一種mlf乳酸菌凍干發(fā)酵劑的復(fù)合保護(hù)劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種MLF乳酸菌凍干發(fā)酵劑的復(fù)合保護(hù)劑，其成分及成分含量為：脫脂乳粉10g、甘油2.5g、谷氨酸鈉1.0g、蘋果酸鈉2.2g、海藻糖1.0g、山梨醇1.0g，水100mL；此外，還揭露了該復(fù)合保護(hù)劑的制備方法，制備過程簡單、易于操作，且復(fù)合保護(hù)劑溶質(zhì)均一、形態(tài)穩(wěn)定，解決了保護(hù)劑制備中不溶性物質(zhì)產(chǎn)生及高溫滅菌常導(dǎo)致絮狀沉淀產(chǎn)生的難題，簡化了現(xiàn)有保護(hù)劑配制中需過濾除菌與高溫滅菌相結(jié)合的復(fù)雜工序。利用該復(fù)合保護(hù)劑能夠提高乳酸菌凍干發(fā)酵劑的細(xì)胞存活率及貯藏時間，從而為研發(fā)專用于我國南方亞熱帶特色水果果酒釀制的高活性發(fā)酵劑奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】一種MLF乳酸菌凍干發(fā)酵劑的復(fù)合保護(hù)劑及其制備方法
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明屬于乳酸菌制品生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種具有MLF能力的乳酸菌凍干發(fā)酵劑的復(fù)合保護(hù)劑及其制備方法。
【【背景技術(shù)】】
[0002]高活性菌株是制備高效發(fā)酵劑的基礎(chǔ)，傳統(tǒng)的乳酸菌發(fā)酵劑存在種種弊端而逐漸被遺棄，取而代之的是一次性直投式發(fā)酵劑，此種產(chǎn)品以其活力高、體積小、攜帶方便等特點，大大提高了勞動生產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量。
[0003]本實驗室自主選育出的植物乳桿菌R23、植物乳桿菌植物亞種RF17、副干酪乳桿菌副干酪亞種R37為具有高蘋果酸乳酸發(fā)酵(malolactic fementation MLF)能力的優(yōu)良乳酸菌，其中:植物乳桿菌R23是指本 申請人:于2011年09月20日申請的中國發(fā)明申請?zhí)枮?01110281566.2、名稱為“一株植物乳桿菌R23”中所揭露的“植物乳桿菌R23”，其于2011年08月01日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏號為CGMCC N0.5105 ;植物乳桿菌植物亞種RF17是指本 申請人:于2012年10月11日申請的中國發(fā)明專利號為201210385606.2、名稱為“一種蘋果酸乳酸轉(zhuǎn)化高活力菌株”中所揭露的“植物乳桿菌植物亞種RF17”，其于2012年03月16日保藏于武漢市武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:M2012085 ;副干酪乳桿菌副干酪亞種R37是指本發(fā)明人于2013年01月17日申請的中國發(fā)明申請?zhí)枮?01310019848.4、名稱為“一株副干酪乳桿菌副干酪亞種菌株”中所揭露的“副干酪乳桿菌副干酪亞種R37”，其于2012年08月17日保藏于武漢市武漢大學(xué)的 中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:M2012311。另外，梁璋成等發(fā)表的文章:“MLF植物乳桿菌R23培養(yǎng)基優(yōu)化”(福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，24 (6):570-574)、“厭氧對植物乳桿菌R23抗逆性及枇杷酒MLF的影響”(福州大學(xué)學(xué)報，2010，38
