一種紅酵母的破壁方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種紅酵母的破壁方法，包括：不同濃度梯度鹽酸的配制，酸熱法處理紅酵母，有機溶劑提取色素及破壁效果比較。本發(fā)明提供的紅酵母破壁方法使用的鹽酸濃度低，破壁時間短，效率高，類胡蘿卜素的提取率較其他濃度酸處理提高近40%，且能耗低，工藝簡單，對設備要求低，低濃度的鹽酸處理減少了類胡蘿卜素的污染，該方法具有很強的實用價值和開發(fā)前景。有利于提高紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的產(chǎn)量、質(zhì)量和降低生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種紅酵母的破壁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及一種紅酵母的破壁方法，利用酸熱法對紅酵母細胞進行破壁，從而達到提取胞內(nèi)色素的目的。
【背景技術(shù)】
[0002]類胡蘿卜素是一種廣泛存在于植物和微生物中的天然色素。除具有轉(zhuǎn)化為維生素A的生物活性外，還具有預防癌癥和心血管疾病等多種生理功能。紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素具有營養(yǎng)要求簡單、生長周期短及菌體營養(yǎng)豐富等優(yōu)點，具有很大的實用價值和開發(fā)前景。但類胡蘿卜素是紅酵母細胞內(nèi)產(chǎn)物，破壁效果及提取方法直接影響紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的產(chǎn)量、質(zhì)量和生產(chǎn)成本。因此，研究紅酵母破壁及提取方法具有重要的現(xiàn)實意義。
[0003]紅酵母屬于單細胞真核微生物，其細胞壁的厚度大約為0.1~0.3 μ m，當細胞老化時，厚度還會增加。紅酵母細胞壁結(jié)構(gòu)堅韌，像三明治——外層為甘露聚糖，內(nèi)層為葡聚糖，它們都是復雜的分枝狀聚合物，中間夾有1層蛋白質(zhì)分子。目前報道的關(guān)于紅酵母的破壁方法有很多，常用的紅酵母破壁方法有高壓均質(zhì)法、研磨法、酸法、酶法、堿法、自溶法、甲苯法、二甲亞砜法、超聲波法等。酶法及自溶法由于破壁時間較長(4~24h)，可能造成類胡蘿卜素的降解。堿法破壁容易使類胡蘿卜素變性，造成提取率偏低。高壓均質(zhì)及研磨法存在破壁效率低(不高于80%)、溫度不易控制、類胡蘿卜素易氧化等局限性。雖然二甲亞砜、甲苯法及超聲波法能取得良好的破壁效果，但這兩種有機溶劑非常容易產(chǎn)生殘留毒性，所提取出的類胡蘿卜素不能作為食品及藥品原料使用。超聲波破碎法對設備要求高，成本相對較高。因此相對于以上幾類方法，酸法破壁雖然在一定程度上會引起類胡蘿卜素的降解，但該法破壁效果好，如能控制好破壁條件，就有可能開發(fā)出一種破壁效果良好、類胡蘿卜素損失較少、安全、衛(wèi)生的破壁方法。
[0004]由于酸熱法使用了對細胞壁中原來結(jié)構(gòu)緊密的某些成分(多糖和蛋白質(zhì)等)具有強力疏松作用的鹽酸，并配合沸水`浴處理及速冷處理，使細胞壁結(jié)構(gòu)得以破壞，胞內(nèi)物質(zhì)溶出。該法設備簡單、能耗小、成本低，對胞內(nèi)溶出物破壞性也較小，是值得進一步深入探討的方法。然而目前國內(nèi)外學者多采用3mol/L鹽酸，浸泡40min進行破壁，此法經(jīng)常出現(xiàn)菌體破壁過頭的現(xiàn)象，離心時往往會產(chǎn)生懸浮，需加入大量水進行稀釋方可離心，但有時加水稀釋也不能達到離心效果，反而導致提取率下降。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種紅酵母的破壁方法，對現(xiàn)行的酸熱破壁技術(shù)中存在的鹽酸濃度高，用量大，耗時長，色素提取率低等問題，采用低濃度的鹽酸加熱處理紅酵母達到了破壁的目的，且色素提取率提高了 40%。
[0006]一種紅酵母的破壁方法，該方法包括:不同濃度梯度鹽酸的配制，酸熱法處理紅酵母，有機溶劑提取色素及破壁效果比較。本發(fā)明解決了高濃度的鹽酸處理后，破壁后的細胞碎片在離心體系中無法沉淀的技術(shù)問題，同時采用低濃度的鹽酸破壁也不會影響類胡蘿卜素的提取。
[0007]具體技術(shù)方案如下:
[0008]一種紅酵母的破壁方法，包括如下步驟:
[0009](1)配制不同濃度梯度的鹽酸；
[0010](2)酸熱法處理紅酵母:
[0011](2-1)紅酵母的發(fā)酵培養(yǎng)；
[0012](2-2)不同濃度鹽酸處理紅酵母；
[0013](3)破壁效果比較:
[0014](3-1)恒質(zhì)量法測定酵母細胞生物量；
[0015](3-2)類胡蘿卜素提取與測定。
[0016]步驟(1)進一步包括如下步驟:
[0017]( 1-1)取一定量的濃鹽酸加蒸餾水稀釋至相關(guān)濃度梯度；
[0018](1-2)確定鹽酸濃度梯度分別為 lmol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L。
[0019]進一步地，步驟(1)中鹽酸試劑為分析純AR，物質(zhì)量濃度為12mol/L。
[0020]進一步地，步驟(2-1)中進一步包括如下步驟:
[0021]將保藏的紅酵母菌種移接到PDA培養(yǎng)基上，在28°C下活化48h ；
[0022]挑2環(huán)接入裝有50mL的液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C振蕩培養(yǎng)24h ；
