一種粉葛同步酶處理發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明選用粉葛作為原料，利用酶的同步處理達(dá)到快速發(fā)酵生產(chǎn)丁醇并提高丁醇濃度的目的。本發(fā)明所述的一種粉葛原料同步酶處理發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其特點(diǎn)在于酶處理與發(fā)酵同步進(jìn)行，簡(jiǎn)單方便，易操作，無(wú)污染物產(chǎn)生，丁醇產(chǎn)量高。發(fā)酵結(jié)束后醪液中丁醇產(chǎn)量最高可達(dá)到16.91g/L，丁醇產(chǎn)量得到顯著提高，較未添加酶組提高21%以上。
【專利說(shuō)明】一種粉葛同步酶處理發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種酶處理粉葛原料發(fā)酵生產(chǎn)丁醇并提高丁醇產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著社會(huì)的發(fā)展，作為不可再生能源的石化能源日益枯竭，生物質(zhì)能源等可再生能源得到越來(lái)越多的關(guān)注。生物質(zhì)以農(nóng)林資源、有機(jī)廢棄物等各種形式存在，可將其通過(guò)各種方式轉(zhuǎn)變?yōu)樯镔|(zhì)能源。
[0003]丁醇作為生物質(zhì)能源的一種，與燃料乙醇相比，它具有更高的燃值和疏水性，較低的揮發(fā)性，可與汽油以任意比例混合。丁醇的生產(chǎn)主要由丙酮丁醇梭菌進(jìn)行丙酮丁醇發(fā)酵(Acetone-Butanol-Ethanol fermentation, ABE),其主要產(chǎn)物為丙酮、丁醇和乙醇，比例為3:6:1。為節(jié)約原料成本，秸桿等農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)燃料丁醇的研究得到了較大的關(guān)注。但是，作物秸桿等木質(zhì)纖維資源分解困難，導(dǎo)致溶劑產(chǎn)量偏低。這時(shí)，能在邊際土地生長(zhǎng)的非糧植物粉葛進(jìn)入視野。
[0004]葛屬(Pueraria DC)為豆科植物，在全世界有20個(gè)種，11個(gè)種位于中國(guó)。其中野葛(Pueraria lobata(Willd)Ohwi)和甘葛藤(Pueraria thomsonii Benth.)的分布最廣，產(chǎn)量最高。據(jù)《中國(guó)藥典》記載，粉葛為甘葛藤的干燥根，當(dāng)其中葛根素含量大于0.3%時(shí)方可入藥。作為多年生藤本植物的塊莖，利用粉葛生產(chǎn)丁醇具有以下優(yōu)勢(shì):1.粉葛原料中含有葛根素等高附加值的異黃酮物質(zhì)，使其與木薯相比更具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值。這些異黃酮類物質(zhì)，可以預(yù)防和治療高血壓、高血脂、冠心病、心絞痛、糖尿病等疾病。2.分布廣泛。在我國(guó)，除新疆、西藏、青海等少數(shù)地區(qū)未見有其生長(zhǎng)。而且，在我國(guó)川渝、兩廣、兩湖、江西等地已有規(guī)?；N植。3.淀粉含量高，其淀粉含量占干重的60~70%，在生產(chǎn)燃料乙醇時(shí)，其土地畝產(chǎn)乙醇量比玉米和木薯均高。4.氮元素含量高于木薯，更利于微生物利用。因此，粉葛不但可以藥用，還是一種極具潛力的丁醇生產(chǎn)原料。開發(fā)粉葛原料作為丁醇生產(chǎn)的原料，能在改善能源生產(chǎn)消費(fèi)結(jié)構(gòu)，環(huán)境保護(hù)，社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展等方面有重要意義。