(3):456-460)、及“枇杷酒植物乳桿菌R23蘋果酸乳酸發(fā)酵動力學(xué)研究”(福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010,25 (3):264-268)，任香蕓等發(fā)表的文章:“枇杷酒蘋果酸乳酸發(fā)酵耐硫優(yōu)良菌株的篩選”(食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36 (2):12-16)、“枇杷汁發(fā)酵優(yōu)良乳酸菌的分離與篩選”(中國農(nóng)學(xué)通報(增刊)，2010 (8):204-208)，“蘋果酸乳酸轉(zhuǎn)化高活力菌株的選育”(中國食品學(xué)報，2013，13 (8):55-59)，何志剛等發(fā)表的文章:“枇杷酒中蘋果酸乳酸發(fā)酵優(yōu)良乳酸菌的分離與鑒定”(中國食品學(xué)報，2011，11 (1):165-171)、“植物乳桿菌R23在枇杷酒中生長及蘋果酸乳酸發(fā)酵特性研究”(中國食品學(xué)報，2011，11 ( 4 ): 36-41)，4)林曉姿等發(fā)表的文章:“植物乳桿菌R23酵解“早鐘六號”枇杷果汁有機(jī)酸的動態(tài)分析”(中國食品學(xué)報，2011,11 (3):100-103)、“枇杷汁乳酸發(fā)酵優(yōu)良菌株篩選及其發(fā)酵特性研究”(熱帶作物學(xué)報，2011，32 (3):550-553)、“兩株自選乳酸菌的益生特性研究”(北京工商大學(xué)學(xué)報，2012，30 (1):30-35)、“葡萄全汁乳酸發(fā)酵菌株篩選及其風(fēng)味分析”(食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2013，31
(3):34-38)，這些文章中報道了植物乳桿菌R23、植物乳桿菌植物亞種RF17及副干酪乳桿菌副干酪亞種R37的高產(chǎn)蘋果酸乳酸酶能力，具有良好的蘋果酸乳酸轉(zhuǎn)化活力，以及高抗逆性和抗氧化等益生性，且可耐受120±2mg/L總二氧化硫、13±1%酒精、pH2.5±0.1酸度、0.5±0.05%膽鹽以及較低的溫度；各10^乳酸菌還具備胞外代謝產(chǎn)物抗氧化能力強(qiáng)、對超氧陰離子自由基和羥自由基的清除率較高的特性，非常適用于高蘋果酸果酒的生物降酸及果蔬乳酸發(fā)酵飲料的制備，已在枇杷、楊梅、刺葡萄等水果的發(fā)酵中得到良好應(yīng)用(參閱上述相關(guān)文獻(xiàn))。但上述三株MLF乳酸菌的培養(yǎng)尚處于傳統(tǒng)的繼代式培養(yǎng)方式，各菌株在斜面上的存活時間較短，需2-3個月轉(zhuǎn)接一次，菌種的活力在不斷傳代中會逐漸下降，從而導(dǎo)致其發(fā)酵效果下降，嚴(yán)重影響了發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)和穩(wěn)定性，因此研制高效乳酸菌直投式發(fā)酵劑勢在必行。
[0004]影響凍干發(fā)酵劑菌體存活率的因素有菌體濃度、濃縮條件、保護(hù)劑成分、預(yù)凍速率、干燥過程、包裝形式及保藏溫度等。其中凍干保護(hù)劑是最為復(fù)雜、最難選擇的關(guān)鍵因素。因此在凍干乳酸菌時要優(yōu)選適合于凍干菌種的保護(hù)劑，減少凍干時活菌的損失，進(jìn)而提高直投式發(fā)酵劑的發(fā)酵活力。不同保護(hù)劑對不同菌種的保護(hù)效果是不同的，單一的保護(hù)劑并不能滿足冷凍干燥的要求，所以，凍干保護(hù)劑一般都是按一定配方混合使用，因此，選擇保護(hù)劑的技術(shù)是制備高效發(fā)酵劑的一項關(guān)鍵技術(shù)，關(guān)系到發(fā)酵劑的發(fā)酵效率和用量。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一在于提供一種MLF乳酸菌凍干發(fā)酵劑的復(fù)合保護(hù)劑，該復(fù)合保護(hù)劑能夠提高M(jìn)LF乳酸菌凍干發(fā)酵劑的細(xì)胞存活率及貯藏時間。
[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二在于提供一種MLF乳酸菌凍干發(fā)酵劑的復(fù)合保護(hù)劑的制備方法，該方法操作簡便。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題之一的:
[0008]一種MLF乳酸菌凍干發(fā)酵劑的復(fù)合保護(hù)劑，該復(fù)合保護(hù)劑的成分及成分含量為:脫脂乳粉log、甘油2.5g、谷氨酸鈉1.0g、蘋果酸鈉2.2g、海藻糖1.0g、山梨醇1.0g,水IOOmL0
[0009]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題之二的:
[0010]一種MLF乳酸菌凍干發(fā)酵劑的復(fù)合保護(hù)劑的制備方法，其包括如下具體操作:
[0011](1)依據(jù)上述復(fù)合保護(hù)劑所述的成分含量準(zhǔn)確稱量該復(fù)合保護(hù)劑的各成分，備用；
