一種艾滋病（hiv-1）高精確核酸定量檢測的方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】一種應用于生物醫(yī)學臨床診斷領域中的艾滋?。℉IV-1）高精確核酸定量檢測試劑盒，所述試劑盒的基因擴增位點位于HIV基因組的5’LTR保守區(qū)域；試劑盒包括磁珠法核酸提取試劑盒和HIV核酸擴增試劑盒，其中磁珠法核酸提取試劑盒包括裂解結(jié)合液、漂洗液A、漂洗液B、漂洗液C、洗脫液、磁珠液；HIV核酸擴增試劑盒包括RT-PCR反應液、酶混合液、HIV-內(nèi)標、HIV定量參考品1-4、陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、強陽性質(zhì)控品。該發(fā)明操作簡便快速、成本低廉、檢測靈敏度高，重復性好、引物和探針基因型覆蓋率高、保守性高、特異性強、引入高效的內(nèi)標系統(tǒng)、解決靶基因和內(nèi)標同時擴增而導致的相互抑制和干擾問題。
【專利說明】—種艾滋病(HIV-1)高精確核酸定量檢測的方法及其試劑
合
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學臨床診斷領域中的一種艾滋病(HIV-ι)高精確核酸定量檢測的方法及其試劑盒。
【背景技術】
[0002]人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)是導致一種慢性致死性疾病艾滋病(Acquired immune defiiency syndrome, AIDS)的病原微生物。由于艾滋病具有傳染性和高致死性，因此已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)重點防控的主要疾病之一。自第一例艾滋病病例于1981首次報告艾滋病病例以來，到目前為止，艾滋病已造成超過兩千五百萬人死亡。中國自1985年首次發(fā)現(xiàn)艾滋病病例以來，艾滋病的流行呈快速爬升傾向。近年來，中國艾滋病的感染與發(fā)病人數(shù)也增長較快。中國艾滋病現(xiàn)狀，據(jù)聯(lián)合國駐華機構(gòu)顯示的數(shù)據(jù)，目前中國艾滋病病毒感染者約84萬人，加上已經(jīng)過世的24萬人，總數(shù)應在100萬人左右。根據(jù)世界衛(wèi)生組織預測，目前雖然中國艾滋病病毒攜帶者占總?cè)丝诘谋壤m然很低，但感染總?cè)藬?shù)在亞洲位居第2位，在全球居第14位。鑒于中國是世界人口基數(shù)最大，人口最為密集的國家，一旦艾滋病大規(guī)模流行將成為一場公共衛(wèi)生災難。
[0003]HIV的診斷目前常用的診斷手段包括病毒學診斷和血清學診斷，HIV感染的病毒學診斷技術常用方法為共培養(yǎng)法，即用正常人外周血液分離單個核細胞，加PHA刺激并培養(yǎng)后，加入病人單個核細胞進行艾滋病的診斷。血清學檢測中，酶聯(lián)免疫法是目前診斷艾滋病的一個主要手段。HIV酶聯(lián)免疫試劑目前已經(jīng)普遍用于臨床，急診，血液篩查等各個領域。但是，酶聯(lián)免疫方法作為一種間接滯后的檢測方`法，他所檢測的目標是人體內(nèi)產(chǎn)生的抗體而不是病原體本身。因此，雖然酶聯(lián)免疫方法經(jīng)過幾代的改良和進化，在靈敏度、特異性、精確度和穩(wěn)定性等方面有了巨大的提高。近年來核酸分子檢測技術在檢驗醫(yī)學和臨床研究中顯示出強大的優(yōu)勢，相比較酶聯(lián)免疫診斷技術具有靈敏度高、特異性強、診斷快速等優(yōu)點。血清中的HIV RNA是病毒復制和艾滋病進程的確切標志，所以血清中HIV RNA的檢測，已成為診斷艾滋病的“金標準”方法。近幾年來，通過熒光定量PCR方法直接檢測HIV RNA已經(jīng)成為一種通用艾滋病醫(yī)學檢測方法，大大提高了艾滋病的檢測準確性，有利于疾病的早期診斷，可將“窗口期”大大的縮短。在艾滋病預防過程中，艾滋病高危人群的診斷是“防艾”的關鍵環(huán)節(jié)，而核酸診斷試劑在確診艾滋病病毒攜帶者的過程中發(fā)揮了重要作用，目前，已經(jīng)成為艾滋病確診的金標準試劑。艾滋病核酸定量檢測目前已經(jīng)是通過國家認證臨床PCR實驗室的常規(guī)檢測項目之一。在艾滋病患者確診，用藥和療效預判，以及康復治療過程中具有指導意義。同時，艾滋病病毒載量的精確判讀，也為患者提供了準確的病情控制信息。
