一種快速鑒定薔薇屬植物染色體數(shù)目的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種快速鑒定薔薇屬植物染色體數(shù)目的方法，所述方法包括取材、預(yù)處理、固定、解離、染色、壓片和鏡檢等步驟，其中，在壓片步驟中，將壓片過程數(shù)字化，以28至34N的力垂直敲擊材料上的蓋玻片160至200次為最好。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述方法采用莖尖和/或花芽作為染色體計數(shù)分析的材料。在一些優(yōu)選的實施方式中，材料在上午9:00至11:00或者下午3:00至4:00獲取。在一些實施方式中，所述方法采用電鏡掃描確認材料的生長點及其位置。本發(fā)明的方法具有取材多樣化、壓片精確和快速準確高效等優(yōu)點，特別適合于大批量薔薇屬植物染色體數(shù)目的快速而準確的鑒定。于大批量薔薇屬植物染色體數(shù)目的快速而準確的鑒定。
【專利說明】一種快速鑒定薔薇屬植物染色體數(shù)目的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及鑒定植物尤其是薔薇屬植物的染色體數(shù)目的方法，屬于植物細胞生物學(xué)和細胞遺傳學(xué)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]染色體是基因的載體，制備染色體標本是細胞遺傳學(xué)的基礎(chǔ)，優(yōu)良的染色體制片技術(shù)，更是進行染色體顯帶、組型分析、原位雜交等的先決條件。植物細胞染色體的觀察和分析，對于染色核型分析、減數(shù)分裂過程中染色體行為分析、細胞融合培養(yǎng)過程中染色體行為和細胞變異等遺傳現(xiàn)象的分析具有重要的意義。另外，基因工程育種在基因水平上產(chǎn)生的變異，也可以通過以染色壓片為基礎(chǔ)的染色體分帶、原位雜交、熒光原位雜交進行基因定位。
[0003]鑒定植物的染色體數(shù)目是染色體分析的一種非常重要的分析，一般經(jīng)常采用生長活躍的材料組織進行。莖尖和根尖通常被認為是生長活躍的組織，是有絲分裂的高發(fā)區(qū)，因而成為染色體計數(shù)常用的材料。相對于根尖和莖尖而言，花芽很少作為染色體計數(shù)分析的材料，原因可能是花芽中存在的色素等物質(zhì)干擾，需要特殊的更加耗時耗力的前處理，而且取材時間受到更多的限制，如破壞植株的生長狀態(tài)。
[0004]薔薇屬(Rosa)植物是世界著名的觀賞植物，包括薔薇、月季和玫瑰等，該屬有200多個種，廣泛分布于寒溫帶至亞熱帶地區(qū)。作為世界性的觀賞植物之一，薔薇屬植物的栽培品種有30000多個，遺傳背景非常復(fù)雜，染色體數(shù)目及倍性差異較大，目前已知有2，3，4，5，6，8和10倍體和非整倍體等，這是造成遠緣雜交不親和與雜種高度不育的主要原因，也是人們通過雜交育種獲得優(yōu)良目標性狀的主要障礙。因此，在雜交育種前很有必要對親本材料進行染色體倍性鑒定。但是，由于薔薇屬植物為木本，且遺傳背景復(fù)雜性，染色體為中小型，導(dǎo)致染色體計數(shù)分析難度大，鑒定草本植物例如香石竹的染色體數(shù)目的方法無法有效地應(yīng)用于薔薇屬植物。另外，薔薇屬植物不易取到合適的材料、材料的組織細胞難以解離，造成染色體計數(shù)結(jié)果不準確、不穩(wěn)定甚至無法計數(shù)，而且計數(shù)時間長，不適合快速準確地進行大批量品種的染色體數(shù)目鑒定。
[0005]常用于的鑒定植物染色體的材料是根尖，但薔薇屬植物的種子萌發(fā)比較困難，且實生后代有變異，尤其是月季(Rosa Hybrida)。另外薔薇屬很多種或品種扦插生根困難，扦插周期長，費時費力，產(chǎn)生的不定根容易木質(zhì)化，不易把握取材時間，并且在做鏡檢時，顯微鏡視野中分裂相細胞少，染色體分散不良，難以進行染色體計數(shù)。雖有人報道用薔薇屬植物的幼嫩莖尖做材料，但是由于莖尖生長點的分裂相細胞數(shù)目有限，準確取材困難，且存在著組織細胞不易 解離以及細胞內(nèi)含物或分泌物干擾壓片效果等問題。在香石竹上可用花蕾鑒定染色體數(shù)目，但尚未見到利用薔薇屬植物的花芽作為染色體計數(shù)分析的材料的報道。
[0006]盡管薔薇屬植物的染色體數(shù)目計數(shù)分析難度很大，但非常重要。尤其是需要開發(fā)出準確快速鑒定薔薇屬植物染色體的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是為了解決上述問題中的一個或者全部問題。為此，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0008]1.一種鑒定薔薇屬植物的染色體數(shù)目的方法，所述方法依次包括如下步驟:
[0009]( I)取材步驟:獲取來自薔薇屬植物的材料；
[0010](2)預(yù)處理步驟:使用預(yù)處理液對所述材料進行處理；
[0011]( 3 )固定步驟:使用固定液對所述材料進行固定；
