一種利用提油后藻渣生產(chǎn)生物乙醇的方法
【專利摘要】一種利用提油后藻渣生產(chǎn)生物乙醇的方法，將藻渣制成藻漿，加入纖維素酶，混合均勻，調(diào)節(jié)pH6.0，置于45~60℃水浴中3~6小時(shí)，酶解過(guò)程加攪拌，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)離心得到上清液即為藻渣酶解液；水與藻渣酶解液之比為9~3:1，并加入硝酸鈉或氯化銨、硫酸鎂和磷酸二氫鈉；121℃，20分鐘滅菌后，接入酵母菌發(fā)酵，溫度30~40℃、初始pH5.0~7.0、100~500轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，發(fā)酵48~72小時(shí)；以變速流加方式流加滅菌后的酶解液，收集乙醇?xì)怏w。本發(fā)明發(fā)酵過(guò)程操作簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，乙醇產(chǎn)率高，無(wú)環(huán)境污染，可規(guī)?；瑢?shí)現(xiàn)廢棄物資源化，是一種滿足工業(yè)化需求、實(shí)用性很強(qiáng)的新方法。
【專利說(shuō)明】—種利用提油后藻渣生產(chǎn)生物乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及化工【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]眾所周知，能源、環(huán)境和糧食問(wèn)題系人類社會(huì)面臨和必須解決的三大難題。微藻生物能源是目前國(guó)際上公認(rèn)緩解上述危機(jī)的理想途徑之一，發(fā)展?jié)摿薮蟆Ｎ⒃宸N類繁多、分布廣，是一群最簡(jiǎn)單、最古老的低等植物，微藻能夠利用陽(yáng)光、CO2及廢水中的N、P等營(yíng)養(yǎng)物快速生長(zhǎng)并可在胞內(nèi)合成大量油脂等代謝物。利用微藻細(xì)胞可制備出生物柴油等多種形式的生物能源產(chǎn)品，目前微藻生物能源已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。針對(duì)微藻生物能源，美國(guó)于2007年啟動(dòng)了“微型曼哈頓計(jì)劃”，其宗旨是向海洋藻類要能源，以幫助美國(guó)擺脫嚴(yán)重依賴進(jìn)口石油的窘境；2008年，英國(guó)碳基金公司啟動(dòng)了利用藻類開發(fā)航空燃料項(xiàng)目，投入2600萬(wàn)英鎊用于發(fā)展相關(guān)技術(shù)和基礎(chǔ)設(shè)施，該項(xiàng)目預(yù)計(jì)到2020年實(shí)現(xiàn)商業(yè)化；我國(guó)科技部于2011年啟動(dòng)了首個(gè)微藻能源“973計(jì)劃”項(xiàng)目，旨在強(qiáng)化我國(guó)在微藻生物能源方面的基礎(chǔ)研究。通過(guò)世界各國(guó)共同的努力，微藻生物能源研究已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)展，但距離產(chǎn)業(yè)化尚有一段路程要走。這主要是由于當(dāng)前微藻油脂產(chǎn)率低、后加工能耗高、提油后藻渣未被利用等造成生產(chǎn)成本過(guò)高。
[0003]微藻細(xì)胞除含油脂外，還含大量的碳水化合物，蛋白質(zhì)等，因此在微藻制備高品質(zhì)生物柴油過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的殘余物質(zhì)，即提油后藻渣，以上物質(zhì)若不加以利用將造成藻體殘?jiān)邇r(jià)值多元組成的浪費(fèi)和環(huán)境污染。實(shí)際上，藻體殘?jiān)侵匾纳镔|(zhì)資源。經(jīng)相關(guān)轉(zhuǎn)化技術(shù)，將提油后藻渣轉(zhuǎn)化 成糖類物質(zhì)和蛋白質(zhì)，通過(guò)產(chǎn)乙醇酵母發(fā)酵，可獲得純凈的生物乙醇。目前微藻生產(chǎn)生物柴油尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，目前采用的生產(chǎn)方式微藻產(chǎn)油效率比較低，還沒有發(fā)現(xiàn)一種可將提油后藻渣充分利用的方法。本專利即為一種利用提油后藻渣酶解液發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，充分利用微藻生物質(zhì)資源，提高微藻生物柴油生產(chǎn)系統(tǒng)整體經(jīng)濟(jì)性，該工藝路線尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中提油后藻渣未被充分利用，木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)(水稻秸桿等)轉(zhuǎn)化生物乙醇預(yù)處理成本高、副產(chǎn)物多等問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種利用提油后藻渣酶解后發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇的方法，該方法高效、藻渣酶解效率高、發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇生產(chǎn)成本低、酶解液利用效率高、藻渣較木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)更容易酶解、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、操作過(guò)程簡(jiǎn)單。
