一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體、制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體及其制備方法，所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體為精氨酸短肽改性的殼聚糖，所述精氨酸短肽的一端通過酰胺鍵與所述殼聚糖相連。所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體的制備方法包括如下步驟：取精氨酸短肽；將所述精氨酸短肽與殼聚糖發(fā)生酰胺化反應，獲得所述精氨酸短肽改性的殼聚糖即非病毒轉(zhuǎn)基因載體。本發(fā)明還提供了所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體在基因轉(zhuǎn)染中的應用。所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體含有具有穿膜效果的精氨酸短肽單元，能夠和細胞膜作用而促進其所攜帶藥物或載體進入細胞，發(fā)揮后續(xù)功能，同時表現(xiàn)出良好的生物相容性和較高的轉(zhuǎn)染效率，是一種低毒有效的非病毒基因載體，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體、制備方法及其應用【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料【技術領域】，具體涉及一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]基因治療通過將目的基因?qū)氲桨屑毎藘?nèi)以修復或置換導致疾病的缺陷基因，為先天和后天的基因缺陷疾病提供了新的治療方法，尋求合適的轉(zhuǎn)基因載體將目的基因?qū)氲桨屑毎麅?nèi)無疑成為基因治療成功與否的關鍵所在。
[0003]目前，轉(zhuǎn)基因載體主要有非病毒載體，非病毒載體主要包括殼聚糖、脂質(zhì)體、聚乙烯亞胺(PEI)和樹枝狀高聚物(Dendrimer)等，這些非病毒載體通過靜電作用與DNA復合形成納米微球進行基因轉(zhuǎn)染。其中，殼聚糖(Chitosan)作為唯一的天然陽離子多糖，具有良好的生物相容性、低細胞毒性和可降解性等優(yōu)點，因而廣泛地應用于非病毒轉(zhuǎn)基因載體。但殼聚糖作為非病毒轉(zhuǎn)基因載體時轉(zhuǎn)染效率較低，成為制約其在實際臨床應用中的瓶頸，因此，如何提高非病毒轉(zhuǎn)基因載體的轉(zhuǎn)染效率成為研究重點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述問題，本發(fā)明第一方面旨在提供一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體，該非病毒轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)染效率良好；本發(fā)明第二方面旨在提供一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體的制備方法，該制備方法簡單，制備的非病毒轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)染效率良好；本發(fā)明第三方面旨在提供一種用于基因治療的 納米復合物，該納米復合物的轉(zhuǎn)染效率良好；本發(fā)明第四方面旨在提供一種用于基因治療的納米復合物的制備方法，該納米復合物的制備方法簡單，制備得到的用于基因治療的納米復合物細胞轉(zhuǎn)染效率良好。
[0005]第一方面本發(fā)明提供了一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體，所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體為精氨酸短肽改性的殼聚糖，所述精氨酸短肽的一端通過酰胺鍵與所述殼聚糖相連。
[0006]優(yōu)選地，所述精氨酸短肽為2~19個精氨酸脫水縮合得到。
[0007]優(yōu)選地，所述殼聚糖的分子量為5kDa~lOOkDa。
[0008]現(xiàn)有技術中，精氨酸短肽是一種穿膜肽，在生理條件下精氨酸短肽帶有大量的正電荷，能夠快速與帶負電荷的細胞膜上的磷脂分子作用，啟動細胞膜外物質(zhì)的跨膜傳輸，從而將細胞膜外物質(zhì)導入細胞內(nèi)，且不損傷細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，具有較強的細胞膜穿透能力，轉(zhuǎn)運效率高。因此被廣泛用于傳遞各種蛋白、大分子和納米粒子進入細胞。