[0012](2)先將稱量好的谷氨酸鈉溶解于盛有IOOmL水的燒杯中，接著將甘油、蘋果酸鈉、海藻糖及山梨醇加入,并用玻璃棒攪拌使之徹底溶解；然后放入脫脂乳粉,再加8-10粒玻璃珠，使脫脂乳粉充分混勻，混勻后將玻璃珠分離出并將混合液倒于三角瓶中，加硅膠塞，于105±2°C下濕熱滅菌10~15min，冷卻至室溫即可獲得所述復(fù)合保護(hù)劑。
[0013]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明復(fù)合保護(hù)劑中的蘋果酸鈉對MLF乳酸菌具有特定的保護(hù)作用，利用該復(fù)合保護(hù)劑能夠提高M(jìn)LF乳酸菌凍干發(fā)酵劑的細(xì)胞存活率及貯藏時間，從而為研發(fā)專用于我國南方亞熱帶特色水果果酒釀制的高活性發(fā)酵劑奠定了基礎(chǔ)；此外，該復(fù)合保護(hù)劑的制備方法易于操作，復(fù)合保護(hù)劑的溶質(zhì)均一、形態(tài)穩(wěn)定，解決了現(xiàn)有保護(hù)劑制備中不溶性物質(zhì)產(chǎn)生及高溫滅菌常導(dǎo)致絮狀沉淀產(chǎn)生的難題，并簡化了現(xiàn)有保護(hù)劑配制中需過濾除菌與高溫滅菌相結(jié)合的復(fù)雜工序。
【【具體實施方式】】[0014]為了方便闡述，本發(fā)明以下說明過程中，將植物乳桿菌R23、植物乳桿菌植物亞種RF17、副干酪乳桿菌副干酪亞種R37簡稱為R23、RF17和R37 ;此外，本發(fā)明中所涉及的百分比，在無特殊說明的情況下均為質(zhì)量百分比。
[0015]1材料和方法
[0016]1.1 材料
[0017]1.1.1 菌株:R23、RF17 和 R37。
[0018]1.1.2 培養(yǎng)基:
[0019]改良TJA培養(yǎng)基:酵母膏0.5%、牛肉膏1%、乳糖2%、葡萄糖0.2%、乙酸鈉0.5%、K2HPO40.2%、番茄汁 5%(v/v)、吐溫-800.1%、瓊脂 1.5%-2.0%、ρΗ6.8±0.2。
[0020]LHR20培養(yǎng)基:酵母膏0.74%、牛肉膏1.0%、蛋白胨0.5%、蔗糖2.0%、檸檬酸銨
0.2%, MgSO40.036%、MnSO40.005%、吐溫-800.1%、蘋果酸鈉 35% (5.7%, v/v)、番茄汁 15%、平菇浸汁5%、0.2N Na2HPO4-0.2N KH2PO4緩沖鹽稀釋4倍，121°C下濕熱滅菌20min。
[0021 ] 降酸試驗培養(yǎng)基:番茄汁10%，酵母膏0.2%，牛肉膏0.4%，MgSO40.02%,乙酸鈉
0.5%, Tween-800.1%，檸檬酸銨 0.2%, MnSO40.005%,胰蛋白胨 1%，蘋果酸 0.5%, ρΗ4.8±0.2，
IX IO5Pa 下滅菌 20min。
[0022]1.1.3主要試劑及儀器:
[0023]SPX-250BS-1I型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW_CJ-1FD型單人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；GI54DW型高壓滅菌器，美國致微；真空冷凍干燥機(jī)，德國CHRIST ;超低溫冷凍儲存箱，中科美菱低溫科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。
[0024]1.2 方法
[0025]1.2.1菌體濃度測定:活菌計數(shù)法
[0026]取ImL菌液加入到9mL無菌水中，依次做10倍系列稀釋，選取10_6、10' 10_8三個稀釋倍數(shù)，每個稀釋倍數(shù)各吸取0.2mL稀釋液注入改良TJA平板中，每個稀釋度做三個平板；之后將各平板均置于30°C下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，然后選取菌落數(shù)在30~300之間的平板計菌落數(shù)。
[0027]1.2.2菌體存活率的計算方法
[0028]將凍干后的菌劑用LHR20培養(yǎng)基還原到凍干前的體積，將LHR20培養(yǎng)基與菌劑混勻后測定其中的活菌數(shù)(采用活菌計數(shù)法)。
[0029]細(xì)胞存活率(％)=凍干復(fù)水后ImL樣液的活菌數(shù)(cfu/mL) /凍干前ImL樣液的活菌數(shù)(cfu/mL) X 100%
[0030]1.2.3總酸的測定方法
[0031]采用NaOH滴定法測定培養(yǎng)液的總酸，參照GB/T15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法進(jìn)行，以醋酸計。
[0032]1.2.4復(fù)合保護(hù)劑成分篩選的均勻試驗
