL離心管，加入1/4體積的IOM LiCL，顛倒混勻，—20°C放置 lh, 10000r/min 離心 IOmin ；
[0044](6)棄上清，加入400 ii L DEPC水溶解沉淀，14000r/min離心lOmin。棄沉淀，用等體積的氯仿/異戊醇抽提一次；
[0045](7)加入1/10體積的3M NaAc (pH5.2)，混勻后再加入2.5倍體積的冰冷的無水乙醇(_20°C ),顛倒混勻，-20°C放置 30min, 10000r/min 離心 IOmin ；
[0046](8)棄上清，加入IOOii L DEPC水，待沉淀溶解后，加入4 ii L RNase-free DNase I(5U.u L-1), BufferlOu L, IuL RNa`sin (40U ? y L—1)，輕輕混勻后在 37°C 水浴 4h ;
[0047](9)加入等體積的氯仿/異戍醇，輕輕顛倒若干次，10000r/min離心IOmin ；
[0048](10)取上清液(70 u L)加入1/10體積的3M NaAc (pH5.2),2.5倍體積冰冷的無水乙醇，顛倒幾次，混勻后—70°C放置lh, 10000r/min離心IOmin ；
[0049](11)棄上清，用70%乙醇洗滌RNA沉淀2次，在超凈工作臺(tái)上風(fēng)干RNA，加入30 ii LDEPC水溶解沉淀；
[0050](12)利用寶生物工程(大連)有限公司的PrimeScript? RT reagent Kit withgDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。
[0051]2.利用Primer Primer5.0軟件分析設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增BKIl
[0052]上游引物:5’ -ATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3 ’
[0053]下游引物:5’ -TCAAATCTCATGACTGACCA-3 ’
[0054]以提取的葉片cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)；
[0055]PCR 反應(yīng)體系為:取 I ii L cDNA加入 Taq DNA聚合酶 0.2 U L, IOXPCR Buffer2 U L,dNTPs (2.5mmol ? L—1) 1.6uL,正反向引物各I U L，最后用水補(bǔ)足到20 y L ;
[0056]PCR 反應(yīng)程序-MV 3min ；94°C 30s,60°C lmin，72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ；
[0057]PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測圖如圖2所示，從圖2可見一條1206bp的目的條帶。
[0058]使用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，回收后取I y L回收產(chǎn)物與PGM-T載體進(jìn)行連接，操作步驟按天跟公司產(chǎn)品pGM-T試劑盒說明書進(jìn)行。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，在表面涂有24 ii g -mr1異丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和40 u g 溴-4-氯-3-吲哚-P -D-半乳糖苷(X-gal)的含 Amp(60ii gLB 培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)12~16h。挑取單個(gè)白色克隆，分別涂布于新的含有Amp(60ii g -m^1)的LB培養(yǎng)基平板上(二轉(zhuǎn))，37°C培養(yǎng)12~16h，將菌株穿刺培養(yǎng)后，送上海生工公司測序，得到如SEQ ID N0:1所示的“寒富”蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKI1。
[0059]實(shí)施例2:植物表達(dá)載體pOX-BKI I的構(gòu)建
[0060]植物材料為“寒富”蘋果。
[0061]1.總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄成cDNA
[0062]方法同實(shí)施例1的步驟I。
[0063]2.PCR擴(kuò)增引入Nde I和EcoR I酶切位點(diǎn)
[0064]上游引物P1: 5 ’ -CGCATATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3，
[0065]下游引物P2:5 ’ -GGGAATTCTCAAATCTCATGACTGACCA-3 ’
[0066]以提取的葉片cDNA為模板，通過引物Pl和P2，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，在目的基因BKIl的上游和下游分別引入Nde I和EcoR I酶切位點(diǎn)，使用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。
[0067]回收后，取Iy L回收的PCR產(chǎn)物與pGM-T載體進(jìn)行連接，操作步驟按天根公司產(chǎn)品pGM-T試劑盒說明書進(jìn)行，然后轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒pGM-BKIl。
[0068]PCR 反應(yīng)體系:取 I U L cDNA 加入 Taq DNA 聚合酶 0.2 ii L，10 X PCR Buffer2 U L,dNTPs (2.5mmol ? L—1) 1.6uL,正反向引物各I U L，最后用水補(bǔ)足到20 y L ;
[0069]PCR 反應(yīng)程序:94°C 3min ；94°C 30s,60°C lmin，72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸IOmin0
[0070]PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳如圖3a所示，從圖3a可見一條1219bp的譜帶，回收，測序，測得序列比原BKIl基因1206bp (SEQ ID NO:1序列)，5’端增加CGCAT，3，端增加GGGAATTC，共增加13bp，說明在蘋果BKIl基因序列上游和下游分別引入Nde I和EcoR I酶切位點(diǎn)的。
[0071]3.植物表達(dá)載體pOX-BKIl的構(gòu)建
[0072]取載體pRI101AN(TaKaRa，Japan)和帶有酶切位點(diǎn)的陽性質(zhì)粒pGM-BKIl，用Nde I和 EcoR I 雙酶切，雙酶切體系(40ii L):10XT buffer4 u L, pGM-BKIl/pRI101AN34 u L,Nde I和EcoR I各I ii L ;37°C酶切過夜；取質(zhì)粒pGM-BKIl雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析如圖3b所示，從圖3b可見兩條譜，其中一條較小片段大小為1208bp，比原BKIl基因1206bp (SEQ ID勵(lì):1序列)5’端增加！'，3’端增加6，共增加26?，說明雙酶切反應(yīng)成功，證明含有Nde I和EcoR I酶切位點(diǎn)質(zhì)粒pGM-BKIl構(gòu)建成功。
[0073]用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收pRIlOlAN較大片段和pGM_BKIl較小片段。用T4DNA連接酶(NEB)連接兩個(gè)回收產(chǎn)物，連接反應(yīng)體系(10 y L): 10 X Ligase Bufferl u L,pRIlOlAN 大片段 liiL，pGM-BKIl 小片段 7.5 y L，T4DNA 連接酶 0.5 y L。16°C反應(yīng)過夜，將BKIl基因片段插入pRIIOlAN中，得到重組質(zhì)粒植物表達(dá)載體pOX-BKIl。
[0074]取IOii L重組質(zhì)粒植物表達(dá)載體pOX-BKIl轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞。37°C培養(yǎng)12~16h，挑取陽性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切，瓊脂糖凝膠電泳如圖3c所示，從圖3c可見，兩條譜帶，其中一條較小片段大小為1208bp，說明雙酶切反應(yīng)成功，初步證明蘋果BKIl基因表達(dá)載體構(gòu)建成功。
[0075]將1208bp的酶切片段回收，回收產(chǎn)物與pGM-T載體進(jìn)行連接，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，送上海生工測序， 測得含有序列SEQ ID NO:1所示的蘋果油菜素留醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控BKII基因，所以近一步證明蘋果BKIl基因表達(dá)載體構(gòu)建成功。
[0076]實(shí)施例3:植物表達(dá)載體pOX-BKIl遺傳轉(zhuǎn)化煙草及其基因功能初步鑒定
[0077]1.農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)制備及凍融法轉(zhuǎn)化[0078]將凍存的農(nóng)桿菌EHA105菌液在含有50mg七1利福平(Rif)的YEP (pH=7.0)固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28°C倒置培養(yǎng)48h，出現(xiàn)菌斑一挑取農(nóng)桿菌EHA105單菌落接種于含有50mg ?r'Rif的YEP (pH=7.0)液體培養(yǎng)基中，28°C，200rpm/min振蕩培養(yǎng)過夜(約16h)—取上述菌液按1:50比例接種于50mL含有50mg -L^1Rif的YEP (pH=7.0)液體培養(yǎng)基中，28°C，150rpm/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0.5左右一取1.5mL搖好的菌液，冰上冷卻IOmin — 4°C,5000rpm/min離心5min,棄上清液液,收集菌體一加入等體積冰預(yù)冷的25mM CaCl2溶液重懸沉淀，冰上放置20min — 4°C, 5000rpm/min離心5min,棄上清液一每管加入50 y L預(yù)冷的25mM CaCl2溶液重懸沉淀，冰上放置20min后使用。剩余的感受態(tài)細(xì)胞在液氮中速凍后于_80°C超低溫冰箱中保存。
[0079]2.將pOX-BKIl質(zhì)粒DNA迅速加入制備好的50iiL農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中(約IOii L)，輕混，冰浴5min后于液氮中速凍lmin，37°C水浴5min，再迅速冰浴2min，然后加入800 u L YEP (pH=7.0)液體培養(yǎng)基，28°C，160rpm/min震蕩培養(yǎng)，4_6h后離心后剩約100 y L菌液涂布于含50mg.L-1Rif和50mg.L-1Kan的YEP (pH=7.0)固體培養(yǎng)基中，28°C倒置培養(yǎng)48h，挑取單克隆檢測，選取陽性克隆搖菌，用于煙草葉片轉(zhuǎn)化。
[0080]3.挑取已活化的含pOX-BKIl質(zhì)粒的EHA105農(nóng)桿菌單菌落。在添加了 50mg.L4Kan和IOOmg ? L4Rif的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C條件下200rpm/min振蕩培養(yǎng)，直至OD6tltl值達(dá)到0.8。然后將ImL的菌液移入到新的YEP液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)28°C 200rpm/min振蕩培養(yǎng)，直至OD6tltl為0.5。然后在25°C條件下，5000rpm/min離心5min收集菌體后，用等量MS液體
培養(yǎng)基重懸備用。