[0005]本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0006]一種利用提油后藻渣生產(chǎn)生物乙醇的方法，其特征在于藻渣經(jīng)酶解，滅菌后發(fā)酵產(chǎn)乙醇，發(fā)酵過(guò)程流加酶解液。具體步驟為。
[0007](I)藻渣加入水，制成藻漿，按藻渣干物質(zhì)5-50mg/g的量加入纖維素酶，混合均勻，調(diào)節(jié)pH6.0，置于45飛(TC水浴中3飛小時(shí)，酶解過(guò)程加攪拌，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)離心得到上清液即為藻渣酶解液。
[0008](2)水與藻渣酶解液之比為9~3:1，并加入10(Tl000mg/L硝酸鈉或氯化銨、20(Tl000mg/L硫酸鎂和20(T500mg/L磷酸二氫鈉；121°C，20分鐘滅菌后，接入酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中溫度3(T40°C、初始pH 5.0-7.0、攪拌轉(zhuǎn)速100~500轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間48~72小時(shí)。發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)料以流加方式進(jìn)行，流加滅菌后的酶解液，流加采用變速流加，起始6小時(shí)流加速度為f 5mL/L/h，最后6小時(shí)流加速度為f 5mL/L/h，中間階段流加速度為l(T20mL/L/h，流加速度通過(guò)設(shè)置發(fā)酵罐相關(guān)參數(shù)來(lái)控制；收集乙醇?xì)怏w。
[0009]利用高效液相色譜儀檢測(cè)藻渣酶解液中糖含量，用凱氏定氮儀測(cè)定藻渣酶解液中蛋白質(zhì)含量，用氣相色譜儀檢測(cè)生物乙醇產(chǎn)量。
[0010]本發(fā)明所述酵母菌為釀酒酵母cereFisiae),可從中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心獲得，其保藏編號(hào)為CICC 1747。
[0011]本發(fā)明所述的纖維素酶為購(gòu)自酶制劑公司丹尼斯克子公司杰能科國(guó)際有限公司的市售商品酶 Accellerase 1000 或 Excel 纖維素酶或 Accellerase 1500 或 AccelleraseTRIO或Accellerase DUET或購(gòu)自諾維信公司的市售商品酶Celluclast 1.5L或Novozyme188 或 Novozyme 476 或 Novozyme988 或 Cellic CTec2。
[0012]本發(fā)明生物乙醇的生產(chǎn)是利用提油后藻渣，酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇過(guò)程變速流加藻渣酶解液，利用易于酶解的生物質(zhì)藻渣產(chǎn)乙醇，提高乙醇產(chǎn)率，發(fā)酵過(guò)程操作簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，無(wú)環(huán)境污染，可規(guī)?；?，實(shí)現(xiàn)廢棄物資源化 ，是一種滿足工業(yè)化需求、實(shí)用性很強(qiáng)的新方法。
【具體實(shí)施方式】
[0013]本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0014]以下實(shí)施例所用到的小球藻，可從中國(guó)典型微生物保藏中心(武漢)獲得，其保藏編號(hào)為CCTCC M209256 ;所用到的微擬球藻、原核小球藻和雨生紅球藻，可從美國(guó)德州大學(xué)UTEX藻種庫(kù)獲得，其保藏編號(hào)分別為L(zhǎng)B2164、256和2505;所用到的萊茵衣藻，可從中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)獲得，其保藏編號(hào)為FACHB-265。
[0015]實(shí)施例1。
