一種體外擴增γδT細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及γδT細胞培養(yǎng)方法，具體涉及一種體外擴增γδT細胞的方法，該方法的操作步驟如下：抗TCRγδ抗體和CD28McAb預(yù)先包被T75培養(yǎng)瓶，備用。分離患者外周血單個核細胞（PBMC），用含5%自體血漿的無血清培養(yǎng)基將PBMC濃度調(diào)整為1×106/ml，再將PBMC細胞懸液轉(zhuǎn)入T75培養(yǎng)瓶中，加入含有適當(dāng)濃度Zoledronat，HSP70，Toll-like?Receptors7(TLR7)配體、左旋咪唑（Levamisole，LMS）、IL-2，IL-7，IL-15的初始培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的飽和濕潤環(huán)境中培養(yǎng)，根據(jù)細胞的生長情況，每2～3天更換培養(yǎng)基，將細胞濃度控制在2.5×106/ml左右，同時全量補充Zoledronat，HSP70，Toll-like?Receptors7(TLR7)配體、左旋咪唑（Levamisole，LMS）、IL-2和IL-7，IL-15，持續(xù)培養(yǎng)12～16天后，即可獲得大量較高純度的γδT細胞。
【專利說明】一種體外擴增Y S T細胞的方法
[【技術(shù)領(lǐng)域】]
[0001]本發(fā)明涉及Y 6 T細胞培養(yǎng)方法，具體涉及一種體外擴增Y 6 T細胞的方法。
[【背景技術(shù)】]
[0002]根據(jù)T細胞表面受體(TCR)的不同可將T淋巴細胞分為兩種:a PT淋巴細胞和
YS T淋巴細胞。在人體中，a PT淋巴細胞是參與免疫應(yīng)答的主要細胞群，占成熟T細胞的90~95%，而Y 6 T細胞僅占外周血T淋巴細胞的0.5%_5%，但、6 T細胞是先于a運T細胞出現(xiàn)的，主要分布于皮膚，小腸、食道、肺和生殖器官等上皮組織內(nèi)。Y S T細胞屬于機體的第一線防御細胞，在抗微生物感染免疫，尤其是在皮膚黏膜表面的免疫防御功能中，以及抗分枝桿菌感染中發(fā)揮重要作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，Y S T細胞具有無MHC限制性的殺瘤作用，對多種自體、同種異體或異種腫瘤細胞均表現(xiàn)出顯著的殺傷活性，因此，Y ST細胞作為一類重要的腫瘤過繼免疫治療的候選細胞正在引起越來越多國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。但是另一方面，由于Y S T細胞在人體中所含比例較低，分離純化到大量的Y S T細胞較為困難，因而限制了其臨床使用。因此Y ST細胞體外高效擴增是解決這一問題的主要方法。
[0003]在這一領(lǐng)域，人們做了很多有益的嘗試，國內(nèi)在體外培養(yǎng)擴增Y 6 T細胞通常采用IPP和IL-2共刺激法，但因費用相對昂貴且擴增倍數(shù)不足而未被廣泛使用。
[0004]因此，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種新的Y ST細胞的方法，該方法操作簡便，價格便宜，擴增Y 6 T細胞效率高。
[
【發(fā)明內(nèi)容】
]`[0005]本發(fā)明的目的是提供一種體外高效擴增Y 6 T細胞的方法，提高Y 6 T細胞的純度和殺傷活性，使Y S T細胞更適用于臨床。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，設(shè)計一種體外擴增Y 6 T細胞的方法，
[0007]用抗TCR Y 6抗體和⑶28McAb預(yù)先包被T75培養(yǎng)瓶以備用；
[0008]將外周血單個核細胞轉(zhuǎn)入包被的T75培養(yǎng)瓶中，加入含有濃度為1.00 u g/ml~
