一種gm-csf-tat-cea重組蛋白及其方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組蛋白及其方法和應(yīng)用，具體為一種GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白及其方法和應(yīng)用，其氨基酸序列表如SEQ?ID?NO：1所示，制備時(shí)，將GM-CSF、TAT和CEA通過酶切克隆到質(zhì)粒pET-15b的克隆位點(diǎn)中構(gòu)建重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21細(xì)胞，進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)，最后進(jìn)行重組蛋白轉(zhuǎn)化體的純化收集，本發(fā)明的重組蛋白可應(yīng)用于腫瘤治療藥物。本發(fā)明將腫瘤特異性抗原和轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白以及體外誘導(dǎo)DC細(xì)胞的關(guān)鍵試劑GM-CSF結(jié)合，制備出具有特異性且能延緩DC細(xì)胞壽命的融合蛋白，保證了DC細(xì)胞存活時(shí)間的延長(zhǎng)以及特異性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)；避免了常規(guī)DC細(xì)胞培養(yǎng)中GM-CSF的額外添加，解決了培養(yǎng)周期中GM-CSF不足的缺點(diǎn)，并且共表達(dá)GM-CSF還可促進(jìn)細(xì)胞毒作用；為腫瘤臨床治療提供了新的依據(jù)。
【專利說明】—種GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白及其方法和應(yīng)用
[【技術(shù)領(lǐng)域】]
[0001]本發(fā)明涉及一種重組蛋白及其方法和應(yīng)用，具體為一種GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白及其方法和應(yīng)用。
[【背景技術(shù)】]
[0002]腫瘤發(fā)生發(fā)展的根本原因之一是機(jī)體的免疫系統(tǒng)不能對(duì)其生長(zhǎng)進(jìn)行有效地控制，對(duì)此加以糾正，使機(jī)體的免疫系統(tǒng)能有效產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)是近百年來人們一直研究的課題。腫瘤疫苗是該方面研究的主要內(nèi)容，在眾多的腫瘤疫苗中，根據(jù)抗原提呈細(xì)胞在腫瘤免疫中的重要作用而設(shè)計(jì)的樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DC)瘤苗是目前研究最熱門方向。機(jī)體的免疫應(yīng)答首先由抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)捕獲、加工和處理抗原，再將抗原遞呈給T，B淋巴細(xì)胞，從而引發(fā)一系列的免疫應(yīng)答。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)作為功能最強(qiáng)的APC,能激活靜息型T細(xì)胞(naive T cell),激發(fā)初始免疫應(yīng)答，在體內(nèi)發(fā)揮強(qiáng)大的免疫監(jiān)視功能。腫瘤患者體內(nèi)DC功能缺陷，不能有效遞呈腫瘤抗原，導(dǎo)致免疫無能或免疫耐受，使腫瘤得以發(fā)生發(fā)展。應(yīng)用DC瘤苗治療腫瘤最引人矚目的研究工作是應(yīng)用抗原或抗原多肽在體外沖擊致敏(pulsing) DC，然后將之回輸或免疫接種至行瘤宿主，進(jìn)行腫瘤免疫治療，已證明該療法能顯著地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性CTL，產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)并能治療已建立的荷瘤模型，這些研究為腫瘤的治療提供了新的思路，將DC過繼回輸已在臨床用于腫瘤病人的治療，取得了一定療效，表明該療法具有一定的臨床應(yīng)用的可行性。
[0003]DC的抗原遞呈功能是DC瘤苗抗腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)，DC的體外大量誘導(dǎo)擴(kuò)增是DC瘤苗抗腫瘤免疫治療的前提，DC瘤苗的體外構(gòu)建是DC瘤苗的抗腫瘤免疫治療的關(guān)鍵。
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【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]針對(duì)現(xiàn)階段應(yīng)用常規(guī)方法所誘導(dǎo)的DC細(xì)胞具有抗原特異性不高以及過早凋亡等方面的不足。本發(fā)明提供了一種GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白的制備方法，使誘導(dǎo)的DC細(xì)胞在抗原特異性和生存周期上都有了很大程度的提高，為后續(xù)的特異性免疫應(yīng)答提供了很好的基礎(chǔ)條件。本發(fā)明為腫瘤免疫治療奠定了良好的基礎(chǔ)。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，設(shè)計(jì)一種GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白，其氨基酸序列表如SEQ IDNO:1所示。
