一種結(jié)核分枝桿菌菌體發(fā)酵的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及結(jié)核分枝桿菌的發(fā)酵方法，屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種全新的結(jié)核分枝桿菌發(fā)酵方法，通過菌株的一級(jí)擴(kuò)增、二級(jí)擴(kuò)增、一級(jí)發(fā)酵、二級(jí)發(fā)酵最終實(shí)現(xiàn)了結(jié)核分枝桿菌菌濃超高、目的蛋白大量表達(dá)的結(jié)果。獲得全新的結(jié)核分枝桿菌的發(fā)酵方法，發(fā)酵收率不低于12g/L，而且菌體中總的rTPA38目的蛋白可達(dá)15%以上，活性也較高，這些都是現(xiàn)有技術(shù)無法達(dá)到的。菌體發(fā)酵的批量大，一次性可發(fā)酵10L至200L，收菌速度快，生產(chǎn)效率高。
【專利說明】一種結(jié)核分枝桿菌菌體發(fā)酵的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及結(jié)核分枝桿菌的發(fā)酵方法，屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群感染引起的多器官感染性疾病，主要為肺結(jié)核。其中我國每年新發(fā)患者高達(dá)150萬。結(jié)核桿菌流行病學(xué)的一個(gè)重要特征是結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染。結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染是一種亞臨床狀態(tài)，無放射檢查征象，細(xì)菌呈休眠狀態(tài)，約有10%的結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染人群一生中會(huì)發(fā)展成為結(jié)核病患者。
[0003]目前結(jié)核桿菌潛伏感染人群尚無診斷金標(biāo)準(zhǔn)，PPD皮試試驗(yàn)是診斷結(jié)核桿菌潛伏感染人群的常用方法，但這一方法有一定的缺陷性，因?yàn)樵囼?yàn)所用pro抗原為結(jié)核分枝桿菌、非致病性分枝桿菌和卡介苗(即BCG)所共有，具有交叉反應(yīng)，診斷特異性差。我國是普遍接種卡介苗的國家，而由于卡介苗接種者和結(jié)核桿菌自然感染者對(duì)pro試驗(yàn)的反應(yīng)在表現(xiàn)上很難區(qū)分，即使采用上述的pro皮試試驗(yàn)強(qiáng)陽性作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，仍然會(huì)有一部分卡介苗接種者以及非致病性分枝桿菌的感 染者被納入結(jié)核桿菌潛伏感染人群中，因此導(dǎo)致PPD試驗(yàn)在結(jié)核桿菌潛伏感染人群診斷中的實(shí)際作用十分有限。需尋找一種新的特異性高、副作用小的制劑代替。重組結(jié)核分支桿菌蛋白38K D a(r T P A38)是結(jié)核分支桿菌的一種脂蛋白和主要抗原，其誘發(fā)豚鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)D T H的效果優(yōu)于其它單一抗原。用于結(jié)核病血清學(xué)檢測(cè)的敏感性和特異性較高。因此，r T P A38蛋白是目前具有較好應(yīng)用前景的蛋白。
[0004]但是，在現(xiàn)有技術(shù)中，由于結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，并不像大腸桿菌那樣能夠大量的表達(dá)目的蛋白，而用大腸桿菌預(yù)案和表達(dá)r T P A38蛋白又存在這折疊活性低的缺陷，因此，本發(fā)明人基于現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，設(shè)計(jì)了本發(fā)明。本發(fā)明通過逐步優(yōu)化現(xiàn)有技術(shù)中的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)方法，提供了一種全新的結(jié)核分枝桿菌發(fā)酵方法，通過菌株的一級(jí)擴(kuò)增、二級(jí)擴(kuò)增、一級(jí)發(fā)酵、二級(jí)發(fā)酵最終實(shí)現(xiàn)了結(jié)核分枝桿菌菌濃超高、目的蛋白大量表達(dá)的結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供:結(jié)核分枝桿菌菌體發(fā)酵的方法，從而收集擴(kuò)增得到的大量菌體，獲得大量的目的蛋白，促進(jìn)了 r T P A38蛋白用于大規(guī)模疫苗的使用。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:結(jié)核分枝桿菌菌體發(fā)酵的方法，包括如下步驟:一、一級(jí)擴(kuò)增液制備:取斜面單菌落，置于一級(jí)擴(kuò)增培養(yǎng)基的試管中，于全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；在超凈工作臺(tái)中向每瓶一級(jí)擴(kuò)增培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素，然后接種試管中的菌種，于全溫振蕩培養(yǎng)箱中恒溫振蕩培養(yǎng)，每瓶取樣檢測(cè)0D600值為大約1-2即可；