[0004]HIV為逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒亞科，HIV有十分高的遺傳變異率，高度變異區(qū)在env基因內(nèi)，變異率為20%-30%。gag和pol基因雖然較少變異，但是也存在一定概率變異，分別為gagl基因約5%-22%，pol基因為15%。所以，對于HIV核酸檢測試劑來說，所用擴增引物的保守性和基因型覆蓋能力，以及檢測不同基因型樣品的靈敏度是否一致，一直是評價此類診斷試劑產(chǎn)品性能的重要指標之一。也是困擾當今HIV診斷試劑向國際化發(fā)展的技術壁
壘之一。
[0005]近年來，相比于傳統(tǒng)的病毒核酸提取技術，市場上涌現(xiàn)了一些簡單方便的離心柱法病毒核酸提取技術，由于提取技術中的離心柱配套使用的高通量自動化離心設備成本過高，難于普及推廣。因此，研究開發(fā)一種艾滋病(HIV-1)高精確核酸定量檢測的方法及其試劑盒是目前急待解決的新課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種艾滋病(HIV-1)高精確核酸定量檢測的方法及其試劑盒，該發(fā)明從根本上解決現(xiàn)有HIV-1核酸定量PCR技術存在的基因型覆蓋不全、漏檢率高、靈敏度低、準確性差等問題，其設計的引物和TaqMan熒光探針位于HIV基因組的5’ LTR區(qū)域，該引物和探針具有基因型覆蓋范圍廣，檢測靈敏度高，特異性強、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。同時應用磁珠法進行RNA提取，方法簡單，核酸純度高，提取樣本可為血清或血漿，樣本量大，采用內(nèi)標和防污染體系提高檢測精確度，采用耐DNase和RNase假病毒作為工作標準品和質(zhì)控品，提聞試劑盒的穩(wěn)定性。
[0007]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:一種艾滋病(HIV-1)高精確核酸定量檢測試劑盒，所述試劑盒的基因擴增位點位于HIV基因組的5’ LTR保守區(qū)域；試劑盒包括磁珠法核酸提取試劑盒和HIV核酸擴增試劑盒，其中磁珠法核酸提取試劑盒包括裂解結(jié)合液、漂洗液A、漂洗液B、漂洗液C、洗脫液、磁珠液；HIV核酸擴增試劑盒包括RT-PCR反應液、酶混合液、HIV-內(nèi)標、HIV定量參考品1-4、陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、強陽性質(zhì)控品；所述磁珠法核酸提取試劑盒中裂解結(jié)合液組成為含有十二烷基硫酸鈉0.5-2.5%，TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，異硫氰酸胍 2-6.0mol/L, l-10mM/L EDTA (PH7.5);所述磁珠法核酸提取試劑盒中漂洗液A組成為含有Triton X-1000.5-2.0ml/100ml，氯化鋰0.5-lmol/L ;所述磁珠法核酸提取試劑盒中漂洗液B組成為含有Triton X-1000.5-2.0ml/100ml,氯化鉀0.1-0.3mol/L,60-80%乙醇；所述磁珠法核酸提取試劑盒中漂洗液C組成為含有 Triton X-1000.5-2.0ml/100ml,氯化鈉 0.1-0.3mol/L，60-80% 乙醇；所述磁珠法核酸提取試劑盒中洗脫液組成為含有 10mmol/L Tris.HC1 (PH8.3),0.01-0.05%Prolin300 ；所述磁珠法核酸提取試劑盒中磁珠液組成為直徑為1 μ m的氧化硅超順納米磁珠，濃度為10-40mg/ml ;所述HIV核酸擴增試劑盒中RT-PCR反應液包括用于檢測靶基因和內(nèi)標的探針、用于擴增靶基因和內(nèi)標的上游引物以及下游引物、RT-PCR緩沖液；HIV核酸擴增試劑盒中用于檢測靶基因的探針序列為:5’ -ATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAGCT-’ 3 (SEQID N0:l)，5’端標記為FAM熒光發(fā)生基團，3’端標記為BHQ1熒光淬滅基團；用于內(nèi)標檢測的探針序列為:5’-CAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGC-’3 (SEQ ID NO: 2)，5’ 端標記為HEX熒光發(fā)生基團，3’端標記為BHQ1熒光淬滅基團；用于擴增靶基因的上游引物序列為:5’ -CCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAG-’ 3 (SEQ ID NO: 3);用于擴增靶基因的下游引物序列為:5’-TCACACAACAGACGGGCACACAC-’3 (SEQ ID NO:4);用于擴增內(nèi)標的上游引物序列為:5’ -TTCGATCTCCGTCGAACCTTG-’ 3 (SEQ ID NO:5);用于擴增內(nèi)標的下游引物序列為:5’-TTCTCAGGACTCCAGTCGCTG-’3 (SEQ ID NO:6);所述HIV核酸擴增試劑盒中用于檢測靶基因的探針使用濃度為5-20pmol， 優(yōu)選靶基因探針使用濃度為8pmol ;用于檢測內(nèi)標的探針使用濃度為5-20pmol，優(yōu)選內(nèi)標探針使用濃度為8pmol ;用于檢測靶基因的上下游引物使用濃度為10-30pmol，優(yōu)選靶基因上下游引物使用濃度為20pmol ;用于檢測內(nèi)標的上下游引物使用濃度為5-20pmol，優(yōu)選內(nèi)標上下游引物使用濃度為8pmol ;所述HIV核酸擴增試劑盒中 RT-PCR 緩沖液組成為 50mmol/L Tris-HCl (PH8.3), 10mmol/L (NH4)2S04, 75mmol/LKC1，2.5mmol/LMgS04,0.15mmol/L dNTPs ;所述HIV核酸擴增試劑盒中酶混合液包括逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV酶)、熱啟動Taq酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG)、RNase抑制劑、T4噬菌體GP32蛋白；其中M-MLV酶用量為50-200U/人份，熱啟動Taq酶用量為3_8U/人份、尿嘧啶糖基化酶的用量為0.05-0.2U/人份、RNase抑制劑用量為5-10U/人份、T4噬菌體GP32蛋白用量為1-5 μ g/人份；所述試劑盒中 HIV-內(nèi)標是將序列 5’ -TTCGATCTCCGTCGAACCTTGCACTCTGCATCCTGGACTCATGCTGACTGCAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGCTCTACTGCACTCCTGCGTCATCACGCGACTGGAGTCCTGAGAA-’3(SEQ ID NO: 7)插入到pUC18T載體而構(gòu)成的重組體；HIV內(nèi)標質(zhì)粒使用濃度為100-500COpieS/次，優(yōu)選使用濃度為lOOcopies/次；所述試劑盒中陰性質(zhì)控品為滅活陰性人源血漿，HIV定量參考品1-4，臨界陽性質(zhì)控品和強陽性質(zhì)控品均由含有HIV RNA片段假病毒顆粒稀釋而成，稀釋基質(zhì)為滅活陰性人源血漿；濃度分別為1.0X 107，1.0X106, 1.0 X 105，1.0 X 104，1.0 X 103，1.0 X 106IU/ml ;所述試劑盒需要進行RT-PCR反應，其擴增的最佳反應溫度和時間為:55°C逆轉(zhuǎn)錄20min，1個循環(huán)；95°C 5min, 1個循環(huán)；最后94°C 10s，60°C 30s, 42個循環(huán)采集熒光信號；所述試劑盒檢測樣本類型為血清和血漿；試劑盒的檢測靈敏度為100IU/ml，檢測線性范圍為500-1 X 109IU/ml ;所述熒光定量RT-PCR檢測過程使用了 M-MLV+Taq酶的雙酶一步法技術進行逆轉(zhuǎn)錄和擴增。