[0006]本發(fā)明還涉及一種制備上述重組蛋白的方法，該方法由以下步驟組成:
[0007]a.將GM-CSF、TAT和CEA通過酶切克隆到質(zhì)粒pET_15b的克隆位點(diǎn)中構(gòu)建重組質(zhì)粒，
[0008]b.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21細(xì)胞，進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)，
[0009]c.重組蛋白轉(zhuǎn)化體的純化收集:通過N1-NTA柱分離純化所述的重組蛋白。
[0010]在所述的步驟(a)中的酶切為:在GM-CSF的基因序列兩端添加酶切位點(diǎn)Nde I和Nco I，在TAT的基因序列兩端添加酶切位點(diǎn)Xho I和Nde I，以及在CEA的基因序列兩端添加酶切位點(diǎn)BamH I和Xho I。
[0011]本發(fā)明的重組蛋白可應(yīng)用于腫瘤治療藥物。
[0012]本發(fā)明還包括一種上述重組蛋白制備DC疫苗的方法，將所述重組蛋白刺激誘導(dǎo)健康C57BL/6小鼠經(jīng)由骨髓制備的DC細(xì)胞，制得DC疫苗。
[0013]所述的重組蛋白的濃度為25~100ug/ml,優(yōu)選為25~50ug/ml。
[0014]本發(fā)明將特異性的腫瘤抗原與DC瘤苗相關(guān)因子基因相重組，得到可腫瘤免疫治療所需的特異、高效的重組蛋白。無論從理論上還是實(shí)際治療上都有著很大的進(jìn)步。隨著DC體外誘導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展及分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)應(yīng)用于DC瘤苗構(gòu)建方法的發(fā)現(xiàn)，使得產(chǎn)量增大、純度提高、制備更容易等優(yōu)點(diǎn)，更能滿足實(shí)驗(yàn)和臨床研究的需要。DC瘤苗用于腫瘤免疫治療的實(shí)驗(yàn)和臨床研究更趨成熟，DC瘤苗有望成為腫瘤免疫治療的一種有效方式。故發(fā)明了一種腫瘤特異性抗原結(jié)合細(xì)胞因子等刺激DC細(xì)胞制備DC疫苗所需的GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白，并可有效激發(fā)體內(nèi)抗原特異性免疫反應(yīng)用于腫瘤的預(yù)防及治療。
[0015]與常規(guī)利用腫瘤細(xì)胞裂解物誘導(dǎo)DC細(xì)胞的方法相比，本發(fā)明創(chuàng)新優(yōu)越之處有以下幾點(diǎn):首先，利用基因工程方法將腫瘤特異性抗原和轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白以及體外誘導(dǎo)DC細(xì)胞的關(guān)鍵試劑GM-CSF結(jié)合，制備出具有特異性且能延緩DC細(xì)胞壽命的融合蛋白，保證了 DC細(xì)胞存活時(shí)間的延長(zhǎng)以及特異性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)；其次，重組蛋白的成功制備，避免了常規(guī)DC細(xì)胞培養(yǎng)中GM-CSF的額外添加，解決了培養(yǎng)周期中GM-CSF不足的缺點(diǎn)，并且共表達(dá)GM-CSF還可促進(jìn)細(xì)胞毒作用；再者增強(qiáng)了腫瘤抗原的特異性，針對(duì)性的解決了以CEA為標(biāo)志性抗原的腫瘤免疫治療，為腫瘤臨床治療提供了新的依據(jù)。
[【專利附圖】

【附圖說明】]
[0016]圖1是不同疫苗刺激機(jī)體ELSPOT檢測(cè)IFN-gama斑點(diǎn)數(shù)的圖表，
[0017]圖2是不同疫苗刺激機(jī)體特異性反應(yīng)ELSPOT檢測(cè)IFN-gama斑點(diǎn)數(shù)的圖表，
[0018]圖3是不同組腫瘤塊體積的圖表，
[0019]圖4是不同劑量重組蛋白刺激機(jī)體特異反應(yīng)ELSPOT檢測(cè)分析圖表，
[0020]圖5是MC-38_cea2細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)圖表，
[0021]圖6是MC38細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)圖表，
[0022]圖7是質(zhì)粒pET_15b的圖譜
[【具體實(shí)施方式】]
[0023]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。本申請(qǐng)中的生產(chǎn)設(shè)備都是本領(lǐng)域的常用設(shè)備，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0024]實(shí)施例1:
[0025]本實(shí)施例中:
[0026]人源結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞株特異性抗原CEA來自NCBI，序列號(hào)為CAE75559 ；