[0012](4)解離步驟:使用解離溶液對所述材料進行解離；
[0013](5)染色步驟:使用染色溶液對所述材料進行染色；
[0014](6)壓片步驟:對所述材料進行壓片；和
[0015](7)鏡檢步驟:通過使用顯微鏡對所述材料進行檢測來確定所述材料的細胞中的染色體的數(shù)目；
[0016]其中，在所述壓片步驟中，以28至34N的力對所述材料上的蓋玻片垂直敲擊160至200次。
[0017]2、如技術(shù)方案I所述的方法，其中，所述敲擊分為依次進行的第一遍敲擊和第二遍敲擊，并且使用帶有橡皮末端的未削鉛筆進行，所述第一遍敲擊以28N至34N的力垂直敲擊所述材料上的蓋玻片80-10·0次，所述第二遍敲擊以相同的力度和次數(shù)進行垂直敲擊，并且所述第一遍敲擊使用所述鉛筆的橡皮末端進行，所述第二遍敲擊采用所述鉛筆的另一末端進行。
[0018]3、如技術(shù)方案I或2所述的方法，其中，所述壓片步驟通過如下方式進行:將經(jīng)染色的所述材料放置在載玻片上，然后滴上45體積％的醋酸溶液，蓋上蓋玻片，用吸水材料吸走多余的溶液，蓋上一層濾紙，左手按住蓋玻片的一端，右手拿鉛筆依次進行所述第一遍敲擊和所述第二遍敲擊，最后將蓋玻片壓平并去掉濾紙。
[0019]4、如技術(shù)方案I至3中任一項所述的方法，其中，所述材料為經(jīng)過電鏡掃描預(yù)檢測確認具有生長點的材料和/或經(jīng)過電鏡掃描預(yù)檢測確認了生長點位置的材料。
[0020]5、如技術(shù)方案I至4中任一項所述的方法，其中，所述材料為選自由根尖、莖尖或花芽組成的材料，優(yōu)選的是，所述材料為莖尖和/或花芽；更優(yōu)選的是，所述材料為花芽。
[0021]6、如技術(shù)方案I至5中任一項所述的方法，其中，所述材料在上午9:00-11:00或下午3:00至4:00的時間獲取，并且為莖尖和/或花芽，更優(yōu)選為花芽。
[0022]7、如技術(shù)方案I至6中任一項所述的方法，其中，所述莖尖取自于一年生主枝條和/或兩年生側(cè)枝條；優(yōu)選的是，所述莖尖是長度為1.5mm至3mm的頂芽物，所述花芽是高度為1.5mm至2.5mm的花芽頂端組織。
[0023]8、如技術(shù)方案I至7中任一項所述的方法，其中，所述預(yù)處理液為由選自由對二氯苯、8-羥基喹啉、秋水仙素和α-溴萘等組成的組的預(yù)處理劑配制的溶液，優(yōu)選的是，所述預(yù)處理液為對二氯苯飽和水溶液。
[0024]9、如技術(shù)方案I至8中任一項所述的方法，其中，所述預(yù)處理步驟通過如下方式進行:用解剖刀將所述材料切成兩個部分，放入裝有對二氯苯飽和水溶液的容器中，用封口膜將所述容器密封，使用注射器抽氣至所述材料沉入處理液底部，再在20°C至25°C預(yù)處理2小時至3小時，然后用去離子水進行清洗。[0025]10、如技術(shù)方案I至9中任一項所述的方法，其中，所述固定步驟采用如下方式進行:將所述材料放置在裝有卡諾固定液的容器中并將該容器放置在冰盒中固定4小時至6小時，然后用水進行清洗，所述卡諾固定液由體積比例為3:1的無水乙醇和冰醋酸組成。
[0026]11、如技術(shù)方案I至10中任一項所述的方法，其中，所述解離步驟采用如下方式進行:使用0.8M至1.2M鹽酸水溶液于55°C至65°C水浴中對所述材料解離8分鐘至10分鐘，再用水進行清洗。
[0027]12、如技術(shù)方案I至11中任一項所述的方法，其中，所述染色步驟通過如下方式進行:將所述材料放置在裝有染液的容器中染色10分鐘至30分鐘，所述染液為卡寶品紅染液，然后用水進行清洗；優(yōu)選的是，所述染液的用量為剛好沒過所述材料。
[0028]13、如技術(shù)方案I至12中任一項所述的方法，其中，所述鏡檢步驟通過如下方式進行:使用100倍顯微鏡找到所述材 料的觀察目標范圍，然后使用400倍鏡尋找處于分裂期的細胞，再利用1000倍油鏡觀測染色體的數(shù)目；優(yōu)選的是，先利用1000倍油鏡拍攝圖片，然后再根據(jù)圖片對染色體進行計數(shù)。
[0029]本發(fā)明首次在取材前將材料進行電鏡掃描，使取材大小和位置更加精確、快速和高效；同時將花芽尤其是幼嫩花芽作為材料，使取材多樣化。這種事先對所取材料進行電鏡掃描可視化，以及將幼嫩花芽作為處理材料的方法適合更多扦插生根不易，多季開花的木本植物體細胞染色體觀察。
[0030]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有例如以下優(yōu)點:(I)取材準確，有必要時可先對材料進行電鏡掃描，使取材定位精準，直觀，解決了一直以來薔薇屬植物染色體觀察中存在的準確取材困難的問題。(2)取材多樣化，包括花芽和莖尖，可以擺脫取材時間的限制。(3)鑒定速度快，整個過程各步驟時間容易把控，可在一個工作日內(nèi)完成鑒定和/或能在24時內(nèi)得到鑒定結(jié)果。(4)鑒定費用低，材料預(yù)處理劑比較廉價，鑒定所用工具容易獲得，并可重復(fù)利用。(5)預(yù)處理效果好，用注射器對預(yù)處理容器抽真空，使材料的預(yù)處理時間縮短，效果更佳。(6)壓片技術(shù)精準，壓片時的敲擊力度和敲擊次數(shù)精確，使染色體分散均勻，計數(shù)準確，可重復(fù)性高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為莖尖電鏡掃描圖。A:生長點較少的莖尖(多花薔薇，薔薇類)；B:頂端生長點較多的莖尖(月月粉，月季花)；C:花芽(B卩，花序分生組織包含有幼嫩花蕾和正在發(fā)育的小花蕾)(月月粉，月季花)。