[0005]ABE發(fā)酵產(chǎn)物丁醇對(duì)生產(chǎn)菌株產(chǎn)生抑制。有研究表明，當(dāng)丁醇濃度達(dá)llg/L時(shí)，菌體受到嚴(yán)重抑制。當(dāng)丁醇濃度進(jìn)一步到達(dá)15g/L時(shí)，菌體將不再生長(zhǎng)。因此，許多研究者嘗試通過(guò)菌種改造提高發(fā)酵醪中的丁醇濃度。Chen等利用經(jīng)過(guò)化學(xué)誘變而得到的拜氏梭菌BAlOl (Clostridium bei jerinckii BAlOl)進(jìn)行丁醇發(fā)酵,最終丁醇產(chǎn)量為 20.9g/L,是目前報(bào)道的批次發(fā)酵中溶劑產(chǎn)量最高的菌株。但是，菌種改造始終面臨遺傳不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，難以進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵工藝，利用酶處理同步發(fā)酵粉葛原料進(jìn)行丁醇生產(chǎn)得到了較高的丁醇產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明選用粉葛作為原料，利用酶的同步處理達(dá)到快速發(fā)酵生產(chǎn)丁醇并提高丁醇濃度的目的。[0007]本發(fā)明提供一種同步酶處理發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，該方法包括如下步驟:
[0008]( I)將新鮮粉葛采收切塊后，直接粉碎得粉葛漿，或烘干粉碎得粉葛干粉；
[0009](2)將步驟(1)得到的粉葛漿與水按基于干重的質(zhì)量比1:9~1:6，或?qū)⒉襟E(1)得到的粉葛粉與水按質(zhì)量比1:9~1:6混勻于95°C糊化30-60min，制成粉葛培養(yǎng)基；
[0010](3)冷卻后向步驟(2)所述的粉葛培養(yǎng)基中添加I~5g/L的氮源；
[0011](4)將步驟(3)所述的添加了氮源的培養(yǎng)基置于115°C滅菌20min ;冷卻至50°C以下，在無(wú)菌條件下加入酶制劑，并接入培養(yǎng)基重量10% (v/m)的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)種子液(B卩100g培養(yǎng)基添加IOml種子液)，并于37°C同步預(yù)處理、發(fā)酵68-76h后得到丁醇發(fā)酵液。
[0012]其中，本發(fā)明上述方法中，步驟(3)中所述氮源選自醋酸銨、酵母膏、豆柏、麩皮和尿素，或其兩種或多種的組合；
[0013]步驟(4)中所述酶制劑為果膠酶、纖維素酶中一種或其組合。其中纖維素的標(biāo)準(zhǔn)酶活(CMC酶活)為lX105u/g，酶活定義:lg酶粉于50°C，Imin催化CMC水解生成I μ g葡萄糖為一個(gè)纖維素酶CMC活力單位；果膠酶的標(biāo)準(zhǔn)酶活為5X105U/g，酶活定義:lg酶粉于50°C，Imin催化果膠水解生成I μ g半乳糖醛酸的酶量為一個(gè)果膠酶活力單位；
[0014]所述酶制劑的添加量為l_5g/L粉葛發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0015]所述丙酮丁醇梭 菌(C.acetobutylicum)的保藏編號(hào)為CICC8008,購(gòu)買于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。
[0016]所述丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)種子液由以下培養(yǎng)方法獲得:玉米粉與水按質(zhì)量比1:10混勻后于95°C糊化30min，制成玉米醪培養(yǎng)基，115°C滅菌20min，無(wú)菌條件下接入丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum), 37°C培養(yǎng)24h得到。
[0017]本發(fā)明所述的粉葛原料同步酶處理發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其優(yōu)點(diǎn)在于酶處理與發(fā)酵同步進(jìn)行，簡(jiǎn)單方便，易操作，無(wú)污染物產(chǎn)生，丁醇產(chǎn)量高。發(fā)酵結(jié)束后醪液中丁醇產(chǎn)量可達(dá)到16.91g/L，丁醇產(chǎn)量得到顯著提高，較未添加酶組提高21%以上。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下所給出的實(shí)施例是為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)特征，并非對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行限制。對(duì)本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行的任何修改或局部替換，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