[0023]按10%的接種量接入裝有80mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于28°C下振蕩(180r / min)培養(yǎng) 72h。
[0024]進一步地，步驟(2-2)中進一步包括如下步驟:
[0025]取六只離心管,分別加入10mL上述發(fā)酵液,4000r/min離心lOmin ；
[0026]倒去上清液,各加入l-6mol/L的鹽酸6ml浸泡40min ；
[0027]于沸水浴中加熱4_5min，迅速冷卻離心，洗滌沉淀部分；
[0028]棄去上清液，即得細胞碎片。
[0029]進一步地，步驟⑵中六只離心管中加入6mLlmol/L的鹽酸，浸泡時間分別設置為10min、20min、30min、40min、50min、60mino
[0030]進一步地，步驟(3-1)中進一步包括如下步驟:
[0031]取10mL發(fā)酵液于離心管中，4000r/min離心lOmin ；
[0032]倒掉上清液，用蒸餾水洗滌2次；
[0033]用蒸餾水將菌體移入預先干燥至恒質(zhì)量M0的稱量瓶中，置90°C電熱恒溫干燥箱中，干燥至恒質(zhì)量；
[0034]用精密電子天平稱量稱量瓶與菌體總質(zhì)量M0
[0035]進一步地，步驟(3-2)中進一步包括如下步驟:
[0036]不同處理方法得到的細胞碎片中加入10mL丙酮；
[0037]在室溫下振蕩浸泡lh提取類胡蘿卜素；
[0038]在轉(zhuǎn)速4000r/min離心15min，得到上清液即為類胡蘿卜素提取液；
[0039]如殘留的細胞碎片中仍有色素，加丙酮進一步提取，合并上清液；
[0040]將浸提液適當稀釋后，用756型分光光度計在波長475nm下測定吸光度值。
[0041]進一步地，[0042]細胞生物量公式為:
【權(quán)利要求】
1.一種紅酵母的破壁方法，其特征在于，包括如下步驟:(1)配制不同濃度梯度的鹽酸；(2)酸熱法處理紅酵母:(2-1)紅酵母的發(fā)酵培養(yǎng)；(2-2)不同濃度鹽酸處理紅酵母；(3)破壁效果比較: (3-1)恒質(zhì)量法測定酵母細胞生物量；(3-2)類胡蘿卜素提取與測定。
2.如權(quán)利要求1所述的紅酵母的破壁方法，其特征在于，步驟(1)進一步包括如下步驟:(1-1)取一定量的濃鹽酸加蒸餾水稀釋至相關(guān)濃度梯度；(1-2)確定鹽酸濃度梯度分別為 lmol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L。
3.如權(quán)利要求1或2所述的紅酵母的破壁方法，其特征在于，步驟(1)中鹽酸試劑為分析純AR，物質(zhì)量濃度為12mol/L。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的紅酵母的破壁方法，其特征在于，步驟(2-1)中進一步包括如下步驟:將保藏的紅酵母菌種移接到PDA培養(yǎng)基上，在28°C下活化48h ；挑2環(huán)接入裝有50mL的液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C振蕩培養(yǎng)24h ；按10%的接種量接入裝有80mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于28°C下振蕩(180r /min)培養(yǎng) 72h。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的紅酵母的破壁方法，其特征在于，步驟(2-2)中進一步包括如下步驟:取六只離心管，分別加入10mL上述發(fā)酵液,4000r/min離心lOmin ；倒去上清液，各加入l_6mol/L的鹽酸6mL浸泡40min ；于沸水浴中加熱4-5min，迅速冷卻離心，洗滌沉淀部分；棄去上清液，即得細胞碎片。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的紅酵母的破壁方法，其特征在于，步驟(2)中六只離心管中加入6mLlmol/L的鹽酸,浸泡時間分別設置為10min、20min、30min、40min、50min、60mino
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的紅酵母的破壁方法，其特征在于，步驟(3-1)中進一步包括如下步驟:取10mT,發(fā)酵液于離心管中，4000r/min離心lOmin ；倒掉上清液，用蒸餾水洗滌2次；用蒸餾水將菌體移入預先干燥至恒質(zhì)量M0的稱量瓶中，置90°C電熱恒溫干燥箱中，干燥至恒質(zhì)量；用精密電子天平稱量稱量瓶與菌體總質(zhì)量M。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的紅酵母的破壁方法，其特征在于，步驟(3-2)中進一步包括如下步驟:不同處理方法得到的細胞碎片中加入10mL丙酮；在室溫下振蕩浸泡lh提取類胡蘿卜素；在轉(zhuǎn)速4000r/min離心15min，得到上清液即為類胡蘿卜素提取液；如殘留的細胞碎片中仍有色素，加丙酮進一步提取，合并上清液；將浸提液適當稀釋后，用756型分光光度計在波長475nm下測定吸光度值。
9.如權(quán)利要求7所述的紅酵母的破壁方法，其特征在于，
10.如權(quán)利要求8所述的紅酵母的破壁方法，其特征在于，類胡蘿卜素產(chǎn)率計算公式為:
【文檔編號】C12R1/645GK103642693SQ201310675002
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】高娜, 馬雪, 李瑞萍 申請人:安徽師范大學