[0027]TAT跨膜肽來自NCBI，序列號(hào)為NP_057853，
[0028]粒細(xì)胞集落刺激生長(zhǎng)因子GM-CSF來自NCBI，序列號(hào)為AAA52578。[0029]質(zhì)粒pET_15b圖譜如圖7所示，
[0030]a、利用基因合成技術(shù)，分別合成人源結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞株特異性抗原CEA的基因序列、TAT跨膜肽的基因序列以及GM-CSF的基因序列。其中，粒細(xì)胞集落刺激生長(zhǎng)因子GM-CSF基因序列兩端加酶切位點(diǎn)Nde I和Nco I ;TAT跨膜肽的基因序列兩端加酶切位點(diǎn)Xho I和Nde I ;在CEA基因序列兩端加酶切位點(diǎn)BamH I和Xho I ;利用基因重組技術(shù)將合成的這三段基因序列通過酶切克隆到質(zhì)粒pET-15b上面構(gòu)建成重組質(zhì)粒；再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21細(xì)胞，并確保細(xì)胞密度在2X IO6進(jìn)行轉(zhuǎn)染，37°C培養(yǎng)4天后取出細(xì)胞懸液；利用N1-NTA柱分離純化GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白，即可得到GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白，其氨基酸序列為 GM-CSF27-138aa-TAT47-57-CEA605-613，詳細(xì)如 SEQ ID NO:1 所示。
[0031]其中結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞株和質(zhì)粒pET_15b為本公司所有；其中CEA、TAT跨膜肽和粒細(xì)胞集落刺激生長(zhǎng)因子GM-CSF的相關(guān)基因序列為第三方合成提供。
[0032]b、構(gòu)建表達(dá)人源CEA的小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株MC-38，即MC-38_cea2細(xì)胞株，并用DMEM培養(yǎng)基，10%熱滅活的胎牛血清，100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素，2mmol的L-谷氨酰胺進(jìn)行培養(yǎng)；
[0033]C、選取C57BL/6小鼠，并以IX IO6個(gè)細(xì)胞數(shù)量按照每2天進(jìn)行腹腔注射，以構(gòu)建MC-38-cea2動(dòng)物模型；
[0034]d、取健康C57BL/6小鼠四肢骨骨髓制備成單細(xì)胞懸液，去除紅細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基、IL-4等細(xì)胞因子，體外誘導(dǎo)出小鼠DC細(xì)胞，再加入已獲得的GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白，37°C、5%C02條件下進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)、以激活得到DC疫苗。
[0035]㈠常規(guī)方法與GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白誘導(dǎo)DC激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)能力的對(duì)比常規(guī)方法是指，利用腫瘤·細(xì)胞株裂解物去誘導(dǎo)DC細(xì)胞。
[0036]取兩種方法誘導(dǎo)的DC疫苗回輸C57BL/6小鼠，利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)檢測(cè)疫苗回輸后T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-gama的量，以及⑶4+和⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答產(chǎn)生IFN-gama的量去評(píng)估機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的能力。
[0037]由圖1數(shù)據(jù)顯示，GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力要高于常規(guī)方法，且兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。
[0038]由圖2數(shù)據(jù)顯示，GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白刺激機(jī)體產(chǎn)生CEA特異性免疫反應(yīng)的能力要高于常規(guī)方法，且兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。
[0039]㈡GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白最佳劑量
[0040]MC-38-cea2細(xì)胞株是由攜帶人源CEA的cDNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染小鼠結(jié)腸癌MC-38細(xì)胞株構(gòu)建而成的。
