一種診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的microRNA分子標(biāo)志物及其檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的9種microRNA(miRNA)分子標(biāo)記物組合及其在檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，利用這類(lèi)miRNA分子標(biāo)記物在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血液中呈現(xiàn)異常表達(dá)來(lái)診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，該miRNA標(biāo)志物組合靈敏度和特異性高，取材方便，安全無(wú)創(chuàng)，為疾病早期診斷和監(jiān)測(cè)病程提供重要依據(jù)。本發(fā)明還提供了用于診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的試劑盒以及miRNA標(biāo)志物在診斷試劑盒中的用途，其特征在于所述試劑盒包含用于檢測(cè)血漿中9種miRNA組合以及檢測(cè)這9種miRNA的試劑。
【專利說(shuō)明】—種診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的microRNA分子標(biāo)志物及其檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)診斷領(lǐng)域，涉及用于診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的9種microRNA分子標(biāo)記物組合及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis ；RA)是一類(lèi)慢性,系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，其主要病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)滑膜明顯增厚并有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血管翳形成以及軟骨組織的侵蝕與破壞。一直以來(lái)，類(lèi)風(fēng)濕因子和抗環(huán)瓜氨酸蛋白抗體是美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn)中的血清學(xué)指標(biāo)，但敏感性和特異性均不高。目前仍不能闡明RA的發(fā)病機(jī)制及對(duì)疾病進(jìn)行預(yù)測(cè)，因此找出疾病早期診斷和監(jiān)測(cè)病程的生物標(biāo)志物顯得十分重要。
[0003]miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼小分子RNA,具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性。由于miRNA參與機(jī)體的各種重要的生理和病理過(guò)程，近年來(lái)倍受關(guān)注。miRNA的出現(xiàn)讓人們?cè)趯?duì)哺乳動(dòng)物基因組的表達(dá)和功能的認(rèn)識(shí)上發(fā)生巨大的改變。目前通過(guò)不同的實(shí)驗(yàn)方法和計(jì)算機(jī)檢測(cè)已經(jīng)證實(shí)了在193個(gè)物種中存在25141 個(gè)成熟 miRNA (miRBase database, versionl9.0, August, 2012)，到目前為止,在數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)有1223個(gè)人類(lèi)miRN。據(jù)估計(jì)，一個(gè)miRNA可能調(diào)控幾百到幾千個(gè)靶基因，因此大約30% -90%的人類(lèi)基因受到miRNA的調(diào)節(jié)。miRNA的表達(dá)和功能對(duì)于不同生理系統(tǒng)的發(fā)育和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)以及機(jī)體功能的維持具有重要的作用，尋找疾病診斷的標(biāo)志物對(duì)其準(zhǔn)確診斷一直是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。miRNA可被分泌釋放到細(xì)胞外，參與多種炎性和自身免疫性疾病的發(fā)病過(guò)程。組織細(xì)胞內(nèi)外的miRNA表達(dá)圖譜的差異使miRNA作為疾病診斷的潛在性生物標(biāo)志。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]本發(fā)明的目的在于介紹一種用于檢測(cè)RA的miRNA標(biāo)志物組合，通過(guò)在miRNA的3’端加上一特異性的莖環(huán)引物，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR的方法檢測(cè)被檢樣本血漿中這些miRNA的含量，并與正常人血漿中相應(yīng)miRNA的水平比較來(lái)診斷RA。