[0033]以10%脫脂牛乳為溶劑，以甘油、谷氨酸鈉、蘋果酸鈉、海藻糖、乳糖和山梨醇為試驗因子，進(jìn)行U7 (76)均勻試驗設(shè)計，并測定各處理的細(xì)胞存活率，之后利用DPS軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得適宜R23的復(fù)合保護(hù)劑成分。
[0034]1.2.5復(fù)合保護(hù)劑中各成分含量篩選的正交試驗[0035]以1.2.4均勻試驗得到的復(fù)合保護(hù)劑成分為試驗因素，進(jìn)行L16 (45)正交試驗，并測定凍干發(fā)酵劑的細(xì)胞存活率，之后利用DPS軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定R23凍干發(fā)酵劑的復(fù)合保護(hù)劑各成分的適宜含量。
[0036]1.2.6復(fù)合保護(hù)劑的制備
[0037]準(zhǔn)確稱量1.2.5正交試驗確定的復(fù)合保護(hù)劑各成分的含量，備用；將稱量好的谷氨酸鈉溶解于IOOmL水中，接著將其它成分放入、混勻；之后于105±2°C下濕熱滅菌10~15min，冷卻至室溫即可獲得所述復(fù)合保護(hù)劑。
[0038]1.2.7菌體處理與凍干程序(即凍干發(fā)酵劑的制備)
[0039]將R23在LHR20培養(yǎng)基中活化15_18h，之后將菌液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，并置于6000r/min、5°C條件下離心lOmin，離心結(jié)束后棄上清液留菌泥；以“復(fù)合保護(hù)劑:菌泥=3:1”的體積比將菌泥與復(fù)合保護(hù)劑混合，制成菌懸液，并按“2mL菌懸液/15mL西林瓶”分裝入西林瓶中，之后置_40°C下預(yù)凍24h，得預(yù)凍好的菌劑；用75%酒精擦洗冷真空凍干燥機(jī)進(jìn)行消毒，待開機(jī)預(yù)冷30min后，立即將預(yù)凍好的菌劑放入真空冷凍干燥機(jī)中，蓋好蓋子，立即開始抽真空，進(jìn)入真空冷凍干燥過程，且凍干條件為:真空度0.2mbar,冷凍溫度-50°C，凍干時間24h ;在真空狀態(tài)下將蓋子壓緊，取出，即獲得乳酸菌凍干發(fā)酵劑。
[0040]1.2.8凍干發(fā)酵劑保藏穩(wěn)定性測試[0041]依據(jù)1.2.7凍干發(fā)酵劑的制備過程，將R23、RF17和R37分別制成凍干發(fā)酵劑，并分別于4-6°C下保存一年，每隔3個月測定各凍干發(fā)酵劑的細(xì)胞存活率，同時將各凍干發(fā)酵劑等量接種于降酸試驗培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)18h后，測定其總酸，計算發(fā)酵前后的降酸量，分析各凍干發(fā)酵劑在保藏過程中的穩(wěn)定性。
[0042]2結(jié)果與分析
[0043]2.1均勻試驗結(jié)果
[0044]用均勻設(shè)計法考察各成分甘油(X1)、谷氨酸鈉(X2)、蘋果酸鈉(X3)、海藻糖(X4)、乳糖(X5)、山梨醇(X6)對植物乳桿菌R23凍干后細(xì)胞存活率的影響，具體因素水平及實驗設(shè)計見表1和表2。
[0045]表1均勻設(shè)計U7 (76)因素水平表
【權(quán)利要求】
1.一種MLF乳酸菌凍干發(fā)酵劑的復(fù)合保護(hù)劑，其特征在于:該復(fù)合保護(hù)劑的成分及成分含量為:脫脂乳粉10g、甘油2.5g、谷氨酸鈉1.0g、蘋果酸鈉2.2g、海藻糖1.0g、山梨醇1.0g,水 IOOmL0
2.—種MLF乳酸菌凍干發(fā)酵劑的復(fù)合保護(hù)劑的制備方法，其特征在于:其包括如下具體操作: (1)依據(jù)權(quán)利要求1所述的成分含量準(zhǔn)確稱量該復(fù)合保護(hù)劑的各成分，備用； (2)先將稱量好的谷氨酸鈉溶解于盛有IOOmL水的燒杯中，接著將甘油、蘋果酸鈉、海藻糖及山梨醇加入，并用玻璃棒攪拌使之徹底溶解；然后放入脫脂乳粉，再加8-10粒玻璃珠，使脫脂乳粉充分混勻，混勻后將玻璃珠分離出并將混合液倒于三角瓶中，加硅膠塞，于105±2°C下濕熱滅菌10~15min，冷卻至室溫即可獲得所述復(fù)合保護(hù)劑。
【文檔編號】C12N1/04GK103667063SQ201310682133
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】任香蕓, 梁璋成, 何志剛, 林曉姿, 李維新, 魏巍, 林曉婕 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所