[0041]選取C57BL/6小鼠構(gòu)建MC-38-cea2結(jié)腸癌動(dòng)物模型，按照空白、生理鹽水、融合蛋白濃度為25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml五組分別注射小鼠，每組10只，每5天測(cè)量并計(jì)算腫瘤塊體積大小mm3= (a*b2) /2，a、b為腫瘤塊的大小中心軸的直徑。
[0042]由圖3數(shù)據(jù)顯示，GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白可明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，抑制效果跟注射劑量相關(guān)，并且之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。
[0043]利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)檢測(cè)按以上五組分別注射小鼠后使T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-gama的量。根據(jù)圖4顯示的數(shù)據(jù)表明，低劑量GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白就可以誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生特異性免疫應(yīng)答。[0044]㈢細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)
[0045]分別以MC-38_cea2和MC-38細(xì)胞作為靶細(xì)胞。分別取注射常規(guī)蛋白和GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白7天后的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞，經(jīng)4%多聚甲醛孵育后以作為效應(yīng)細(xì)胞。按照不同效靶比將細(xì)胞混合培養(yǎng)，每組做三個(gè)平行，5天后利用鉻釋放法檢測(cè)特異性細(xì)胞毒性。 [0046]圖5數(shù)據(jù)顯示，GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白殺傷表達(dá)特異性CEA細(xì)胞的效果要高于常規(guī)法，兩者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且不同效靶比之間的差異性也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。
[0047]圖6數(shù)據(jù)顯示表明，常規(guī)法和GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白均可殺傷結(jié)腸癌MC-38細(xì)胞，兩者之間無明顯差異性，并且不同效靶比之間也無明顯差異。
【權(quán)利要求】
1.一種GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一種制備權(quán)利要求1所述重組蛋白的方法，其特征在于該方法由以下步驟組成: a.將GM-CSF、TAT和CEA通過酶切克隆到質(zhì)粒pET_15b的克隆位點(diǎn)中構(gòu)建重組質(zhì)粒， b.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21細(xì)胞，進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)， c.重組蛋白轉(zhuǎn)化體的純化收集。
3.如權(quán)利要求2所述的制備重組蛋白的方法，其特征在于在所述的步驟(a)所述的酶切為:在GM-CSF的基因序列兩端添加酶切位點(diǎn)Nde I和Nco I，在TAT的基因序列兩端添加酶切位點(diǎn)Xho I和Nde I，以及在CEA的基因序列兩端添加酶切位點(diǎn)BamH I和Xho I。
4.如權(quán)利要求2所述的制備重組蛋白的方法，其特征在于:通過N1-NTA柱分離純化所述的重組蛋白。
5.一種權(quán)利要求1所述重組蛋白在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
6.一種權(quán)利要求1所述重組蛋白制備DC疫苗的方法，其特征在于將所述重組蛋白刺激誘導(dǎo)健康C57BL/6小鼠經(jīng)由骨髓制備的DC細(xì)胞，制得DC疫苗。
7.如權(quán)利要求6所述的重組蛋白制備DC疫苗的方法，其特征在于所述的重組蛋白的濃度為 25 ~100ug/ml。
8.如權(quán)利要求7 所述的重組蛋白制備DC疫苗的方法，其特征在于所述的重組蛋白的濃度為 25 ~50ug/ml。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103788213SQ201310684716
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月14日
【發(fā)明者】葉永清, 張超, 蘇國(guó)新 申請(qǐng)人:上海柯萊遜生物技術(shù)有限公司