[0032]圖2為不同取材時間在400倍下可觀察到的分裂相的細胞數(shù)目統(tǒng)計曲線圖，其中所使用的材料為多花薔薇；取材位置為莖尖；每間隔Ihr取材一次。對一個視野中處于分裂相的細胞進行計數(shù)。結(jié)果顯示取材優(yōu)選在上午9:00-11:00或者下午3:00至4:00進行,尤其以上午9:00-11:00取材的效果最好。
[0033]圖3:A:月月粉花芽(2n=2x=14) ;B:月月粉莖尖(2n=2x=14) ;C:多花薔薇(2n=3x=21);D:薩曼莎(4n=28);E:白玉堂缺失兩條染色細胞(2n=12)H:白玉堂(2n=2x=14);F:壓片力度和敲打次數(shù)不夠，染色體和細胞分散不均勻；G:狗薔薇(2n=5x=35) ；1:壓片力度，敲片次數(shù)和取材時間均采用本發(fā)明的方法進行時在400倍光鏡下細胞情況。【具體實施方式】
[0034]如上所述，薔薇屬植物由于遺傳背景復(fù)雜，植物組織干擾物多，染色體小，計數(shù)分析存在取材不理想、分析周期長、可重復(fù)性差、結(jié)果不準確，不適合進行大批量材料的染色體計數(shù)等問題。另一方面，薔薇屬植物的染色體分析對例如育種又非常的重要和必要。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中薔薇屬植物染色體計數(shù)分析所存在的例如上述諸多問題，本發(fā)明人在這方面進行了長期的觀察和研究，最終開發(fā)出了一種快速準確鑒定薔薇屬植物的染色體數(shù)目的方法。
[0035]本發(fā)明提供了一種快速準確鑒定薔薇屬植物的染色體數(shù)目的方法，所述方法包括如下步驟:
[0036]( I)取材步驟:獲取來自薔薇屬植物的材料；
[0037](2)預(yù)處理步驟:使用預(yù)處理液對所述材料進行處理；
[0038]( 3 )固定步驟:使用固定液對所述材料進行固定；
[0039](4)解離步驟:使用解離溶液對經(jīng)固定的所述材料進行解離；
[0040](5)染色步驟:使用染色溶液對經(jīng)解離的所述材料進行染色；
[0041](6)壓片步驟:對經(jīng)染色的所述材料進行壓片；和
[0042](7)鏡檢步驟:通過使用顯微鏡對經(jīng)壓片的所述材料進行檢測來確定所述材料的細胞中的染色體的數(shù)目；
[0043]其中，在所述壓片·步驟中，以28至34N (例如可以為28、29、30、31、32、33或34N(牛頓))的力垂直敲擊所述材料上的蓋玻片160至200次(例如160、165、170、175、180、185、190、195 或 200 次)。
[0044]在一些優(yōu)選的實施方式中，所述敲擊分為依次進行的第一遍敲擊和第二遍敲擊，并且使用帶有橡皮末端的未削鉛筆進行，所述第一遍敲擊以28N至34N(例如可以為28、29、30、31、32、33或34N(牛頓))的力垂直敲擊所述材料上的蓋玻片80-100次(例如可以為80、85,90,95或100次)，所述第二遍敲擊優(yōu)選以相同的力度和次數(shù)進行垂直敲擊，并且所述第一遍敲擊使用所述鉛筆的橡皮末端進行，所述第二遍敲擊采用所述鉛筆的沒有橡皮的另一末端進行。當然，也可以采用別的工具來代替帶有橡皮的未削鉛筆來敲擊，但是優(yōu)選敲擊用的工具具有彈性部位和剛性部位，所述第一遍敲擊采用彈性部位進行，使所取材料大塊組織能夠緩沖分散開成一個個細胞，并能將各個細胞壓扁；所述第二遍敲擊采用剛性部位進行，使第一遍敲擊分散開的細胞鋪展到一個平面上，利于后期鏡檢觀察和拍照。
[0045]在一些實施方式中，所述壓片步驟例如可以通過如下方式進行:將經(jīng)染色的所述材料放置在載玻片上，然后滴上45體積％的醋酸溶液，蓋上蓋玻片，用吸水材料(例如濾紙)吸走多余的溶液，蓋上一層濾紙，左手按住蓋玻片的一端，固定蓋玻片，防止其滑動；右手拿鉛筆依次進行所述第一遍敲擊和所述第二遍敲擊，最后例如用拇指將蓋玻片壓平并去掉濾紙。
[0046]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，薔薇屬植物的染色體計數(shù)分析的一個關(guān)鍵之處在于是否能夠在保證細胞的完整性的情況下使材料組織能夠充分解離并且染色體能夠充分分散，這一點與制片過程中的壓片步驟尤其是壓片力度的關(guān)系尤其緊密。壓片力度不足，組織細胞展開的效果差，導(dǎo)致鏡檢困難甚至無法得到準確的結(jié)果；壓片力度過大，同樣可能由于細胞的完整性遭到破壞而無法得到單個細胞的染色體數(shù)目。因此，本發(fā)明人通過將壓片所需的總力度分解為采用特定的力度和敲擊次數(shù)的組合。由于對壓片的力度和次數(shù)進行數(shù)字化，因此可以在保證細胞完整的情況下，使壓片效果更佳，所得結(jié)果的重復(fù)性更好，也方便于將本發(fā)明方法進行機械化操作。