[0009]本發(fā)明提供了一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體，所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體為精氨酸短肽改性的殼聚糖，所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體上的精氨酸短肽單元可以與細胞膜上的磷脂分子相互作用，而促進所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體進入細胞質(zhì)，轉(zhuǎn)染效率高。
[0010]第二方面本發(fā)明提供了一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體的制備方法，包括以下步驟:
[0011](I)提供精氨酸短肽；將所述精氨酸短肽和活化劑溶解于緩沖液中得到精氨酸短肽溶液；[0012](2)將殼聚糖溶解后得到殼聚糖溶液，將所述殼聚糖溶液滴加到所述精氨酸短肽溶液中，得到混合溶液，攪拌反應I~6天，所述混合溶液中的氨酸短肽和殼聚糖發(fā)生酰胺化反應，得到產(chǎn)物，將所述產(chǎn)物分離純化后進行冷凍干燥，得到所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體；所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體為精氨酸短肽改性的殼聚糖，所述精氨酸短肽的一端通過酰胺鍵與所述殼聚糖相連。
[0013]優(yōu)選地，步驟(1)中所述精氨酸短肽為2~19個精氨酸脫水縮合得到。
[0014]優(yōu)選地，步驟(1)中所述活化劑為1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥基丁二酰亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺鈉鹽中的至少一種。
[0015]優(yōu)選地，步驟(2)中所述殼聚糖的分子量為5kDa~lOOkDa。
[0016]優(yōu)選地，所述精氨酸短肽和所述殼聚糖的摩爾比為1:1~1:20。
[0017]所述殼聚糖和精氨酸短肽通過酰胺化反應一步合成所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體，制備方法簡單，原料廉價易得，制得的非病毒轉(zhuǎn)基因載體中的精氨酸短肽單元能與細胞膜上的磷脂分子相互作用，而促進所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體進入細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高。
[0018]第三方面，本發(fā)明提供了一種用于基因治療的納米復合物，所述納米復合物為質(zhì)粒DNA和上述所述的非病毒轉(zhuǎn)基因載體通過靜電作用形成的納米微球。
[0019]所述精氨酸短肽和殼聚糖發(fā)生酰胺化反應，將具有穿膜作用的精氨酸短肽連接到殼聚糖上，得到具有穿膜效果的非病毒轉(zhuǎn)基因載體，所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體能夠有效復合DNA形成納米復合物，所述納米復合物上的精氨酸短肽單元能與細胞膜上的磷脂分子相互作用，促進納米復合物進入細胞內(nèi)，實現(xiàn)了目的基因的投遞，有利于目的基因后續(xù)的表達。
[0020]第四方面，本發(fā)明提供了一種用于基因治療的納米復合物的制備方法，包括以下步驟:
[0021]將質(zhì)粒DNA和上述所述的非`病毒轉(zhuǎn)基因載體溶解于滅菌純水后，得到混合液，然后室溫靜置，所述混合液中的非病毒轉(zhuǎn)基因載體和質(zhì)粒DNA通過靜電作用形成納米微球，得到所述納米復合物。
[0022]所述精氨酸短肽和殼聚糖發(fā)生酰胺化反應，將具有穿膜作用的精氨酸短肽連接到殼聚糖上，得到具有穿膜效果的非病毒轉(zhuǎn)基因載體，所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體能夠有效復合DNA形成納米復合物，所述納米復合物上的精氨酸短肽單元能與細胞膜上的磷脂分子相互作用，促進所述納米復合物進入細胞質(zhì)，實現(xiàn)了目的基因的投遞，有利于目的基因后續(xù)的表達。該制備方法簡單，條件溫和，具有廣闊的應用前景。
[0023]綜上，本發(fā)明有益效果包括以下幾個方面:
[0024](I)本發(fā)明提供的非病毒轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)染效率高；
[0025](2)本發(fā)明提供的非病毒轉(zhuǎn)基因載體制備方法簡單，原料廉價易得；
[0026](3)本發(fā)明提供的納米復合物轉(zhuǎn)染效率高，有利于納米復合物中目的基因的表達，所述納米復合物的制備方法簡單。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1是本發(fā)明實施例1和實施例2制備的非病毒轉(zhuǎn)基因載體的核磁譜圖；
[0028]圖2是本發(fā)明實施例1和實施例2制備的非病毒轉(zhuǎn)基因載體的細胞存活率柱狀圖；[0029]圖3是本發(fā)明實施例1和實施例2制備的非病毒轉(zhuǎn)基因載體的轉(zhuǎn)染效率柱狀圖?！揪唧w實施方式】