[0008]本發(fā)明的要點在于一種人類免疫缺陷病毒(HIV-1)核酸定量檢測試劑盒。其基本原理是:首先采用納米磁珠法提取血清、血漿樣品中HIV RNA作為擴增模板，然后應用TaqMan熒光探針技術完成對該模板實時熒光定量RT-PCR檢測過程。同時擴增體系中引入了高效的內(nèi)標系統(tǒng)，通過檢測內(nèi)標是否正常來監(jiān)測待測樣本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假陰性。其中，通過應用專業(yè)生物信息學軟件，分析比較了 1000多條HIV基因組序列，設計了高保守性、特異性和高效性的TaqMan熒光探針和引物以及內(nèi)標的探針和引物。所述靶基因和內(nèi)標探針分別標記FAM和HEX熒光報告基團；所述實時熒光定量PCR產(chǎn)物在70-130個堿基對范圍。同時，熒光定量RT-PCR檢測過程使用了雙酶一步法技術，避免了兩步法的易污染，操作繁瑣，靈敏度低等眾多缺陷。”
[0009]本發(fā)明試劑盒采用吸附效果好、易于純化的磁珠法提取血清、血漿樣品中艾滋病病毒核酸作為模板，應用TaqMan熒光探針技術完成對該模板熒光定量PCR檢測過程。同時在反應體系中添加了高效的內(nèi)標，通過檢測內(nèi)標是否正常來監(jiān)測待測樣本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假陰性的存在?！?br> [0010]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0011]1、引物和探針基因型覆蓋率高、保守性高、特異性強。經(jīng)測試表明本發(fā)明能夠覆蓋HIV-1的9個基因型，與國際先進的艾滋病核酸診斷試劑性能基本相當。
[0012]2、檢測靈敏度高，重復性好。本發(fā)明使用自主開發(fā)的磁珠法核酸提取技術，能夠從樣品中獲得高純度艾滋病病毒(HIV-1)核酸，消除提取物對PCR反應的干擾，加大了檢測樣本量，提高了檢測靈敏度和穩(wěn)定性。
[0013]3、引入了高效的內(nèi)標系統(tǒng)，解決了靶基因和內(nèi)標同時擴增而導致的相互抑制和干擾等問題，能夠高效的監(jiān)控整個PCR擴增整個過程，避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
[0014]4、引入RNA假病毒制備工藝，增加了 HIV核酸檢測試劑的安全性，并能提供穩(wěn)定的工作標準品和陽性質(zhì)控品。同時，工作標準品和陽性質(zhì)控品與樣本同步參與核酸提取過程，能夠很好的模擬真實病毒的提取狀態(tài)。
[0015]5、本發(fā)明操作簡便、快速、成本低廉，并且易于開發(fā)為自動化檢測系統(tǒng)，以便對大量樣品的進行高通量篩檢。所檢測的樣品中包括人源或動物源的血液、精液、唾液。適合常規(guī)血液樣品的檢測，也適合自動化和高通量檢測。該診斷試劑可以判斷傳染病的病情、預后和傳染性，預測抗病毒治療的效果，監(jiān)測和評價抗病毒藥物的療效，提高血液和血液制品的篩選質(zhì)量和應用于流行病學調(diào)查領域，為臨床病原體載量的監(jiān)測和治療方案以及藥物的篩選提供了重要參考。
[0016]一種艾滋病(HIV-1)高精確核酸定量檢測的方法及其試劑盒與現(xiàn)有技術相比，具有操作簡便快速、成本低廉、檢測靈敏度高，重復性好、引物和探針基因型覆蓋率高、保守性高、特異性強、引入高效的內(nèi)標系統(tǒng)、解決靶基因和內(nèi)標同時擴增而導致的相互抑制和干擾問題等優(yōu)點，將廣泛的應用于生物醫(yī)學臨 床診斷領域中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進行詳細說明。
[0018]圖1是本發(fā)明檢測中檢所國家靈敏度參考品血清盤檢測結(jié)果圖。
[0019]圖2是本發(fā)明檢測中檢所國家陰陽性參考品血清盤檢測結(jié)果圖。
[0020]圖3是本發(fā)明檢測國際HIV基因型血清盤的檢測結(jié)果圖。