[0047]另外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，鑒定薔薇屬植物的染色體數(shù)目的另一個關(guān)鍵之處在于材料的獲取。如果取材不當，后期處理可能需要很長的時間，例如現(xiàn)有技術(shù)中有的甚至需要放置在冰水中20小時以上，有時甚至可能無法得到所需要的結(jié)果。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用電鏡掃描對材料進行預(yù)檢測以確認該材料的生長點情況或者生長點的位置，如此可以起到事半功倍的效果。后來，從大量的電鏡掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，莖尖(請參見圖1A和1B)和花芽(如圖1C)如果取材適當、壓片合理，非常適合用來分析染色體數(shù)目。尤其是對于花芽，一般認為花芽含有色素等干擾物質(zhì)多，不適合于染色體數(shù)目的分析，盡管后來在其他植物中也有采用花芽來進行染色體數(shù)目分析的報道，但是采用所報道的方法來對薔薇屬植物的染色體數(shù)據(jù)進行分析卻沒有獲得成功。后來本發(fā)明進行了不斷的嘗試，終于找到能夠以花芽為材料分析染色體的方法，并且獲得了非常理想的結(jié)果。因此，在一些實施方式中，所述材料優(yōu)選為莖尖和/或花芽；更優(yōu)選的是，所述材料為花芽。
[0048]在一些實施方式中，所述莖尖和/或花芽取自于一年生主枝條和/或兩年生側(cè)枝條；優(yōu)選的是，所述莖尖是長度為1.5mm至3mm的頂芽物(如圖版1A，B)，所述花芽是高度為
1.5_至2.5_的花芽花序頂端組織(如圖版1C)。例如，可以取露天栽培生長旺盛的頂端包裹緊實圓潤的長度為1.5-3mm的頂芽(含側(cè)芽)以及生長圓潤的長度為1.5-2.5mm的幼嫩花芽。取材時優(yōu)選選取莖頂端包裹緊實圓潤的莖尖，莖頂端分生組織較多。也可以同時借助于電鏡掃描的手段通過將外部形態(tài)和微觀形態(tài)相結(jié)合，使取材更精確化，這樣可以縮小所取材料的體積，縮短預(yù)處 理時間，壓片效果更好。
[0049]另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，合理的取材時間可以使材料更適合于染色體數(shù)目的鑒定。在一些實施方式中，所述材料在上午9:00-11:00或下午3:00至4:00的時間獲取，更優(yōu)選在上午10:00進行取材(請參見圖2)。另外優(yōu)選的是，所述材料為莖尖和/或花芽，更優(yōu)選為花芽。
[0050]本發(fā)明對預(yù)處理液沒有特別的限制，可以使用本領(lǐng)域常用的預(yù)處理劑，例如可以使用選自由對二氯苯、8-羥基喹啉、秋水仙素和α-溴萘等組成的組的預(yù)處理劑。其中，秋水仙素常用濃度是:0.05%-0.2%，適用范圍廣，對大、中、小型植物染色體預(yù)處理均有好的效果。但是該試劑劇毒，見光易分解，且價格昂貴。8-羥基喹啉,常用濃度為0.002mol/L,適用于中小型染色體的植物，但是它的效力比較溫和，使用該試劑進行預(yù)處理的時候，需要的預(yù)處理時間比較長，一般是4-6小時，并且累計中期染色體的數(shù)目不如其他預(yù)處理劑高。α -溴萘比較適合禾本科和水生植物的預(yù)處理，其他植物應(yīng)用比較少。對二氯苯飽和水溶液的作用效果比較強烈，使用范圍比較廣，適用于大、中、小型植物染色體觀察，且價格便宜，預(yù)處理時間短，更適合用于品種繁多的薔薇屬植物染色體的倍性的快速鑒定。于是，在一些優(yōu)選的實施方式中，所述預(yù)處理液為對二氯苯飽和水溶液。例如在一些實施方式中，所述預(yù)處理步驟可以通過如下方式進行:用解剖刀將所述材料切開成兩個部分，放入裝有對二氯苯飽和水溶液的容器中，用封口膜將所述容器密封，使用注射器抽氣至所述材料沉入到處理液的底部，再在20°C至30°C預(yù)處理2小時至3小時，然后用水進行清洗。預(yù)處理的溫度例如可以為20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30°C，處理時間可以例如為2、2.5或3小時。更優(yōu)選的是，預(yù)處理的溫度為25°C，并且預(yù)處理時間為2.5小時。如果處理溫度過高，則可能易于誘發(fā)染色體發(fā)生粘連；如果處理溫度過低，則可能無法使染色體快速濃縮。另外，如果處理時間過長，則易于誘導(dǎo)染色體粘連；如果處理時間短，則染色體濃縮程度不夠而不利于分離計數(shù)。
[0051]本發(fā)明對固定液沒有特別的限制，但是在一些優(yōu)選的實施方式中，將所述材料放置在裝有卡諾固定液的容器中并將該容器放置在冰盒中固定4小時至6小時，然后用水進行清洗，所述卡諾固定液由體積比例為3:1的無水乙醇和冰醋酸組成。