[0030]以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍。
[0031]第一方面本發(fā)明提供了一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體，所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體為精氨酸短肽改性的殼聚糖，所述精氨酸短肽的一端通過酰胺鍵與所述殼聚糖相連。
[0032]優(yōu)選地，所述精氨酸短肽為2~19個精氨酸脫水縮合得到。
[0033]所述精氨酸短肽的氨基需要保護，優(yōu)選地，所述精氨酸短肽的氨基端通過乙?；Ｗo。
[0034]更優(yōu)選地，所述氨基端為乙酰基保護的精氨酸短肽的分子量為372Da~3062Da。
[0035]進一步優(yōu)選地，所述精氨酸短肽為8個精氨酸脫水縮合得到。
[0036]所述精氨酸短肽通過現(xiàn)有技術制備或購買得到。優(yōu)選地，氨基保護的精氨酸短肽可通過Fmoc固相法聚合或其他方法制備。
[0037]優(yōu)選地，所述殼聚糖的分子量為5kDa~lOOkDa。
[0038]優(yōu)選地，所述殼聚糖的脫乙酰度大于90%。
[0039]例如:用氨基端 通過乙?；Ｗo的精氨酸短肽改性殼聚糖，得到的非病毒轉(zhuǎn)基因載體的化學結(jié)構(gòu)式如式I所示。
【權(quán)利要求】
1.一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體，其特征在于，所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體為精氨酸短肽改性的殼聚糖，所述精氨酸短肽的一端通過酰胺鍵與所述殼聚糖相連。
2.如權(quán)利要求1所述的非病毒轉(zhuǎn)基因載體，其特征在于，所述精氨酸短肽為2~19個精氨酸脫水縮合得到。
3.如權(quán)利要求1所述的非病毒轉(zhuǎn)基因載體，其特征在于，所述殼聚糖的分子量為5kDa ~lOOkDa。
4.一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)提供精氨酸短肽；將所述精氨酸短肽和活化劑溶解于緩沖液中得到精氨酸短肽溶液； (2)將殼聚糖溶解后得到殼聚糖溶液，將所述殼聚糖溶液滴加到所述精氨酸短肽溶液中，得到混合溶液，攪拌反應I~6天，所述混合溶液中的氨酸短肽和殼聚糖發(fā)生酰胺化反應，得到產(chǎn)物，將所述產(chǎn)物分離純化后進行冷凍干燥，得到所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體；所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體為精氨酸短肽改性的殼聚糖，所述精氨酸短肽的一端通過酰胺鍵與所述殼聚糖相連。
5.如權(quán)利要求4所述的非病毒轉(zhuǎn)基因載體的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述精氨酸短肽為2~19個精氨酸脫水縮合得到。
6.如權(quán)利要求4所述的非病毒轉(zhuǎn)基因載體的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述活化劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥基丁二酰亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺鈉鹽中的至少一種。
7.如權(quán)利 要求4所述的非病毒轉(zhuǎn)基因載體的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述殼聚糖的分子量為5kDa~lOOkDa。
8.如權(quán)利要求4所述的非病毒轉(zhuǎn)基因載體的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述精氨酸短肽和所述殼聚糖的摩爾比為1:1~1:20。
9.一種用于基因治療的納米復合物，其特征在于，所述納米復合物為質(zhì)粒DNA和權(quán)利要求I所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體通過靜電作用形成的納米微球。
10.一種用于基因治療的納米復合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 將質(zhì)粒DNA和權(quán)利要求1所述的非病毒轉(zhuǎn)基因載體溶解于滅菌純水后，得到混合液，然后室溫靜置，所述混合液中的非病毒轉(zhuǎn)基因載體和質(zhì)粒DNA通過靜電作用形成納米微球，得到所述納米復合物。
【文檔編號】C12N15/85GK103710383SQ201310676481
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】趙曉麗, 呂維加 申請人:深圳先進技術研究院