一種體外擴增nk細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種NK細胞的培養(yǎng)擴增方法，具體為一種用自體外周血單個核細胞在體外培養(yǎng)大量擴增NK細胞的方法，該方法利用不同的細胞因子組合達到增殖和活化NK細胞的目的。具體為將自體外周血單個核細胞接種在抗CD3、CD16抗體預(yù)包被的培養(yǎng)瓶中刺激16～24h，加入含IL-2和IL-18的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。本發(fā)明將抗CD3、CD16抗體包被固化，直接刺激活化NK細胞，顯著提高了NK細胞的殺傷毒性，僅通過IL-2和IL-18兩種細胞因子就實現(xiàn)了對NK細胞的激活和擴增，既保證了NK細胞的擴增倍數(shù)和細胞毒性，又大大降低了NK細胞的培養(yǎng)成本。
【專利說明】一種體外擴增NK細胞的方法
[【技術(shù)領(lǐng)域】]
[0001]本發(fā)明涉及一種用自體外周血單個核細胞在體外培養(yǎng)大量擴增NK細胞的方法，具體涉及一種利用不同濃度的細胞因子組合及處理方式達到增殖和活化NK細胞的目的。
[【背景技術(shù)】]
[0002]自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)是屬淋巴細胞譜系,含有穿孔蛋白和粒酶顆粒的細胞毒淋巴細胞。其對靶細胞的識別無MHC限制性，無需預(yù)先致敏即可直接殺傷腫瘤細胞，也可分泌細胞因子調(diào)節(jié)其他免疫細胞的功能，是機體天然免疫的主要承擔者，也是獲得性細胞免疫的核心調(diào)節(jié)細胞，在腫瘤免疫、抗病毒感染及清除非己細胞中發(fā)揮重要作用。有研究證明自然殺傷細胞其實不僅是天然免疫系統(tǒng)中的重要作用成分，它同樣具有獲得性免疫細胞的一些特征。在免疫系統(tǒng)中，NK細胞反應(yīng)的速度比T細胞或B細胞要快，其作用機制主要是識別靶細胞，通過釋放穿孔素、顆粒酶和分泌多種細胞因子，迅速溶解某些腫瘤細胞，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫和造血作用以及直接殺傷靶細胞的作用。但由于NK細胞在人外周血中的含量極低及腫瘤組織中分布頻率較低(< 10% )，僅占單個核細胞的5%-10%，極大的限制了 NK細胞作為過繼免疫細胞在臨床上的應(yīng)用。多年來，人們一直嘗試能在體外實現(xiàn)NK細胞的大量擴增，但是目前的常規(guī)技術(shù)主要是在體外培養(yǎng)體系中加入IL-2、IL-12、IL-15和Y -1FN等因子組合來促進NK的擴增，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后僅可以使NK細胞擴增幾倍或十幾倍，純度亦不理想，因此也不能滿足實際的應(yīng)用。并且這種方法因子需求量較大，成本較高，培養(yǎng)效果不穩(wěn)定，不適合體外大規(guī)模的應(yīng)用。
[
【發(fā)明內(nèi)容】
]
[0003]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中NK細胞擴增后純度不理想、成本較高等問題，本發(fā)明提供一種新的NK細胞的體外擴增的方法`，可在體外培養(yǎng)條件下獲得大量的、應(yīng)用安全的、純度較高的以及殺傷活性強的NK細胞，從而使得該細胞達到能夠安全有效的應(yīng)用于臨床的質(zhì)量指標。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明設(shè)計一種體外擴增NK細胞的方法，其特征在于由以下步驟構(gòu)成:
[0005]a.將濃度為0.01~5.0mg/ml的CD3單克隆抗體、0.01~5.0mg/ml的CD16單克隆抗體包被在細胞培養(yǎng)瓶中，包被條件為室溫，孵育時間為0.5~12h ;
[0006]b.將從外周血中分離獲得的單個核細胞用無血清培養(yǎng)液接種在上述的細胞培養(yǎng)瓶中，刺激2~24h;
[0007]c.加入NK細胞培養(yǎng)用無血清培養(yǎng)液和濃度為15~50ng/ml的白細胞介素_2以及15~50ng/ml的白細胞介素_18，刺激12~72h，然后轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)；