[0016]將小球藻藻種經(jīng)無(wú)菌操作接種于滅菌培養(yǎng)基(mg/L):NaCl 24000, Na2EDTA 10，F(xiàn)eSO4.7Η20 50,NaH2PO4 20,MgCl2 20和NaNO3 100置于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度250C，光照強(qiáng)度2000Lux，培養(yǎng)10天。培養(yǎng)到第10天的500g小球藻經(jīng)離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)獲得濕藻體，蒸餾水沖洗5次，經(jīng)高壓滅菌鍋預(yù)處理(121°C，20分鐘)后，用正己烷和乙醇來(lái)提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為1:1:2，水相經(jīng)離心(12000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)后，用蒸餾水沖洗5次，冷凍干燥12h后得到藻渣，藻渣加入自來(lái)水或蒸餾水，制成藻衆(zhòng)，加入纖維素酶(20mg/g藻渣干物質(zhì))，混合均勻，調(diào)節(jié)pH6.0，置于55°C水浴中4小時(shí)，酶解過(guò)程加攪拌，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)離心得到上清液即為藻渣酶解液；檢測(cè)其中糖含量和蛋白質(zhì)含量。
[0017]水與藻渣酶解液之比為9:1，并加入200mg/L硝酸鈉、200mg/L硫酸鎂和500mg/L磷酸二氫鈉，121°C,20分鐘滅菌后，接入酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中溫度37°C、初始pH
5.5、攪拌轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間72小時(shí)。發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)料以流加方式進(jìn)行，流加滅菌后的酶解液，流加采用變速流加，起始6小時(shí)流加速度為3mL/L/h，最后6小時(shí)流加速度為3mL/L/h，中間階段流加速度為15mL/L/h，流加速度通過(guò)設(shè)置發(fā)酵罐相關(guān)參數(shù)來(lái)控制；收集乙醇?xì)怏w。結(jié)果見表1。
[0018]實(shí)施例2。
[0019]將微擬球藻藻種經(jīng)無(wú)菌操作接種于滅菌培養(yǎng)基(mg/L):NaCl 30000, Na2EDTA 20，F(xiàn)eSO4.7Η20 30,NaH2PO4 30,MgCl2 20和NaNO3 200置于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度250C，光照強(qiáng)度2000Lux，培養(yǎng)10天。培養(yǎng)到第10天的500g微擬球藻經(jīng)離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)獲得濕藻體，蒸餾水沖洗3次，經(jīng)高壓滅菌鍋預(yù)處理(121°C，20分鐘)后，用正己烷和乙醇來(lái)提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為1:1:2，水相經(jīng)離心(15000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)后，用蒸餾水沖洗3次，冷凍干燥12h后得到藻渣，藻渣加入自來(lái)水或蒸餾水，制成藻漿，加入纖維素酶(40mg/g藻渣干物質(zhì))，混合均勻，調(diào)節(jié)pH6.0,置于60°C水浴中3小時(shí)，酶解過(guò)程加攪拌，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)離心得到上清液即為藻渣酶解液；檢測(cè)其中糖含量和蛋白質(zhì)含量。
[0020]水與藻渣酶解液之比為7:1，并加入300mg/L硝酸鈉、300mg/L硫酸鎂和400mg/L磷酸二氫鈉，115°C，20分鐘滅菌后，接入酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中溫度35°C、初始pH6.0、攪拌轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘,發(fā)酵時(shí)間60小時(shí)。發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)料以流加方式進(jìn)行，流加滅菌后的酶解液，流加采用變速流加，起始6小時(shí)流加速度為5mL/L/h，最后6小時(shí)流加速度為5mL/L/h，中間階段流加速度為15mL/L/h，流加速度通過(guò)設(shè)置發(fā)酵罐相關(guān)參數(shù)來(lái)控制；收集乙醇?xì)怏w。結(jié)果見表1。
[0021]實(shí)施例3。