[0019]實(shí)施例1
[0020]取切塊、烘干粉碎后的粉葛干粉6.25g放入100ml厭氧瓶?jī)?nèi)，加入50ml蒸餾水(質(zhì)量比1:8)混勻，將其置于95°C糊化30min。冷卻后A組和B組各添加醋酸銨作為氮源至終濃度為2g/L，C組不做任何添加，三組同于115°C滅菌20min。冷卻至50°C以下后A組在無(wú)菌條件下添加果膠酶至終濃度為3g/L，B組不添加該酶。三組同時(shí)接入培養(yǎng)基重量10%(v/m)的丙酮丁醇梭菌種子液，37°C發(fā)酵72h后分別得到丁醇發(fā)酵液。利用氣相色譜測(cè)得A組丁醇發(fā)酵液中丁醇產(chǎn)量為16.91g/L，較未添加酶組(B組)提高25.07%，較未經(jīng)任何處理組(C 組)提高 36.81%。
[0021]實(shí)施例2
[0022]取切塊、烘干粉碎后的粉葛干粉7.1Og放入100ml厭氧瓶?jī)?nèi)，加入50ml蒸餾水(質(zhì)量比1:7)混勻，將其置于95°C糊化45min，冷卻后加入麩皮作為氮源至終濃度為5g/L，115°C滅菌20min。冷卻至50°C以下后A組在無(wú)菌條件下加入纖維素酶至終濃度為lg/L，B組不添加酶，二組同時(shí)接入培養(yǎng)基重量10% (v/m)的丙酮丁醇梭菌種子液，37°C發(fā)酵76h后分別得到丁醇發(fā)酵液。利用氣相色譜測(cè)得A組丁醇發(fā)酵液中丁醇產(chǎn)量為15.76g/L，較未添加酶組(B組)提高21.14%。
[0023]實(shí)施例3
[0024]取切塊、直接粉碎后的粉葛漿5.55g(干基)放入100ml厭氧瓶?jī)?nèi)，加入定量蒸餾水至質(zhì)量比1:9 (基于干基)，將其置于95°C糊化30min，冷卻后加入尿素作為氮源至終濃度為2g/L，115°C滅菌20min。冷卻至50°C以下后A組在無(wú)菌條件下添加終濃度為1.5g/L的果膠酶和1.5g/L纖維素酶，B組不添加酶，二組同時(shí)接入培養(yǎng)基重量10% (v/m)的丙酮丁醇梭菌種子液，37°C發(fā)酵68h后分別得到丁醇發(fā)酵液。利用氣相色譜測(cè)得A組丁醇發(fā)酵液中丁醇產(chǎn)為16.21g/L，較未添加酶組(B組)提高22.84%。
[0025]實(shí)施例4
[0026]取切塊、烘干粉碎后的粉葛干粉8.25g放入100ml厭氧瓶?jī)?nèi)，加入50ml蒸餾水(質(zhì)量比1:6)混勻，將其置于95°C糊化60min，冷卻后加入終濃度為2g/L的酵母膏作為氮源，115°C滅菌20min。冷卻至50°C以下后A組在無(wú)菌條件下加入纖維素酶至終濃度為5g/L，B組不添加酶制劑，二組同時(shí)接入培養(yǎng)基重量10% (v/m)的丙酮丁醇梭菌種子液，37°C發(fā)酵76h后分別得到丁醇發(fā)酵液。利用氣相色譜測(cè)得A組丁醇發(fā)酵液中丁醇產(chǎn)量為15.29g/L，較未添加酶組(B組)提高21.02%。
[0027]實(shí)施例5
[0028]取切塊、直接粉碎后的粉葛漿6.25g(干基)放入100ml厭氧瓶?jī)?nèi)，加入定量蒸餾水至質(zhì)量比1:8(基于干基)，將其置于95°C糊化30min，冷卻至50°C以下后加入豆柏作為氮源至終濃度為5g/L，115°C滅菌20min，冷卻后A組在無(wú)菌條件下加入纖維素酶至終濃度為3g/L，B組不添加酶制劑，二組同時(shí)接入10% (v/m)的丙酮丁醇梭菌種子液，37°C發(fā)酵72h后分別得到丁醇發(fā)酵液。利用氣相色譜測(cè)得A組丁醇發(fā)酵液中丁醇產(chǎn)量為16.17g/L，較未添加酶組(B組)提高23.02%。
[0029]實(shí)施例6
[0030]取切塊、烘干粉碎后的粉葛干粉6.55g放入100ml厭氧瓶?jī)?nèi)，加入50ml蒸餾水(質(zhì)量比1:7.6)混勻，將其置于95°C糊化45min，冷卻至50°C以下后加入終濃度為lg/L的醋酸銨和終濃度為2g/L的豆柏，115°C滅菌20min，冷卻后A組在無(wú)菌條件下加入果膠酶至終濃度為3g/L，B組不添加，二組同時(shí)接入培養(yǎng)基重量10%(v/m)的丙酮丁醇梭菌種子液，37°C發(fā)酵76h后分別得到丁醇發(fā)酵液。利用氣相色譜測(cè)得A組丁醇發(fā)酵液中丁醇產(chǎn)量為16.35g/L，較未添加酶組(B組)提高23.88%。