[0021]圖4是本發(fā)明內(nèi)標檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0022]以下實施例將有助于對本發(fā)明的了解，但這些實施例僅為了對本發(fā)明加以說明，本發(fā)明并不限于這些內(nèi)容。
[0023]實施例一
[0024]HIV RNA的熒光定量PCR檢測實例
[0025](1)試劑準備
[0026]a.RT-PCR反應液的配制
[0027]RT-PCR 緩沖液組成為 50mmol/L Tris-HCl (ΡΗ8.3)，10mmol/L (NH4) 2S04，75mmol/LKC1,2.5mmol/L MgS04,0.15mmol/L dNTPs。擴增靶基因的上游引物以及下游引物，使用濃度為20pmol，靶基因檢測的探針使用濃度為8pmol，內(nèi)標的上游引物以及下游引物使用濃度為8pmol,內(nèi)標探針使用濃度為8pmol。
[0028]b.按比例(裂解結(jié)合液400 μ 1/人份+內(nèi)標0.1 μ 1/人份)取相應量的裂解結(jié)合液及內(nèi)標，充分混勻成裂解結(jié)合液-mix，瞬時離心后備用。
[0029]c.根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照、臨界陽性和工作標準品1-4的量，按比例(RT-PCR反應液28.5 μ 1/人份+酶混合液1.5 μ 1/人份)，充分混勻成PCR-mix，瞬時離心后備用。酶混合液組成包括逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV酶)120U、熱啟動Taq酶3U、尿嘧啶糖基化酶(UNG) 0.1U、RNase 抑制劑 5U、T4 噬菌體 GP32 蛋白 1 μ g。[0030](2)標本提取
[0031]a.取適量1.5ml離心管，分別標記陰性對照、陽性對照、臨界陽性對照、工作標準品1-4及待測樣本，每管中加入400 μ 1裂解結(jié)合液，裂解液組成為含有十二烷基硫酸鈉
0.5-2.5%,Triton X-1000.5-2.0ml/100ml，異硫氰酸胍 2-6.0mol/L, l-10mM EDTA (PH7.5)；
[0032]b.每管加入200μ 1待測樣本或陰性對照、陽性對照、臨界陽性對照、工作標準品1-4 ;每管加入10 μ 1磁珠懸液(磁珠液直徑為1 μ m的氧化硅超順納米磁珠，濃度為20mg/ml)，震蕩混勻10秒鐘后，室溫靜置10分鐘，瞬時離心；
[0033]c.將離心管置于磁力架上吸附約2分鐘，棄掉上清液，瞬時離心，吸干殘液；
[0034]d.加入 600 μ 1 漂洗液 A，漂洗液 A 組成為含有 Triton X-1000.5-2.0ml/100ml，氯化鋰0.5-lmol/L,60-80%乙醇。用移液器反復吸打10次后，瞬時離心。在磁力架上吸附2分鐘，棄掉上清液，然后瞬時離心，將離心管再置于磁力架上吸附約2分鐘，吸干殘液；
[0035]e.加入600μ 1漂洗液B，所述漂洗液Β組成為含有TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，氯化鉀0.1-0.3mol/L，60-80%乙醇；用移液器反復吸打10次后，瞬時離心。在磁力架上吸附2分鐘，棄掉上清液，然后瞬時離心，將離心管再置于磁力架上吸附約2分鐘，吸干殘液；
[0036]f.加入600μ 1漂洗液C，所述漂洗液C組成為含有TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，氯化鈉0.1-0.3mol/L，60-80%乙醇。用移液器反復吸打10次后，瞬時離心。在磁力架上吸附2分鐘，棄掉上清液，然后瞬時離心，將離心管再置于磁力架上吸附約2分鐘，吸干殘液；
[0037]g.加入40 μ 1洗脫液，所述洗脫液為含有10mmol/L Tris.HC1 (PH8.3)，
0.01-0.05%Prolin300。震蕩混勻10秒鐘，然后65°C溫浴2分鐘；將離心管放置在磁力架上吸附2分鐘，吸出上清液。
[0038](3)加樣和檢測