[0022]將原核小球藻藻種經(jīng)無(wú)菌操作接種于滅菌培養(yǎng)基(mg/L):蛋白胨1000, NaCl 25,CaCl2.2H20 25，K2HPO4 75，KH2PO4 175，MgSO4.7H20 75 和 NaNO3 250 置于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，光照強(qiáng)度2000LUX，培養(yǎng)10天。培養(yǎng)到第10天的500g原核小球藻經(jīng)離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)獲得濕藻體，蒸餾水沖洗5次，經(jīng)高壓滅菌鍋預(yù)處理(115°C，20分鐘)后，用正己烷和乙醇來(lái)提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為I:1:2，水相經(jīng)離心(12000轉(zhuǎn)/分鐘，20分鐘)后，用蒸餾水沖洗5次，冷凍干燥12h后得到藻渣，藻渣加入自來(lái)水或蒸餾水，制成藻漿，加入纖維素酶(20mg/g藻渣干物質(zhì))，混合均勻，調(diào)節(jié)pH6.0，置于50°C水浴中5小時(shí)，酶解過(guò)程加攪拌，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)離心得到上清液即為藻渣酶解液；檢測(cè)其中糖含量和蛋白質(zhì)含量。
[0023]水與藻渣酶解液之比為4:1，并加入400mg/L硝酸鈉、300mg/L硫酸鎂和300mg/L磷酸二氫鈉，121°C，20分鐘滅菌后，接入酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中溫度40°C、初始pH6.5、攪拌轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分鐘,發(fā)酵時(shí)間60小時(shí)。發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)料以流加方式進(jìn)行，流加滅菌后的酶解液，流加采用變速流加，起始6小時(shí)流加速度為lmL/L/h，最后6小時(shí)流加速度為lmL/L/h，中間階段流加速度為20mL/L/h，流加速度通過(guò)設(shè)置發(fā)酵罐相關(guān)參數(shù)來(lái)控制；收集乙醇?xì)怏w。結(jié)果見表1。
[0024]實(shí)施例4。
[0025]將雨生紅球藻藻種經(jīng)無(wú)菌操作接種于滅菌培養(yǎng)基(mg/L):NaCl 25, Na2EDTA 50,FeSO4.7H20 4.98，K2HPO4 75，KH2PO4 175，MgSO4.7H20 75，ZnSO4.7H20 8.82，CaCl2.2H2025，CuSO4.5Η20 1.57，MnCl2 1.44，MoO3 0.71, H3BO3 11.42，KOH 31 和 NaNO3 250 置于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，光照強(qiáng)度2000LUX，培養(yǎng)10天。培養(yǎng)到第10天的500g雨生紅球藻經(jīng)離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)獲得濕藻體，蒸餾水沖洗5次，經(jīng)高壓滅菌鍋預(yù)處理(115°C，20分鐘)后，用正己烷和乙醇來(lái)提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為1:1:2，水相經(jīng)離心(12000轉(zhuǎn)/分鐘，20分鐘)后，用蒸餾水沖洗5次，冷凍干燥12h后得到藻渣，藻渣加入自來(lái)水或蒸餾水，制成藻漿，加入纖維素酶(20mg/g藻渣干物質(zhì))，混合均勻，調(diào)節(jié)PH6.0,置于50°C水浴中5小時(shí)，酶解過(guò)程加攪拌，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)離心得到上清液即為藻渣酶解液；檢測(cè)其中糖含量和蛋白質(zhì)含量。
[0026]水與藻渣酶解液之比為4:1，并加入400mg/L硝酸鈉、硫酸鎂300mg/L和300mg/L磷酸二氫鈉，121°C，20分鐘滅菌后，接入酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中溫度40°C、初始pH
.6.5、攪拌轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分鐘,發(fā)酵時(shí)間60小時(shí)。發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)料以流加方式進(jìn)行，流加滅菌后的酶解液，流加采用變速流加，起始6小時(shí)流加速度為lmL/L/h，最后6小時(shí)流加速度為lmL/L/h，中間階段流加速度為20mL/L/h，流加速度通過(guò)設(shè)置發(fā)酵罐相關(guān)參數(shù)來(lái)控制；收集乙醇?xì)怏w用于檢測(cè)。結(jié)果見表1。
[0027]實(shí)施例5。