[0008]d.收獲NK細胞。
[0009]本發(fā)明從臨床實際應(yīng)用可行性出發(fā)，在考慮安全性、有效性的前提下，通過對細胞來源、應(yīng)用的培養(yǎng)基類型、細胞因子組合以及NK細胞臨床上實際應(yīng)用時患者可接受成本等各方面綜合衡量，優(yōu)化出最佳NK細胞培養(yǎng)擴增方案，以期為能夠?qū)崿F(xiàn)NK細胞在臨床過繼免疫療法的大規(guī)模應(yīng)用，提高臨床療效并減輕患者經(jīng)濟負擔奠定基礎(chǔ)。
[0010]本發(fā)明采用抗CD3、CD16抗體預(yù)先包被細胞培養(yǎng)瓶的形式處理，起始細胞采用自體外周血單個核細胞，濃度優(yōu)選為1.0X 106/ml，在抗⑶3、⑶16抗體包被后的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)刺激16~24h，所述IL-2和IL-18的使用濃度優(yōu)選為15ng/ml。
[0011]所述抗⑶3抗體在包被液中的濃度為0.15mg/ml。
[0012]所述抗CD16抗體在包被液中的濃度為0.15mg/ml。
[0013]將從自體外周血中分離獲得的單個核細胞加入抗CD3、CD16抗體包被后的細胞培養(yǎng)瓶中刺激16h。
[0014]所述培養(yǎng)因子組合中所用白細胞介素-2濃度為15ng/ml。
[0015]所述培養(yǎng)因子組合中所用白細胞介素-18濃度為15ng/ml。
[0016]與常規(guī)的僅單純向培養(yǎng)體系中添加多種細胞因子的NK細胞培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0017]1.包被的抗⑶3、⑶16抗體，可以直接快速有效的使NK細胞受到信號刺激，活化NK細胞，促進細胞因子(TNF，IFN-Y等)的合成，顯著提高了 NK細胞的殺傷毒性。
[0018]2.轉(zhuǎn)袋處理:在包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3~5天后，再將細胞轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋中，這樣既可以保證NK細胞被充分激活，又避免了高濃度抗體對細胞的持續(xù)作用誘發(fā)的凋亡，并且同等條件下細胞培養(yǎng)袋的效果要優(yōu)于細胞培養(yǎng)瓶；
`[0019]3.僅僅通過IL-2和IL-18兩種細胞因子就實現(xiàn)了對NK細胞的激活和擴增，IL_2可刺激NK細胞表達大量的IL-2R a鏈，從而使NK細胞大量增殖，并且在IL2刺激下NK細胞表達黏附分子，使NK胞質(zhì)中的顆粒增加并促進絲氨酸酯酶mRNA的表達，從而提高NK細胞的細胞毒活性；而IL-18可以誘導(dǎo)NK細胞分泌IFN- y，并具有促進NK細胞的增殖、活化及Fas介導(dǎo)的殺傷功能，并且可通過胞內(nèi)的ITAM達到促進NK細胞活化的作用。常規(guī)NK細胞培養(yǎng)體系中使用的因子組合中還用到了 IL-12、IL-15和IFN-Y等，本發(fā)明僅在體外培養(yǎng)體系中使用了兩種細胞因子，既保證了 NK細胞的擴增倍數(shù)和細胞毒性，又降低了細胞培養(yǎng)的成本。
[【專利附圖】

【附圖說明】]
[0020]圖1是本發(fā)明與常規(guī)培養(yǎng)方法NK細胞擴增倍數(shù)的比較圖；
[0021 ] 圖2是本發(fā)明方法所得NK細胞純度圖；
[0022]圖3是常規(guī)培養(yǎng)方法所得NK細胞純度圖；
[0023]圖4是本發(fā)明與常規(guī)培養(yǎng)方法所得NK細胞對K562細胞殺傷活性的比較圖。
[【具體實施方式】]
[0024]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。本申請中的生產(chǎn)設(shè)備都是本領(lǐng)域的常用設(shè)備，應(yīng)當理解，下列所述的實施例僅用以例示本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。如無特殊說明，實施例中所用方法均為常規(guī)方法，所用儀器、材料、試劑等，如無特殊說明，均可通過商業(yè)途徑獲得。
[0025]實施例1[0026]一、外周血單個核細胞(PBMC)的分離和NK細胞的培養(yǎng)