[0052]本發(fā)明對解離所用的解離溶液沒有特別的限制，但是優(yōu)選使用0.SM至1.2M鹽酸水溶液，例如0.8,0.9、1.0、1.1或1.2M的鹽酸水溶液，于55°C至65°C水浴中對所述材料解離8分鐘至10分鐘，再用水進行清洗。優(yōu)選的是，可以將解離溶液于例如50°C至70°C預(yù)熱兩分鐘，以使材料能夠更加快速地進入解離狀態(tài)。水浴的溫度例如可以為55、60或65°C，更優(yōu)選為60°C。如果溫度過高或者處理時間過長，則可能會造成染色體上DNA分子降解嚴重，染色體著色較淺，不利于觀察；如果溫度過低或者處理時間過短，則可能會使細胞分離不充分，細胞核和細胞質(zhì)著色反差不大，不易于壓片和觀察。 [0053]本發(fā)明對染色溶液沒有特別的限制，但是優(yōu)選使用卡寶品紅(也稱石碳酸品紅，是80年代常用的一種染色體染色劑，也是目前國內(nèi)應(yīng)用最廣泛的一種植物染色體染色劑，(請參見李懋學(xué)，“介紹一種核和染色體的優(yōu)良染色劑”，生物學(xué)通報，1982,5:53)染液。例如可以采用如下方式進行所述染色步驟:將所述材料放置在裝有作為染液的卡寶品紅染液的容器中染色10分鐘至30分鐘(例如可以10、15、20、25或30分鐘)，然后用水進行清洗。卡寶品紅染液可以通過以下方式進行配置:先配成三種原液，再配成染色液,原液A:3g堿性品紅溶于100ml70%酒精中；原液B:取原液A IOml加入到90ml 5%石炭酸水溶液中；原液C:取原液B 55ml，加入6ml冰醋酸和6ml福爾馬林(38%的甲醛)。其中，原液A和原液C可長期保存，原液B限兩周內(nèi)使用。染液的配制:取原液ClO — 20ml，加45%冰醋酸80_90ml，再加山梨醇1.8g，配成10%-20%濃度的石炭酸品紅液，優(yōu)選放置兩周后使用，效果顯著，如果配制后立即用，則著色能力稍差。
[0054]在一些優(yōu)選的實施方式中，所述染液的用量為剛好沒過所述材料。本發(fā)明方法染色充分，操作簡單、衛(wèi)生，并且染液可重復(fù)利用。
[0055]本發(fā)明對鏡檢步驟所使用的儀器沒有特別的限制，只要能夠清晰觀察到細胞的染色體數(shù)目即可，但是優(yōu)選的是該儀器具有拍攝功能，使得可以利用儀器對照片進行自動掃描觀察并分析染色的數(shù)目成為可能，從而可以免除采用人工的方式進行染色體計數(shù)的需要，由此使得本發(fā)明的方法更加適合于大批量的染色體數(shù)目計數(shù)分析。例如，在一些實施方式中，可以使用100倍顯微鏡找到所述材料的觀察目標范圍(例如，細胞分散、核區(qū)被染色的區(qū)域)，然后使用400倍鏡尋找處于分裂期的細胞，再利用1000倍(目鏡10x，物鏡IOOx)油鏡對染色體數(shù)目進行計數(shù)?；蛘呃?000倍油鏡拍攝圖片，最后再根據(jù)所拍攝的圖片對染色體進行計數(shù)。
[0056]在本發(fā)明方法的一些實施方式中，可以在取材前對莖頂端或者花芽進行電鏡掃描，方便快速準確取材；以幼嫩花芽作為材料可以使得取材多樣化。在本技術(shù)中所取材料是生長在自然狀態(tài)下的植物莖尖，在取材時，優(yōu)選控制各個步驟的處理時間，如此當天就可以得到檢測結(jié)果。在操作過程中，可以使用體積為20ml的帶橡膠塞的醫(yī)用瓶作為容器，并用一次性針管的針頭部位插入瓶中抽氣，使材料的預(yù)處理效果更好。另外，壓片時精確了敲片的力度(28-34N)和敲片的次數(shù)(80-100次)，制片效果較好，染色體分散均勻易計數(shù)，又不會導(dǎo)致染色體丟失，影響計數(shù)的準確性。一般情況下，如果壓片的力度超過34N和/或敲打次數(shù)高于100次時，細胞完整性不好，染色體會缺失而影響計數(shù)的準確性；當壓片的力度低于28N和/或敲打次數(shù)低于80次時，染色體分散性不好，難以計數(shù)。
[0057]在一些實施方式中，本發(fā)明可以通過如下方式進行:
[0058]在預(yù)檢測時，取材前先檢測植物的幼嫩一年生長枝條(或者稱為主枝條)、兩年生側(cè)枝萌發(fā)短枝條和花芽的頂端進行電鏡掃描，了解生長點分布位置和數(shù)量，確定該屬植物露地生長旺盛，一年生幼嫩長枝條，長度為1.5-3mm的頂芽物和長度為1.5-2.5mm外形圓潤飽滿的幼嫩花芽生長最旺盛，生長點最多，最適合做染色體計數(shù)。
[0059]取材在上午9:00至10:00或者下午3:00至4:00進行，取露天栽培生長旺盛的頂端包裹緊實圓潤的長度為1.5-3mm的頂芽(可以含側(cè)芽)及生長圓潤的長度為1.5-2.5mm的幼嫩花芽。取材時要選取莖頂端包裹緊實圓潤的莖尖，這樣的莖頂端分生組織較多。
[0060]預(yù)處理時，可以將頂芽和/或側(cè)芽或者花芽用解剖刀橫切成兩半，然后放入對二氯苯飽和水溶液里，用封口膜將醫(yī)用瓶口封住，注射器抽氣至材料沉入處理液底部，使預(yù)處理液與材料充分結(jié)合，提高預(yù)處理的效果。25°C左右預(yù)處理2.5h，用水清洗。
[0061]固定時，可以使用卡諾固定液(無水乙醇:冰醋酸=3:1)，優(yōu)選現(xiàn)用現(xiàn)配，在冰盒中固定4小時至6小時(例如可以為4小時、5小時或6小時),使細胞被充分殺死,再用水清洗。