[0039]向含有RT-PCR反應液的反應管中，分別加入提取的樣本、陰性對照、陽性對照、臨界陽性對照、及工作標準品各20 μ 1，蓋緊管蓋，置于PCR儀上進行檢測。擴增程序如下:
[0040]以ΑΒΙ7500為例，設置如表1:
[0041]表1PCR擴增程序
【權(quán)利要求】
1.一種艾滋病(HIV-ι)高精確核酸定量檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒的基因擴增位點位于HIV基因組的5’ LTR保守區(qū)域。
2.一種艾滋病(HIV-1)高精確核酸定量檢測試劑盒，其特征在于:試劑盒包括磁珠法核酸提取試劑盒和HIV核酸擴增試劑盒，其中磁珠法核酸提取試劑盒包括裂解結(jié)合液、漂洗液A、漂洗液B、漂洗液C、洗脫液、磁珠液；HIV核酸擴增試劑盒包括RT-PCR反應液、酶混合液、HIV-內(nèi)標、HIV定量參考品1-4、陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、強陽性質(zhì)控品。
3.如權(quán)利要求2所述的一種艾滋病(HIV-1)高精確核酸定量檢測試劑盒，其特征在于:所述磁珠法核酸提取試劑盒中裂解結(jié)合液組成為含有十二烷基硫酸鈉0.5-2.5%，TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，異硫氰酸胍 2-6.0mol/L, 1-lOmM/L EDTA (PH7.5);所述磁珠法核酸提取試劑盒中漂洗液A組成為含有Triton X-1000.5-2.0ml/100ml，氯化鋰0.5-lmol/L ；所述磁珠法核酸提取試劑盒中漂洗液B組成為含有Triton X-1000.5-2.0ml/100ml，氯化鉀0.1-0.3mol/L, 60-80%乙醇；所述磁珠法核酸提取試劑盒中漂洗液C組成為含有Tritonx-1000.5-2.0ml/100ml，氯化鈉0.1-0.3mol/L, 60-80%乙醇；所述磁珠法核酸提取試劑盒中洗脫液組成為含有10mmol/L Tris.HC1 (PH8.3),0.01-0.05%Prolin300 ;所述磁珠法核酸提取試劑盒中磁珠液組成為直徑為lym的氧化硅超順納米磁珠，濃度為10-40mg/ml。
4.如權(quán)利要求2所述的一種艾滋病(HIV-1)高精確核酸定量檢測試劑盒，其特征在于:所述HIV核酸擴增試劑盒中RT-PCR反應液包括用于檢測靶基因和內(nèi)標的探針、用于擴增靶基因和內(nèi)標的上游引物以及下游引物、RT-PCR緩沖液；HIV核酸擴增試劑盒中用于檢測靶基因的探針序列為:5’-ATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAGCT-’3 (SEQ ID N0:1),5’端標記為FAM熒光發(fā)生基團，3’端標記為BHQ1熒光淬滅基團；用于內(nèi)標檢測的探針序列為:5’ -CAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGC-’ 3 (SEQ ID NO: 2)，5’ 端標記為 HEX熒光發(fā)生基團，3’端標記為BHQ1熒光淬滅基團；用于擴增靶基因的上游引物序列為:5’ -CCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAG-’ 3 (SEQ ID NO: 3);用于擴增靶基因的下游引物序列為:5’ -TCACACAACAGACGGGCACACAC-’ 3 (SEQ ID NO:4);用于擴增內(nèi)標的上游引物序列為:5’ -TTCGATCTCCGTCGAACCTTG-’ 3 (SEQ ID NO:5);用于擴增內(nèi)標的下游引物序列為:5’-TTCTCAGGACTCCAGTCGCTG-’3 (SEQ ID NO:6)。
5.如權(quán)利要求2或4所述的一種艾滋病(HIV-1)高精確核酸定量檢測試劑盒，其特征在于:所述HIV核酸擴增試劑盒中用于檢測靶基因的探針使用濃度為5-20pmol，優(yōu)選靶基因探針使用濃度為8pmol ;用于檢測內(nèi)標的探針使用濃度為5-20pmol，優(yōu)選內(nèi)標探針使用濃度為8pmol ;用于檢測靶基因的上下游引物使用濃度為10-30pmol，優(yōu)選靶基因上下游引物使用濃度為20pmol ;用于檢測內(nèi)標的上下游引物使用濃度為5-20pmol，優(yōu)選內(nèi)標上下游引物使用濃度為8pmol。