[0027]預(yù)先在細胞培養(yǎng)瓶中加入含有抗⑶3、⑶16抗體的包被液，室溫孵育lh，抗體終濃度優(yōu)選為0.15mg/ml。
[0028]通過血細胞分離機采集患者外周血單個核細胞(PBMC)，將采集的血樣轉(zhuǎn)至離心管；700g，離心分離lOmin，吸取上層血漿培養(yǎng)時備用；用0.9%生理鹽水血樣將標本還原至原體積，混勻；將稀釋血緩慢加在Ficoll上，900g，離心20min ;吸取分離液界面乳白色單個核細胞層；離心洗滌2次并計數(shù)；用無血清培養(yǎng)基將PBMC重懸，并調(diào)整細胞濃度至
1.0 X106/ml。
[0029]轉(zhuǎn)入預(yù)先用抗⑶3、⑶16抗體包被的細胞培養(yǎng)瓶中刺激16h后，加入15ng/ml的IL-2 和 15ng/ml 的 IL-18 繼續(xù)培養(yǎng) 72h。
[0030]此后用含有0.5%人血白蛋白的無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為lX106/ml，補加IL-2和IL-18至原濃度，轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋中培養(yǎng)，每2-3天添加含相同濃度IL-2和IL-18的無血清培養(yǎng)基，維持細胞濃度在2X 106/ml左右，14天后即可得到大量擴增的高純度、高毒性的NK細胞。
[0031]二、本方法與常規(guī)方法的細胞擴增倍數(shù)的比較
[0032]分別在第0、7、14及21天從兩組取培養(yǎng)細胞，用臺盼藍染色后計數(shù)，將計數(shù)當天的細胞總數(shù)除以培養(yǎng)前的細胞數(shù)(即第O天)，數(shù)值即為細胞的擴增倍數(shù)。以此方法可以動態(tài)比較兩組細胞的擴增情況，結(jié)果如表1和圖1所示:在培養(yǎng)的第7、14、21天，本法的NK細胞擴增倍數(shù)均顯著高于常規(guī)組P < 0.01。
[0033]
【權(quán)利要求】
1.一種體外擴增NK細胞的方法，其特征在于由以下步驟構(gòu)成: a.將濃度為0.01~5.0mg/ml的CD3單克隆抗體、0.01~5.0mg/ml的CD16單克隆抗體包被在細胞培養(yǎng)瓶中，包被條件為室溫，孵育時間為0.5~12h ; b.將從外周血中分離獲得的單個核細胞用無血清培養(yǎng)液接種在上述的細胞培養(yǎng)瓶中，刺激2~24h ; c.加入NK細胞培養(yǎng)用無血清培養(yǎng)液和濃度為15~50ng/ml的白細胞介素_2以及15~50ng/ml的白細胞介素_18，刺激12~72h，然后轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)； d.收獲NK細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于所述孵育時間為lh。
3.如權(quán)利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于，所述抗CD3抗體在包被液中的濃度為0.15mg/ml。
4.如權(quán)利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于，所述抗CD16抗體在包被液中的濃度為0.15mg/ml。
5.如權(quán)利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于，將從自體外周血中分離獲得的單個核細胞加入抗CD3、CD16抗體包被后的細胞培養(yǎng)瓶中刺激16h。
6.如權(quán)利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)因子組合中所用白細胞介素-2濃度為15ng/ml。
7.如權(quán)利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)因子組合中所用白細胞介素-18濃度為15ng/ml`。
【文檔編號】C12N5/0783GK103756963SQ201310684685
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月13日
【發(fā)明者】葉永清, 柳運猛, 楊雪晶, 蘇國新 申請人:上?？氯R遜生物技術(shù)有限公司