[0062]解離時，可以將IM鹽酸水溶液預(yù)熱例如2分鐘，然后于例如60°C水浴中用其解離例如8分鐘至10分鐘，然后用水清洗。
[0063]染色時，可以使用卡寶品紅染液染色例如10分鐘至30分鐘。例如，可以將材料統(tǒng)一放在裝有染液的廢棄醫(yī)用瓶中，染色劑的量以剛剛沒過材料為佳。這樣不但節(jié)省染色劑，還方便衛(wèi)生，快捷，壓片效果更好。
[0064]壓片時，可以取染液里的材料，用45%醋酸和帶橡皮的鉛筆壓片。滴一滴醋酸溶液，小心蓋上蓋玻片，用吸水紙吸走多于的溶液。蓋上一層濾紙，左手按住蓋玻片的一端，固定。右手拿鉛筆，先用帶橡皮的鉛筆的橡皮端，用28-34N的力垂直敲打材料所在目標位置的蓋玻片80-100次左右，再用未削筆頭的一端相同力度相同次數(shù)敲片，最后用拇指按平，從而使細胞分散均勻，染色體能夠分布在同一個平面上。一般情況，壓片所需時間為4-6min每張片子，每個材料壓5-8張片子，30min左右一個材料。
[0065]鏡檢時，可以在100倍鏡下觀察，尋找觀察目標范圍，400倍鏡下尋找處于分裂期的細胞，1000倍油鏡(滴一滴松柏油)拍照。每張壓好的片子,觀察和拍照需要8-15min,每個材料需要Ih左右。
[0066]如果采用花芽作為材料，優(yōu)選使用幼嫩的花芽，例如為分化花芽之后且在減數(shù)分裂之前花芽(請參見圖1C)，該階段的植物處于花期，外形看不出來有花蕾和花序的形態(tài)，但是可以觀察到飽滿圓潤的頂端。
[0067]在清洗時，優(yōu)選都采用去離子水沖洗3-5遍，每遍清洗5min左右，清洗用具可以采用膠頭滴管緊貼瓶底，以防止材料隨液體被吸出。
[0068]本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當知曉本發(fā)明中所使用的飽和對二氯苯水溶液和卡寶品溶液。例如，可以參考例如李懋學(xué)等《作物染色體及其研究技術(shù)》(第I版，1996年8月)中的配制方法。
[0069]與傳統(tǒng)的薔薇屬植物采用頂芽進行染色體計數(shù)技術(shù)相比，本發(fā)明取材前例如可以對莖尖和幼嫩的花芽頂端進行電鏡掃描，使取材可視化和精確化，解決了莖尖取材困難，非分生細胞干擾，根尖木質(zhì)化程度高，種子生根困難，扦插生根周期長，根長和生根時間不易控制等問題。采用幼嫩花芽進行染色體壓片，取材方便，不會破壞植株的生長狀態(tài)，處于中期分裂相的細胞數(shù)目多，解決了薔薇屬植物莖尖維管組織干擾，染色體小，計數(shù)困難的難題。另外，本發(fā)明中，取材可以為自然狀態(tài)下的生長旺盛的頂芽和花芽。如果上午9:00開始取材，適當控制預(yù)處理、固定、解離、染色的時間，并采用上述壓片方法，可以在12h內(nèi)快速、高效、準確地鑒定出染色體的數(shù)目。此外，如果在取材前先進行電鏡掃描，使取材精確化，多樣化，節(jié)省時間，制片效率高，染色體分散均勻，易計數(shù)。當然，本發(fā)明也適合其他材質(zhì)木質(zhì)化程度高和多季開花的林木植物進行快速高效的染色體計數(shù)。
[0070]下文將通過實施例的方式對本發(fā)明進行進一步的說明，但是這些實施例僅以舉例方式給出，這些實施例不應(yīng)被理解為是對本發(fā)明的限制。
[0071]實施例
[0072]實施例中所使用的儀器和藥品均可以商購獲得，沒有使用專門的設(shè)備或者特制的藥品。所有試劑均購自北京化學(xué)試劑公司，本發(fā)明實施例中所使用的體視鏡為Nikon (尼康)smz800,染色觀察所使用的顯微鏡型號為Olympus (奧林巴斯)BX51。
[0073]實施例中用到的材料，在進行取材之前，均進行了電鏡掃描。其中實施案例3，4，6中的多花薔薇、白玉堂和狗薔薇屬于薔薇類，掃描結(jié)果為圖1A所示類型；實施案例2，5中月月粉和薩曼莎莖尖為月季類的，掃描電鏡確定為圖1B的類型；實施例1的月月粉花芽掃描電鏡結(jié)果為圖1C所示類型。
[0074]實施例1
[0075]以2倍體的月月粉(R.chinensis ‘Old Pink Daily’.)幼嫩花芽作為材料進行。
[0076]A、上午9:00，取露地栽培的處于花期的枝條頂端，外部形態(tài)圓形緊實的幼嫩花芽，在體視鏡下迅速剝?nèi)「叨葹?.0mm左右的材料。
[0077]B、使用對二氯苯，25°C處理3h。幼嫩花芽的頂端為未展開的花萼片，上面密被絨毛，在處理前用解剖刀在體視鏡下切掉頂端0.5mm，放入裝有20ml的飽和對二氯苯溶液中，用帶針頭的注射器抽真空至材料沉到預(yù)處理液底部，然后以去離子水清洗5遍。
[0078]C、使用卡諾固定液于冰盒中固定5小時,然后去離子水清洗5遍。
[0079]D、在60°C以IM鹽酸解離lOmin，然后去離子水清洗5遍。
[0080]E、染色:使用卡寶品紅染液染色20分鐘。材料統(tǒng)一放在裝有染液的容積為20ml的廢棄醫(yī)用玻璃瓶中，染色劑的量剛剛沒過材料。