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:一組用于檢測(cè)RA的miRNA標(biāo)志物組合，為:miR-9-5p (Sj -ucuuugguuaucuagcuguauga-3>, SEQ ID N0.1)、miR-122_3p (5’ -aacgccauuaucacacuaaaua-3>,SEQ ID N0.2)、miR-219-2_3p(5’ -agaauuguggcuggacaucugu-3>,SEQID N0.3)、miR_4634(5’ -cggcgcgaccggcccgggg-3’，SEQ ID N0.4)、miR_181d(5’ -aacauucauuguugucggugggu-S’，SEQ ID N0.5)、miR-342_3p (5’ -ucucacacagaaaucgcacccgu-3>, SEQID N0.6)、miR-4764_5p (5’-uggauguggaaggaguuaucu-3’，SEQ ID N0.7)、miR_3926 (5’_uggccaaaaagcaggcagaga-3’，SEQ ID N0.8) > miR-3925-3p(Sj -acuccaguuuuaguucucuug-3>,SEQ ID N0.9)。
[0006]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:篩查出的miRNA的標(biāo)志物組合用于診斷RA的特異性和靈敏度聞ο
[0007]miRNA標(biāo)志物組合通過(guò)以下步驟得到:
[0008]第一步:芯片篩選:選取臨床確診的初發(fā)活動(dòng)期的RA患者5例，健康體檢者5例各采集血漿Iml以上使用miRCURY? LNAArray (versionl8.0)進(jìn)行表達(dá)譜芯片篩選，得出在RA患者血漿中差異性表達(dá)的33種miRNA，其中22種miRNA升高，11種miRNA降低。
[0009]第二步:定量PCR初篩:選取臨床確診的RA患者18例，健康體檢者14例，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR的方法檢測(cè)芯片篩選得出的33種差異性表達(dá)的miRNA，經(jīng)過(guò)第一次PCR剔除Ct值高于35的miRNA,初篩得出22種miRNA。
[0010]第三步:定量PCR驗(yàn)證:選取臨床確診RA患者57例，健康體檢者56例，使用上述相同的檢測(cè)方法，通過(guò)差異性分析找出9種在RA患者血漿中差異性表達(dá)的miRNA。這九種miRNA的組合在診斷RA的特異性和靈敏度高。
[0011]本發(fā)明的再一目的是提供基于上述miRNA集合的檢測(cè)試劑盒
[0012]技術(shù)方案是:一種類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷試劑盒，包括以下成分:
[0013](l)miRNA標(biāo)志物組合:9種用于診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的miRNA標(biāo)志物，其序列見(jiàn)SEQID N0.1-9 ；
[0014](2)提取 RNA 試劑:mirVanaTM PARIS kit(Ambion, AM1556);另外還包括cel-miR-39 和 cel-miR-238 的控制外參，序列分別為:5’-ucaccggguguaaaucagcuug_3’ (SEQ ID N0.10)和 5，-uuuguacuccgaugccauucaga-3，(SEQ ID N0.11);。
[0015](3)逆轉(zhuǎn)錄試劑:5 X Buffer、dNTP Mixture2.5mM> M-MLV ReverseTranscriptase200U/ μ 1、RNas`e Inhibitor40U/ μ 1、DEPC H2CKmiRNA 特異性逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物。
[0016](4)熒光定量PCR試劑:SYBR Green Mix、miRNA特異性前向引物、miRNA后向通用引物、DEPC H2O。
[0017]本發(fā)明的另一目的是基于上述miRNA標(biāo)志物組合診斷試劑盒的檢測(cè)方法。
[0018]技術(shù)方案是:莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物約42-50個(gè)核苷酸，其5’端的36_40個(gè)核苷酸序列固定，形成一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其3’端的6-8個(gè)核苷酸與miRNA互補(bǔ)。熒光定量PCR的特異性前向引物長(zhǎng)約25-32個(gè)核苷酸，在3’端有11-18核苷酸與對(duì)應(yīng)的miRNA互補(bǔ)，后向通用引物約23nt，其中15-18個(gè)核苷酸對(duì)應(yīng)特異的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在miRNA的3’尾端加上莖環(huán)結(jié)構(gòu)，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR的方法來(lái)檢測(cè)被檢測(cè)者血漿中miRNA的含量并與正常人血漿中miRNA含量比較來(lái)診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1芯片篩選RA患者血漿中差異性表達(dá)的miRNA。