[0028]將萊茵衣藻藻種經(jīng)無(wú)菌操作接種于滅菌培養(yǎng)基(mg/L):NaCl 25，Na2EDTA 0.05，F(xiàn)eCl3.6Η20 0.5, K2HPO4 75, KH2PO4 175，MgSO4.7Η20 75 和 NaNO3 250 置于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，光照強(qiáng)度2000Lux，培養(yǎng)10天。培養(yǎng)到第10天的500g萊茵衣藻經(jīng)離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)獲得濕藻體，蒸餾水沖洗5次，經(jīng)高壓滅菌鍋預(yù)處理(115°C，20分鐘)后，用正己烷和乙醇來(lái)提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為1:1:2,水相經(jīng)離心(12000轉(zhuǎn)/分鐘，20分鐘)后，用蒸餾水沖洗5次，冷凍干燥12h后得到藻渣，藻渣加入自來(lái)水或蒸餾水，制成藻漿，加入纖維素酶(20mg/g藻渣干物質(zhì))，混合均勻，調(diào)節(jié)PH6.0，置于50°C水浴中5小時(shí)，酶解過(guò)程加攪拌，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)離心得到上清液即為藻渣酶解液；檢測(cè)其中糖含量和蛋白質(zhì)含量。
[0029]水與藻渣酶解液之比為4:1，并加入400mg/L硝酸鈉、300mg/L硫酸鎂和300mg/L磷酸二氫鈉，121°C，20分鐘滅菌后，接入酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中溫度40°C、初始pH
.6.5、攪拌轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分鐘,發(fā)酵時(shí)間60小時(shí)。發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)料以流加方式進(jìn)行，流加滅菌后的酶解液，流加采用變速流加，起始6小時(shí)流加速度為lmL/L/h，最后6小時(shí)流加速度為lmL/L/h，中間階段流加速度為20mL/L/h，流加速度通過(guò)設(shè)置發(fā)酵罐相關(guān)參數(shù)來(lái)控制；收集乙醇?xì)怏w用于檢測(cè)。結(jié)果見表1。
[0030]對(duì)比例I。
[0031]將釀酒酵母經(jīng)無(wú)菌操作接種于滅菌發(fā)酵液(mg/L):葡萄糖60 000，蛋白胨5000，酵母粉2 000，麥芽汁2 000，置于發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵溫度37°C，初始pH 5.5、攪拌轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵72小時(shí)。分析乙醇產(chǎn)量，結(jié)果見表1。
[0032]對(duì)比例2。
[0033]將釀酒酵母經(jīng)無(wú)菌操作接種于滅菌發(fā)酵液(mg/L):葡萄糖50 000，蛋白胨5000，酵母粉2 000，麥芽汁2 000，置于發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵溫度37°C，初始pH 5.5、攪拌轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵60小時(shí)。分析乙醇產(chǎn)量，結(jié)果見表1。
[0034]表1實(shí)施例及對(duì)比結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種利用提油后藻渣生產(chǎn)生物乙醇的方法，其特征是按以下步驟: (1)在藻渣加入水，制成藻漿，按藻渣干物質(zhì)5-50mg/g的量加入纖維素酶，混合均勻，調(diào)節(jié)pH6.0,置于45飛(TC水浴中3飛小時(shí)，酶解過(guò)程加攪拌，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)離心得到上清液即為藻渣酶解液； (2)水與藻渣酶解液之比為9~3:1，并加入10(Tl000mg/L硝酸鈉或氯化銨、20(Tl000mg/L硫酸鎂和20(T500mg/L磷酸二氫鈉；121°C，20分鐘滅菌后，接入酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中溫度3(T40°C、初始pH 5.0-7.0、攪拌轉(zhuǎn)速100~500轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間48~72小時(shí)；發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)料以流加方式進(jìn)行，流加滅菌后的酶解液，流加采用變速流加，起始6小時(shí)流加速度為f5mL/L/h，最后6小時(shí)流加速度為f 5mL/L/h，中間階段流加速度為l(T20mL/L/h，流加速度通過(guò)設(shè)置發(fā)酵罐相關(guān)參數(shù)來(lái)控制；收集乙醇?xì)怏w。
【文檔編號(hào)】C12P7/10GK103710394SQ201310685311
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】劉玉環(huán), 鄭洪立, 阮榕生, 高振, 萬(wàn)益琴, 黃和, 巫小丹, 王允圃 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)