[0081]F、取染液里的材料，滴一滴45%醋酸溶液，小心蓋上蓋玻片，用吸水紙吸走多余的溶液。蓋上一層濾紙，左手按住蓋玻片的一端，固定。右手拿鉛筆，先用帶橡皮的鉛筆端，用30N的力垂直敲打材料所在目標位置的蓋玻片90次(即，第一遍敲擊)，再用未削筆頭的一端相同力度相同次數(shù)敲片(即，第二遍敲擊)，最后用拇指壓平，使細胞分散均勻，染色體分布在同一個平面上。
[0082]G、鏡檢:在100倍鏡(Olympus, BX51，下同)下觀察，尋找觀察目標范圍，在400倍鏡(Olympus，BX51，下同)下尋找處于分裂期的細胞，1000倍油鏡(滴一滴松柏油)拍照(結(jié)果見圖3A)。
[0083]實施例2
[0084]以2倍體月月粉(R.chinensis ‘Old Pink Daily’.)莖尖作為材料。
[0085]上午9:00，取露地栽培的生長旺盛的一年生枝條頂端，在體視鏡下迅速剝?nèi)￠L度為1.5mm左右的莖。于對二氯苯飽和溶液中在25°C處理2.5h，去離子水清洗5遍；以IM的鹽酸解離8min。第一遍敲擊和第二遍敲擊均以28N的力度和80的次數(shù)進行；其余步驟同案例(I)中所述，結(jié)果請參見圖3B。
[0086]實施例3
[0087]以2倍體白玉堂(R.multiflora var.albo-plena)莖尖作為材料。
[0088]上午9:00,取露地栽培一年生幼嫩枝條頂部2cm,在體視鏡下一層一層剝?nèi)ブ車娜~片，露出莖頂端部位，用解剖刀切取前端長度為2.5_左右的頂端生長點部位。對二氯苯飽和溶液25°C處理3.0h0此材料新長出的幼嫩頂芽的葉片上面密被白色絨毛。卡諾固定液固定4小時，IM鹽酸水溶液解離9min。第一遍敲擊和第二遍敲擊均以34N的力度和100的次數(shù)進行。其余步驟同案例(I)中所述，結(jié)果請參見圖3E和3H。從結(jié)果中可以看到，2倍體的白玉堂染色體存在缺失問題，如圖3E中，2n=2x=12 ;圖3H中2n=2x=14。這些細胞來自相同的取材部位。由此可以看出，使用本發(fā)明方法可以檢測到細胞中染色體缺失的現(xiàn)象。
[0089]實施例4
[0090]以3倍體多花薔薇(R.multiflora, sp)莖尖作為材料。
[0091]上午9:00，取露地栽培的木質(zhì)化程度不高的，顏色翠綠，頂端包裹緊實的2cm幼嫩莖尖，在體視鏡用解剖刀切取頂端長度為2.5_左右的頂端生長點部位。對二氯苯飽和溶液25°C處理3h。該材料嫩葉周圍有白色細小的絨毛?？ㄖZ固定液固定3h，IM鹽酸水溶液解離lOmin。當?shù)谝槐榍脫艉偷诙榍脫艟?9N的力度和95的次數(shù)進行,其余步驟同案例(I)中所述時，結(jié)果請參見圖3C。當?shù)谝槐榍脫艉偷诙榍脫艟?5N的力度和80的次數(shù)進行，其余步驟同案例(I)中所述時，結(jié)果請參見圖3F。
[0092]實施例5
[0093]以4倍體薩曼莎(R.hybrid cv.Samantha)莖尖作為材料。
[0094]上午9:00，取露地栽培一年生幼嫩，葉片發(fā)紅枝條的頂部2cm，在體視鏡下迅速剝?nèi)￠L度為2.8mm左右的莖尖。對二氯苯飽和水溶液25°C處理2.5h，去離子水清洗5遍；卡諾固定液4h，IM鹽酸水溶液解離lOmin。第一遍敲擊和第二遍敲擊均以28N的力度和98的次數(shù)進行。其余步驟同案例(I)中所述，結(jié)果請參見圖D。當以400倍顯微鏡觀察時，所觀測的結(jié)果如圖31所示，從圖31可以看到，處于分裂期的細胞數(shù)目比較多。這也說明，采用本發(fā)明的方法，在取材前，使用掃描電鏡確定取材位置，對鑒定該屬植物染色體倍性是非常有效的。
[0095]實施例6
[0096]以5倍體的狗薔薇(R.canina)莖尖作為材料。
[0097]上午10:00，取露地栽培一年生幼嫩枝條的頂部2cm，在體視鏡下迅速剝?nèi)￠L度為
3.0mm左右的莖尖。對二·氯苯飽和水溶液25°C處理3h，去離子水清洗5遍；卡諾固定液固定4h，IM鹽酸水溶液解離lOmin，其余步驟同案例(I)中所述，結(jié)果如圖3G。[0098]如圖3所示，采用本發(fā)明方法檢測到了 2倍體白玉堂染色體缺失2n=2x=12 (圖版3E)，月月粉莖尖(2n=2x=14)，3倍體的多花薔薇莖尖(2n=3x=21) ;4倍體的薩曼莎莖尖(2n=4x=28)以及5倍體的狗薔薇莖尖(2n=5x=35)(圖3G)。
[0099]此外，結(jié)合掃描電鏡的結(jié)果，在取材的時候還發(fā)現(xiàn)，4倍體的薩蔓莎較2倍體月月紅莖頂端分生組織大，取材時可放大取材范圍。單季開花的薔薇類嫩葉上面有絨毛，頂芽較大，取材時可以優(yōu)選控制在3_左右。處于花期的植株，幼嫩花芽的外部形態(tài)圓潤飽滿，取材時容易識別，掃描電鏡結(jié)果請參考圖1C。
[0100]本發(fā)明在取材前對所取材料進行電鏡掃描，結(jié)合體視鏡的使用，將所取材料可視化，可以精確展現(xiàn)取材的大小和位置，解決細胞學(xué)研究中一直存在的取材困難的問題，這種方法也適合其他要進行細胞學(xué)研究的植物種類。取材時，幼嫩花芽作為預(yù)處理的材料，也可將其應(yīng)用到其他多季開花的木本植物中進行細胞染色觀察，多樣化取材。在預(yù)處理時例如使用的廢棄
