郁金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白及其編碼基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種郁金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白及其編碼基因，所述蛋白質(zhì)為如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有郁金香苯丙氨酸解氨酶活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的如SEQ?ID?NO.1所示的核酸序列。本發(fā)明為今后利用基因工程技術調(diào)控郁金香TfPAL基因的時空表達特性，從而調(diào)控花色提供了理論依據(jù)，具有實踐應用價值。
【專利說明】郁金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白及其編碼基因
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物分子生物學領域，涉及郁金香花色苷合成途徑中的關健酶及其編碼基因，具體涉及一種郁金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白及其編碼基因。
【背景技術】
[0002]苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-1yase, PAL)為植物苯丙烷類物質(zhì)代謝途徑的關鍵酶(Okada等，2008)，是連接初生代謝和次生代謝的紐帶，它在類黃酮、黃酮醇、花青素、單寧、異黃酮、黃烷酮、木質(zhì)素、香豆素、芥子酸酯和水楊酸等次生代謝產(chǎn)物合成中起著重要作用，這些物質(zhì)涉及植物生長發(fā)育、抗蟲抗病、信號轉導、紫外線防御和花粉育性等方面(Dixon等，2002)，因此PAL與植物有著十分密切的關系，是近年來的研究熱點。
[0003]近年來，已有研究者對包括鳳仙花、尾穗莧、甜葉菊、甘薯、玉米、棉花和桃在內(nèi)多種植物的PAL活性進行了研究，結果表明:(I)PAL的活性與植物花色苷含量明顯正相關。
(2)強光、激素、低溫、機械損傷及病蟲害侵染都可以誘異PAL活性升高。(3)PAL活性與組織中氮素含量呈負相關。具體到PAL活性與花色苷合成的關系，Arakawa認為，活性受光調(diào)節(jié)的PAL才是花色苷合成的關鍵酶(Arakawa 0，1988)。蘋果果皮中PAL活性的增加伴隨著花色苷含量的增加，但可能不是控制花色苷的唯一關鍵酶(周愛琴等，1997)。另有研究證實乙烯可以通過誘導PAL活性而提高花色苷合成量(Cheng G和Breen P, 1991)
[0004]PAL基因在植物中以多基因家族的形式存在，覆盆子中至少有2個基因成員，擬南芥中有4個成員，番爺中至少有26個,而馬鈴薯(Solanum tuberosum)中更多,估計有40~50 個(Chang 等 2008 Joos 和 Hahlbrock, 1992 ；Kumar 和 Ellis, 2001)。PAL 存在于所有綠色植物中，已從水稻、小麥、玉米等多種植物中得到分離純化，真菌和藻類細胞中也有發(fā)現(xiàn)(Heilmann 和 Mer fort, 1998)。但郁金香(Tulipa fosteriana)中 PAL 基因的克隆及其表達模式尚不清楚。目前，未有任何與郁金香PAL蛋白及其編碼基因序列相關的文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種郁金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白及其編碼基因。本發(fā)明提供了一種郁金香TfPAL蛋白序列，以及一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列；公開了郁金香TfPAL蛋白及其核苷酸序列在郁金香不同器官、不同發(fā)育階段的表達模式；為今后利用基因工程技術調(diào)控郁金香TfPAL基因的時空表達特性，從而主調(diào)控花色提供了理論依據(jù)，具有一定的應用價值。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的，
[0007]第一方面，本發(fā)明涉及一種具有郁金香苯丙氨酸解氨酶活性的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)是由如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或由SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有郁金香苯丙氨酸解氨酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)在花朵花瓣的不同著色階段、不同器官內(nèi)的有無及活性大小存在較大差異。[0008]優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)為SEQ ID N0.2所示氨基酸序列經(jīng)過I~50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20個以內(nèi)氨基酸而得到的序列。
[0009]進一步優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)為SEQ ID N0.2所示氨基酸序列中I~10個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。
[0010]第二方面，本發(fā)明涉及一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列。
[0011]優(yōu)選的，所述核酸序列具體為:
[0012](a)堿基序列如SEQ ID N0.1第I~2136位所示；
[0013]或(b)與SEQ ID N0.1第I~2136位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；
[0014]或(c)能與SEQ ID N0.1第I~2136位所示的核酸進行雜交的序列。
[0015]優(yōu)選的，所述核酸序列具體為SEQ ID N0.1第I~2136位所示的核酸序列中I~90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加60個以內(nèi)核苷酸形成的序列。
[0016]本發(fā)明提供的分尚出的DNA分子,該分子包括:具有SEQ ID N0.1所不核苷酸序列的DNA分子；或者編碼具有郁金香TfPAL蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且與SEQ IDN0.1所示序列有至少70%的同源性；或者能與SEQ ID N0.1所示序列的核苷酸序列雜交。
[0017]在本發(fā)明中，“分離的DNA”、“純化的DNA”是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細胞中相伴隨的蛋白質(zhì)分開。
[0018]在本發(fā)明中，術語“郁金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白編碼基因”指編碼具有郁金香TfPAL蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID N0.1所示序列中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID N0.1所示序列的同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。該術語還包括與SEQ ID N0.1所示序列中從核苷酸第I~2136位的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。
[0019]該術語還包括能編碼具有與天然的郁金香TfPAL相同功能的蛋白的SEQ ID N0.1所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):通常為I~90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加為60個以內(nèi)核苷酸。
[0020]在本發(fā)明中，術語“郁金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白”是指具有郁金香TfPAL蛋白活性的SEQ ID N0.2所示序列的多肽。該術語還包括具有與天然郁金香TfPAL相關相同功能的、SEQ ID N0.2所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):通常為I~50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或為20個以內(nèi)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術語還包括郁金香TfPAL蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0021]本發(fā)明的郁金香TfPAL多肽的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與郁金香TfPAL相關DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用郁金香TfPAL多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
[0022]在本發(fā)明中，“郁金香TfPAL保守性變異多肽”指與SEQ ID N0.2所示序列的氨基酸序列相比，有至多10個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產(chǎn)生。
[0023]表1
[0024]
【權利要求】
1.一種如下(a)或(b)的蛋白質(zhì): (a)由如SEQID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)SEQID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有郁金香苯丙氨酸解氨酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權利要求1所 述的蛋白質(zhì)，其特征是，所述蛋白質(zhì)為SEQID N0.2所示氨基酸序列經(jīng)過I~50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20個以內(nèi)氨基酸而得到的序列。
3.如權利要求2所述的蛋白質(zhì)，其特征是，所述蛋白質(zhì)為SEQID N0.2所示氨基酸序列中I~10個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。
4.一種編碼如權利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸序列。
5.如權利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具體為: (a)喊基序列如SEQ ID N0.1第I~2136位所不； 或(b)與SEQ ID N0.1第I~2136位所示的核酸有至少70%的同源性的序列； 或(c)能與SEQ ID N0.1第I~2136位所示的核酸進行雜交的序列。
6.如權利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具體為SEQID N0.1第I~2136位所示的核酸序列中I~90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5’和/或3’端添加60個以內(nèi)核苷酸形成的序列。
【文檔編號】C12N9/88GK103695406SQ201310689303
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月16日 優(yōu)先權日:2013年12月16日
【發(fā)明者】袁媛, 史益敏, 唐東芹, 馬曉紅, 陶秀花 申請人:上海交通大學