6.如權(quán)利要求2所述的一種艾滋病(HIV-1)高精確核酸定量檢測試劑盒，其特征在于:所述HIV核酸擴增試劑盒中RT-PCR緩沖液組成為50mmol/LTris-HCl (PH8.3)，lOmmol/L (NH4) 2S04, 75mmol/LKCl, 2.5mmol/LMgS04,0.15mmol/L dNTPs。
7.如權(quán)利要求2所述的一種艾滋病(HIV-1)高精確核酸定量檢測試劑盒，其特征在于:所述HIV核酸擴增試劑盒中酶混合液包括逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV酶)、熱啟動Taq酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG)、RNase抑制劑、T4噬菌體GP32蛋白；其中M-MLV酶用量為50-200U/人份，熱啟動Taq酶用量為3-8U/人份、尿嘧啶糖基化酶的用量為0.05-0.2U/人份、RNase抑制劑用量為5-10U/人份、T4噬菌體GP32蛋白用量為1_5 μ g/人份。
8.如權(quán)利要求2所述的一種艾滋病(HIV-1)高精確核酸定量檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中 HIV-內(nèi)標是將序列 5’ -TTCGATCTCCGTCGAACCTTGCACTCTGCATCCTGGACTCATGCTGACTGCAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGCTCTACTGCACTCCTGCGTCATCACGCGACTGGAGTCCTGAGAA-’ 3 (SEQ ID NO:7)插入到pUC18T載體而構(gòu)成的重組體；HIV內(nèi)標質(zhì)粒使用濃度為100-500copies/次，優(yōu)選使用濃度為lOOcopies/次。
9.如權(quán)利要求2所述的一種艾滋病(HIV-1)高精確核酸定量檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中陰性質(zhì)控品為滅活陰性人源血漿，HIV定量參考品1-4，臨界陽性質(zhì)控品和強陽性質(zhì)控品均由含有HIV RNA片段假病毒顆粒稀釋而成，稀釋基質(zhì)為滅活陰性人源血漿；濃度分別為 1.0X 107，1.0X 106，1.0X 105，1.0X 104，1.0X 103，1.0X 106IU/ml。
10.如權(quán)利要求2所述的一種艾滋病(HIV-ι)高精確核酸定量檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒需要進行RT-PCR反應，其擴增的最佳反應溫度和時間為:55°C逆轉(zhuǎn)錄20min，1個循環(huán)；95°C 5min, 1個循環(huán)；最后94°C 10s，60°C 30s, 42個循環(huán)采集熒光信號。
11.如權(quán)利要求2所述的一種艾滋病(HIV-1)高精確核酸定量檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒檢測樣本類型為血清和血漿；試劑盒的檢測靈敏度為100IU/ml，檢測線性范圍為 500-1 X 109IU/ml。
12.如權(quán)利要求2所述的一種艾滋病(HIV-1)高精確核酸定量檢測試劑盒，其特征在于:所述熒光定量RT-PCR檢測 過程使用了 M-MLV+Taq酶的雙酶一步法技術進行逆轉(zhuǎn)錄和擴士豳>曰ο
【文檔編號】C12Q1/70GK103667534SQ201310681720
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】李望豐, 蔡一榮, 關爾鑫, 趙世源, 王丹, 肖樊, 周凱, 任旭 申請人:東北制藥集團遼寧生物醫(yī)藥有限公司