[0101]廉價便宜，可重復(fù)利用，注射器抽真空處理效果更佳。本技術(shù)發(fā)明將壓片的力度精準到28-34N，壓片次數(shù)精準到80-100次，使壓片力度和次數(shù)字化，適合現(xiàn)有的細胞染色體壓片技術(shù)。染色時統(tǒng)一進 行，既方便衛(wèi)生，又節(jié)省染色劑，使染色效果更佳。
【權(quán)利要求】
1.一種鑒定薔薇屬植物的染色體數(shù)目的方法，所述方法依次包括如下步驟: (1)取材步驟:獲取來自薔薇屬植物的材料； (2)預(yù)處理步驟:使用預(yù)處理液對所述材料進行處理； (3)固定步驟:使用固定液對所述材料進行固定； (4)解離步驟:使用解離溶液對所述材料進行解離； (5)染色步驟:使用染色溶液對所述材料進行染色； (6)壓片步驟:對所述材料進行壓片； (7)鏡檢步驟:通過使用顯微鏡對所述 材料進行檢測來確定所述材料的細胞中的染色體的數(shù)目； 其中，在所述壓片步驟中，以28至34N的力對所述材料上的蓋玻片垂直敲擊160至200次。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述敲擊分為依次進行的第一遍敲擊和第二遍敲擊，并且使用帶有橡皮末端的未削鉛筆進行，所述第一遍敲擊以28N至34N的力垂直敲擊所述材料上的蓋玻片80-100次，所述第二遍敲擊以相同的力度和次數(shù)進行垂直敲擊，并且所述第一遍敲擊使用所述鉛筆的橡皮末端進行，所述第二遍敲擊采用所述鉛筆的另一末端進行。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述壓片步驟通過如下方式進行:將經(jīng)染色的所述材料放置在載玻片上，然后滴上45體積％的醋酸溶液，蓋上蓋玻片，用吸水材料吸走多余的溶液，蓋上一層濾紙，左手按住蓋玻片的一端，右手拿鉛筆依次進行所述第一遍敲擊和所述第二遍敲擊，最后將蓋玻片壓平并去掉濾紙。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中，所述材料為經(jīng)過電鏡掃描預(yù)檢測確認具有生長點的材料和/或經(jīng)過電鏡掃描預(yù)檢測確認了生長點位置的材料；優(yōu)選的是，所述材料為選自由根尖、莖尖或花芽組成的材料；更優(yōu)選的是，所述材料為莖尖和/或花芽；進一步優(yōu)選的是，所述材料為花芽；另外優(yōu)選的是，所述莖尖取自于一年生枝條；更優(yōu)選的是，所述莖尖是長度為1.5mm至3mm的頂芽的頂端組織，所述花芽是長度為1.5mm至2.5mm的花序頂端組織。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中，所述材料在上午9:00-11:00或下午3:00至4:00的時間獲取，并且為莖尖和/或花芽，更優(yōu)選為花芽。
6.如權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中，所述預(yù)處理步驟通過如下方式進行:用解剖刀將所述材料切開成兩個部分，放入裝有對二氯苯飽和水溶液的容器中，用封口膜將所述容器密封，使用注射器抽氣至所述材料沉入到處理液的底部，再在20°C至30°C預(yù)處理2小時至3小時，然后用水進行清洗。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中，所述固定步驟采用如下方式進行:將所述材料放置在裝有卡諾固定液的容器中并將該容器放置在冰盒中固定4小時至6小時，然后用水進行清洗，所述卡諾固定液由體積比例為3:1的無水乙醇和冰醋酸組成。
8.如權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其中，所述解離步驟采用如下方式進行:使用0.8M至1.2M鹽酸水溶液于55°C至65°C水浴中對所述材料解離8分鐘至10分鐘，再用水進行清洗。
9.如權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，其中，所述染色步驟通過如下方式進行:將所述材料放置在裝有染液的容器中染色10分鐘至30分鐘，所述染液為卡寶品紅染液，然后用水進行清洗；優(yōu)選的是，所述染液的用量為剛好沒過所述材料。
10.如權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其中，所述鏡檢步驟通過如下方式進行:使用100倍顯微鏡找到所述材料的觀察目標范圍，然后使用400倍鏡尋找處于分裂期的細胞，再利用1000倍油鏡觀測染色體的數(shù)目；優(yōu)選的是，先利用1000倍油鏡拍攝圖片，然后再根據(jù)圖 片對染色體進行計數(shù)。
【文檔編號】C12Q1/68GK103710439SQ201310684352
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】趙梁軍, 寇亞平, 趙宏偉, 高彬 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)