3.87 u g/ml 的唑來膦酸、10 u g/ml ~ 50 u g/ml 的 HSP70、0.1 u g/ml ~10u g/ml 的 TLR7配體、0.1 u g/ml ~ 5.0u g/ml 的左旋咪唑、10ng/ml 的 IL_7、50ng/ml 的 IL-15 和 1000IU/ml的IL-2的無血清培養(yǎng)基，放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)12~16天后獲得大量較高純度的
YS T細胞。
[0009]上述方法還具有如下優(yōu)化方案:
[0010]所述唑來膦酸在無血清培養(yǎng)基中的濃度為1.29 U g/ml。
[0011]所述HSP70在無血清培養(yǎng)基中的濃度為20 u g/ml。
[0012]所述TLR7配體的濃度為1.0 ii g/ml。
[0013]所述LMS 的濃度為 0.5 ii g/ml。
[0014]本發(fā)明提供了一種新的Y S T細胞的體外培養(yǎng)方法，與常規(guī)培養(yǎng)方法相比，本方法的優(yōu)越之處有以下幾點:[0015](I)采用抗TCRy 8抗體和^28110413兩種抗體包被，抗1'0?￥ 8抗體提供了、ST細胞活化的第一信號，CD28McAb則為Y S T細胞的活化提供了共刺激信號，使靜息的、ST細胞得到充分的激活；
[0016](2) TCRy 6具有龐大的序列多態(tài)性，目前已有兩類分子被證實是TCR Y 6配體:含磷酸基的非肽類小分子和熱休克蛋白；用IPP刺激Y 6 T細胞時所需濃度較高，加之IPP的價格昂貴，如果培養(yǎng)至臨床所需要的細胞數(shù)量則培養(yǎng)成本較高，而唑來膦酸(Zoledronat)可以在較低的濃度下激活細胞,所以選擇使用合適濃度的Zoledrona來刺激Y 6 T細胞，使其大規(guī)模培養(yǎng)成為可能；HSP70不僅能攜帶特異性腫瘤抗原，還可作為抗原呈遞分子直接將抗原肽呈遞給Y 6 T細胞，使其活化增殖，發(fā)揮細胞毒和分泌細胞因子的雙重功能；
[0017](3)佐劑的應(yīng)用。
[0018]Toll樣受體(TLRs)是非特異性免疫系統(tǒng)的重要參與者，也是非特異性免疫和特異性免疫的主要橋梁。TLRs廣泛表達于免疫細胞，TLRs的配體作為佐劑能激活機體的天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)機體的Thl類反應(yīng)，從而加速病原體的清除和腫瘤細胞的凋亡。
[0019]大量研究顯示LMS具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)活性，作為佐劑能可使免疫功能低下機體免疫功能恢復(fù)正常，增強正常機體細胞免疫和體液免疫功能。其免疫調(diào)節(jié)活性作用機理在于:具有擬膽堿能樣活性，且該活性與其分子結(jié)構(gòu)中的咪唑基團有關(guān)；誘導(dǎo)機體產(chǎn)生各種淋巴因子，促進T淋巴細胞的成熟；代謝產(chǎn)物具有清除自由基的功能，保護細胞免受氧化自由基的損傷。
[0020](4)IL-2、IL_7和IL-15三種細胞因子組合的應(yīng)用。IL-7是促進人類Y 6 T前體細胞增殖和促進Y 6 T分化成熟的重要`因子；IL-15是一種多功能的細胞因子，促進T細胞的增值，此外IL-15可抑制活化的T細胞和B細胞由于抗Fas抗體、細胞因子耗竭、地塞米松等因素所致的凋亡；IL-2是T細胞的生長因子；三種細胞因子的組合使用既降低了單種因子的用量，使培養(yǎng)成本無明顯提高，又保證了發(fā)揮作用的全面性，大幅提高了 Y ST細胞的增值倍數(shù)和毒性。
[【專利附圖】

【附圖說明】]
[0021]圖1是兩組培養(yǎng)方法下Y 6 T細胞擴增倍數(shù)的比較圖；
[0022]圖2是兩組培養(yǎng)方法下Y 6 T細胞純度的比較圖；
[0023]圖3是兩組培養(yǎng)方法下Y 6 T細胞對SGC-7901細胞殺傷活性的比較圖；
[【具體實施方式】]
[0024]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。本申請中的生產(chǎn)設(shè)備都是本領(lǐng)域的常用設(shè)備，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0025]實施例1:
[0026]一、外周血單個核細胞(PBMC)的分離與培養(yǎng)
[0027]機器采集PBMC，將采集的血樣轉(zhuǎn)至離心管；700g，IOmin離心分離，吸取上層血漿培養(yǎng)時備用；血樣標(biāo)本還原至原體積，混勻；稀釋血緩慢加在Ficoll上，900g,離心20min ；吸取分離液界面乳白色單個核細胞層；離心洗滌2次并計數(shù)；用Y 6 T初始培養(yǎng)基將細胞重懸至I X IOVml ;根據(jù)細胞的生長情況，每2~3天更換培養(yǎng)基，所用培養(yǎng)基為含5%自體血漿的無血清培養(yǎng)基。在37°C、5%C02的飽和濕潤環(huán)境中培養(yǎng)，根據(jù)細胞的生長情況，每2~3天更換培養(yǎng)基，將細胞濃度控制在2.5XlOVml左右，同時全量補充各種因子:其中試驗組補充唑來膦酸(Zoledronat), HSP70, Toll-like Receptors7 (TLR7)配體、左旋咪唑(Levamisole, LMS)、IL-2，IL-7 和 IL-15，常規(guī)組補充 IPP 和 IL-2，持續(xù)培養(yǎng) 12 ~16 天后，即可獲得大量較高純度的Y ST細胞。
[0028]二、實驗方法與常規(guī)方法的細胞擴增倍數(shù)的比較
[0029]分別在第0、4、8、12、14及16天從兩組取培養(yǎng)細胞，用臺盼藍染色后計數(shù)，將計數(shù)當(dāng)天的細胞總數(shù)除以培養(yǎng)前的細胞數(shù)(即第0天)，數(shù)值即為細胞的擴增倍數(shù)。
[0030]以此方法可以動態(tài)比較兩組細胞的擴增情況，結(jié)果如表1和圖1所示，在培養(yǎng)的第
4、8、12、14和16天，兩組的Y S T細胞均在擴增，但是每個時間點實驗組的Y S T細胞擴增情況均好于常規(guī)組，第14天時兩組均達到擴增最高點，其后細胞擴增速度變緩，第16天顯微鏡下可觀察到凋亡細胞碎片。
[0031]表1
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一種體外擴增Y S T細胞的方法， 用抗TCR Y 6抗體和⑶28McAb預(yù)先包被T75培養(yǎng)瓶以備用； 其特征在于該方法由以下步驟組成: 將外周血單個核細胞轉(zhuǎn)入包被的T75培養(yǎng)瓶中，加入含有濃度為1.00iig/ml~3.87 u g/ml 的唑來膦酸、10 u g/ml ~ 50 u g/ml 的 HSP70、0.1 u g/ml ~10u g/ml 的 TLR7配體、0.1 u g/ml ~ 5.0u g/ml 的左旋咪唑、10ng/ml 的 IL_7、50ng/ml 的 IL-15 和 1000IU/ml的IL-2的無血清培養(yǎng)基，放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)12~16天后獲得大量較高純度的YS T細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的體外擴增YS T細胞的方法，其特征在于所述唑來膦酸在無血清培養(yǎng)基中的濃度為1.29 u g/ml。
3.如權(quán)利要求1所述的體外擴增YS T細胞的方法，其特征在于所述HSP70在無血清培養(yǎng)基中的濃度為20 u g/ml。
4.如權(quán)利要求1所述的體外擴增YS T細胞的方法，其特征在于所述TLR7配體的濃度為 1.0 ii g/ml o
5.如權(quán)利要求1所述的體外擴增YS T細胞的方法，其特征在于所述LMS的濃度為0.5 u g/mlo
【文檔編號】C12N5/0783GK103756962SQ201310684682
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月13日
【發(fā)明者】解尚云, 葉永清, 譚令兵 申請人:上?？氯R遜生物技術(shù)有限公司