[0031] 實(shí)施例7
[0032]取切塊、烘干粉碎后的粉葛干粉6.0Og放入100ml厭氧瓶?jī)?nèi)，加入50ml蒸餾水(質(zhì)量比1:8.33)混勻，將其置于95°C糊化30min，冷卻至50°C以下后加入醋酸銨、尿素和豆柏作為氮源，其終濃度分別為lg/L、0.5g/L、和lg/L，115°C滅菌20min。在冷卻后在無(wú)菌條件下向A組加入果膠酶至終濃度為2g/L，B組不添加酶制劑。二組同時(shí)接入培養(yǎng)基重量10%(v/m)的丙酮丁醇梭菌種子液，37°C發(fā)酵68h。分別得到丁醇發(fā)酵液。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)得發(fā)酵液中添加和未添加酶組的丁醇產(chǎn)量分別為16.57g/L (A組)和13.46g/L (B組)，A組較B組提高了 23.10%。
[0033]結(jié)果顯示，本發(fā)明所述的酶處理方法工藝簡(jiǎn)單，操作方便，丁醇濃度高，通過(guò)酶同步處理的粉葛原料發(fā)酵后丁醇最高濃度可達(dá)16.91g/L。利用酶同步處理的粉葛在進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，其丁醇 產(chǎn)量提高顯著，較未添加酶組提高21%以上。
【權(quán)利要求】
1.一種同步酶處理發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (I)將新鮮粉葛采收切塊后，直接粉碎得粉葛漿，或烘干粉碎得粉葛干粉； (2 )將步驟(1)得到的粉葛漿與水按基于干重的質(zhì)量比1:9~1:6，或?qū)⒉襟E(1)得到的粉葛粉與水按質(zhì)量比1:9~1:6混勻于95°C糊化30-60min，制成粉葛培養(yǎng)基； (3)冷卻后向步驟(2)所述的粉葛培養(yǎng)基中添加I~5g/L的氮源； (4)將步驟(3)所述的添加了氮源的培養(yǎng)基置于115°C滅菌20min ；冷卻至50°C以下，在無(wú)菌條件下加入酶制劑，同時(shí)并接入培養(yǎng)基重量10% (v/m)的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)種子液,并于37?同步預(yù)處理、發(fā)酵68_76h后得到丁醇發(fā)酵液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同步酶處理發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于，步驟(3)中所述氮源選自醋酸銨、酵母膏、豆柏、麩皮和尿素，或其兩種或多種的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的同步酶處理發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于，步驟(4)中所述酶制劑為果膠酶、纖維素酶中一種或其組合；所述酶制劑的添加量為l_5g/kg粉葛發(fā)酵培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的同步酶處理發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于，步驟(4)中所述丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)種子液由以下培養(yǎng)方法獲得:玉米粉與水按質(zhì)量比1:10混勻后于95°C糊化 30min，制成玉米醪培養(yǎng)基，115°C滅菌20min，無(wú)菌條件下接入丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum), 37°C培養(yǎng)24h得到。
【文檔編號(hào)】C12P7/16GK103667364SQ201310676487
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】傅舒, 劉曉風(fēng), 鄭濤, 李 東, 閆志英, 袁月祥, 孫永明 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所