[0081]4.將在三角瓶內(nèi)繼代生長30天的組織培養(yǎng)苗的葉片剪成0.5cmX0.5cm的大小，置于步驟2中重懸好的菌液中，輕輕搖晃IOmin后取出，用無菌的干濾紙吸干葉塊上多余的農(nóng)桿菌菌液，然后置于再生培養(yǎng)基上。在黑暗條件下培養(yǎng)2-5d后，將煙草‘NC89’葉塊轉(zhuǎn)移到加入250mg ^r1Cef和IOOmg ^r1Kan的再生培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性芽篩選。在抗性芽再生出后，將抗性芽轉(zhuǎn)移到新的附加250mg -T1CefUOOmg-T1Kan的增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，至得到純合轉(zhuǎn)化植株。
[0082]5.PCR鑒定及基因功能初步鑒定:
[0083]待抗性苗長至7~8片葉，提取煙草‘NC89’轉(zhuǎn)基因植株幼嫩葉片RNA，進(jìn)行RT-PCR檢測目的基因是否轉(zhuǎn)入
[0084]上游引物:5’ -ATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3，，
[0085]下游引物:5’ -TCAAATCTCATGACTGACCA-3 ’，
[0086]結(jié)果如圖4所示，從圖4可見，轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)了 1206bp片段，而對(duì)照植株沒有，說明蘋果BKIl基因成功導(dǎo)入煙草中。
[0087]6.對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草表型觀察
[0088]非轉(zhuǎn)基因的煙草‘NC89’組織培養(yǎng)植株(4株)設(shè)為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)入含有蘋果BKIl的植物表達(dá)載體pOX-BKIl的煙草‘NC89’組織培養(yǎng)植株(10株)設(shè)為試驗(yàn)組，將兩組組織培養(yǎng)植株同時(shí)移栽致大田，在相同栽培條件下，培養(yǎng)3個(gè)月，待全部植株開花后,分別測量各組煙草的株高?？瞻讓?duì)照組平均株高為71.5cm，試驗(yàn)組平均株高為48.2cm?？梢姡D(zhuǎn)入蘋果BKIl基因的煙草株高有所減少，表現(xiàn)為矮生的現(xiàn)象，說明BKIl基因的表達(dá)影響了煙草的發(fā)育，即表達(dá)蘋果BKII基因的煙草植株表現(xiàn)矮化，進(jìn)一步說明蘋果BKIl基因負(fù)調(diào)控?zé)煵葜?br> 高表型。
[0089]實(shí)施例4:植物表達(dá)載體pOX-BKI I遺傳轉(zhuǎn)化蘋果表型觀察
[0090]參照實(shí)施例3的方法，將植物表達(dá)載體pOX-BKIl轉(zhuǎn)入‘寒富’蘋果，將非轉(zhuǎn)基因的‘寒富’蘋果組織培養(yǎng)植株(5株)設(shè)為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)入含有蘋果BKIl的植物表達(dá)載體POX-BKIl的‘寒富’蘋果組織培養(yǎng)植株(12株)設(shè)為試驗(yàn)組，將兩組組織培養(yǎng)植株同時(shí)移栽致大田，在相同栽培條件下，培養(yǎng)4個(gè)月，分別測量各組蘋果的株高。空白對(duì)照組平均株高為36.7cm，試驗(yàn)組平均株高為18.9cm?？梢姡D(zhuǎn)入蘋果BKIl基因的蘋果株高有所減少，表現(xiàn)為矮生的現(xiàn)象，說明BKIl基因的超量表達(dá)影響了蘋果的發(fā)育，即超量表達(dá)蘋果BKIl基因的蘋果植株表現(xiàn)矮化，進(jìn)一步說明蘋果`BKIl基因負(fù)調(diào)控蘋果株高表型。
【權(quán)利要求】
1.含有蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKIl的植物表達(dá)載體的構(gòu)建，其特征在于方法如下: 1)提取蘋果葉片中的總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA； 2)以cDNA為模板，通過設(shè)計(jì)的特定引物，PCR擴(kuò)增得到上游和下游分別引入NdeI和EcoR I酶切位點(diǎn)的BKIl基因； 其中，所述的特定引物是:
上游引物 P1: 5 ’ -CGCATATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3，；
下游引物 P2:5’ -GGGAATTCTCAAATCTCATGACTGACCA-3?； 3)將帶有酶切位點(diǎn)的BKII基因，連接到克隆載體pGM-T上，轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒pGM-BKIl ； 4)限制性內(nèi)切酶NdeI和EcoR I分別對(duì)陽性質(zhì)粒pGM_BKIl和表達(dá)載體pRIlOlAN進(jìn)行雙酶切，將得到的BKIl基因片段插入到表達(dá)載體pRIlOlAN中，構(gòu)建含有蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKIl的植物表達(dá)載體pOX-BKIl。
2.如權(quán)利要求1所述的含有蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKIl的植物表達(dá)載體的構(gòu)建，其特征在于:所述的蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKIl的DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的含有蘋果油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控基因BKIl的植物表達(dá)載體的構(gòu)建，其特征在于:所述的蘋果為“寒富”蘋果。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK103642833SQ201310670789
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月7日
【發(fā)明者】馬躍, 何平, 張志宏, 李林光, 王豐, 張蕾, 代紅艷, 李賀, 劉月學(xué) 申請(qǐng)人:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)