[0020]圖2:miRNA標(biāo)志物組合的診斷價(jià)值。
[0021]Logit(P)=0.964+0.045*miR-9_5p-0.367*miR-122_3p-0.191*miR-219-2_3p+0.083*miR-4634+l.146*miR-181d_3.572*342_3p+0.033*miR-4764_5p-0.313*miR-3926_0.6-16*miR-3925-3p
【具體實(shí)施方式】[0022]下面結(jié)合附圖對(duì)上述技術(shù)方案做【具體實(shí)施方式】的說(shuō)明。
[0023]總體實(shí)驗(yàn)方案如下:
[0024]收集就診于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院并經(jīng)臨床確診的80例RA患者和75例正常健康體檢者外周血2ml于EDTA-K2抗凝管，室溫3000r/min離心IOmin,將上層血漿轉(zhuǎn)移潔凈1.5ml離心管，再以40C 16000Xg離心lOmin，吸取上層血漿于潔凈1.5ml離心管，_80°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0025]1.芯片篩選組:選取臨床確診的5例初發(fā)活動(dòng)期的RA患者，5例健康體檢者各采集血漿Iml以上送往上?？党缮锸褂肊xiqon公司使用miRCURY? LNAArray(versionl8.0)進(jìn)行表達(dá)譜芯片篩選，經(jīng)過(guò)聚類(lèi)分析按照Fold Change > 1.5且P-value ( 0.05 篩選出 33 種候選 miRNA (22 種 miRNA 上升，11 種 miRNA 下降)。
[0026]2.定量PCR初篩組:選取臨床確診的RA患者18例，健康體檢者14例，使用mirVana? PARIS kit (美國(guó)Ambion公司)提取RNA ;通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄使用反轉(zhuǎn)錄試劑(美國(guó)Promega公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；再使用SYBR Green (日本TaKaRa公司)進(jìn)行突光定量PCR的方法檢測(cè)33種候選miRNA。所有的miRNAs引物組合(miRNA特異性逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物、miRNA特異性前向引物和miRNA后向通用引物)購(gòu)于中國(guó)廣州RiboBio公司；剔除Ct≤35的miRNA,經(jīng)過(guò)定量PCR初篩得出22種候選miRNA。
[0027]3.定量PCR驗(yàn)證組:選取臨床確診RA患57例，健康體檢者56例，用相同的檢測(cè)方法，通過(guò)差異性分析進(jìn)一步篩選出9種在RA患者血漿中差異性表達(dá)的miRNA。
[0028]具體的實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下:
[0029]一:芯片篩選組
[0030]1.Exiqon microRNA 芯片篩選
[0031]1.1 樣本 RNA 提取:使用 TRI reagent BD (MRCgene, TB-126), PolyacrylCarrier(MRCgene cat.n0.PC152), Acetic acid, Chloroform, Isopropanol, Ethanol,Nuclease-free water, Microcentrifuge (Termo)提取 RNA (RNA 質(zhì)量報(bào)告見(jiàn)表 I)
[0032]表1.芯片篩選標(biāo)本提取RNA質(zhì)量(使用NanoDrop ND-1000檢測(cè))
[0033]
【權(quán)利要求】
1.一組用于診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的miRNA標(biāo)志物，其特征在于其序列如SEQ ID N0.1-9所示。
2.miRNA標(biāo)志物組合的檢測(cè)試劑盒,包括以下成分: (1)miRNA標(biāo)志物組合:9種用于診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的miRNA標(biāo)志物，其序列見(jiàn)SEQ IDN0.1-9 ； (2)提取RNA試劑:包括cel-miR-39和cel-miR-238的控制外參，序列分別如SEQIDN0.10 和 SEQ ID N0.11 所示； (3)逆轉(zhuǎn)錄試劑:5X Buffer、dNTP Mixture2.5mM> M-MLV ReverseTranscriptase200U/ μ 1、RNase Inhibitor40U/ μ 1、DEPC H2CKmiRNA 特異性逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物； (4)熒光定量PCR試劑:SYBRGreen Mix、miRNA特異性前向引物、miRNA后向通用引物、DEPC H2O。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK103805696SQ201310686940
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】焦志軍, 王文紅, 張瑩瑩, 朱波 申請(qǐng)人:焦志軍, 王文紅, 張瑩瑩