[0007]二、二級(jí)擴(kuò)增液:取一級(jí)種子液接種到二級(jí)擴(kuò)增培養(yǎng)基中，于全溫振蕩培養(yǎng)箱中恒溫振蕩培養(yǎng)，每瓶取樣檢測(cè)0D600值為1-2即可；
[0008]三、一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng):接種前設(shè)定通氣為2500L/h，罐壓為0.04Mp,攪拌速度為560rpm，溫度為37°C時(shí)的溶解氧為100%。以5%_7%的接種量接種二級(jí)擴(kuò)增液到種子罐內(nèi)的IOL發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng),培養(yǎng)2-4h至OD_2~3，培養(yǎng)過程中每隔半小時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的0D600值；
[0009]四、二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng):將種子罐內(nèi)0D600符合要求的一級(jí)發(fā)酵菌液以5-10%的接種量接種到發(fā)酵罐內(nèi)120L發(fā)酵培養(yǎng)基中；連續(xù)通氣培養(yǎng)約4至5小時(shí)后0D600≥8收菌，培養(yǎng)過程中每隔約半小時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的0D600值；
[0010]五、收菌:采用管式高速離心機(jī)進(jìn)行離心菌液棄上清液，將菌體收集存放于潔凈容器中。
[0011]六、質(zhì)量指標(biāo):涂片革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察應(yīng)呈典型的革蘭氏陰性桿菌，菌體總蛋白中(目的蛋白rTPA38)不低于15%，發(fā)酵收率:不低于12g/L，計(jì)算公式:發(fā)酵收率(g/L)=濕菌重量(g)/發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基量(L)。
[0012]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明人通過改進(jìn)了結(jié)核分枝桿菌的發(fā)酵方法，優(yōu)化了每一步的具體的條件參數(shù)，獲得全新的結(jié)核分枝桿菌的發(fā)酵方法，發(fā)酵收率不低于12g/L，而且菌體中總的rTPA38目的蛋白可達(dá)15%以上，活性也較高，這些都是現(xiàn)有技術(shù)無法達(dá)到的。菌體發(fā)酵的批量大，一次性可發(fā)酵IOL至200L，收菌速度快，生產(chǎn)效率高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1發(fā)酵菌液革蘭氏染色光學(xué)顯微鏡(典型的革蘭氏陰性桿菌)
[0014]圖2菌體發(fā)酵方法工藝流程圖
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1:
[0016]培養(yǎng)基配制
[0017](1)結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增培養(yǎng)基為羅氏雞蛋斜面培養(yǎng)基，購買自羅氏公司。
[0018](2)發(fā)酵培養(yǎng)基(1000mL):硒酸鈉10mg，磷酸二氫鉀2.4g，b)硫酸鎂0.24g，c)枸櫞酸0.6g，d)天門冬素3.6g，e)甘油20mL，f)馬鈴薯淀粉30g，g)新鮮雞卵液940mL，h)谷氨酸鈉0.15g余量為水。
[0019](3)其它補(bǔ)料液的配制:
[0020]稀鹽酸溶液分裝(1000mL):取稀鹽酸HCl 1000mL各分裝500mL入2個(gè)500mL已滅菌補(bǔ)料瓶中，濃氨溶液分裝(1000mL):取濃氨溶液1000mL各分裝500mL入2個(gè)500mL已滅菌補(bǔ)料瓶中。
[0021]80%碳源配制(8L):稱取甘油6400g溶于純化水中至總體積為8L,分裝入5L補(bǔ)料瓶中，每瓶4L，121°C滅菌20min，冷卻后常溫密閉存放。
[0022]50mg/mL氨節(jié)青霉素(IOmL):稱取Ig氨節(jié)青霉素用20mL純化水溶解。在超凈工作臺(tái)中，用無菌針頭過濾器過濾除菌，分裝入已滅菌容器中，分裝規(guī)格為ImL/管(1.5ml EP管)，共10管，2-8 °C冰箱中保存待用。
[0023]實(shí)施例2:菌體發(fā)酵方法
[0024]一、一級(jí)擴(kuò)增液制備:取結(jié)核分枝桿菌(本領(lǐng)域常用的菌株即可，例如:ATCC93009)斜面單菌落，置于含有3mL擴(kuò)增培養(yǎng)基的試管中，于全溫振蕩培養(yǎng)箱中恒溫37 ± I °C、轉(zhuǎn)速170r/min振蕩培養(yǎng)過夜；在超凈工作臺(tái)中向每瓶擴(kuò)增培養(yǎng)基(8mL)中加入50mg/mL氨節(jié)青霉素8 μ 1，然后接種80 μ 1試管中的菌種，于全溫振蕩培養(yǎng)箱中恒溫37± 1°C、轉(zhuǎn)速170r/min振蕩培養(yǎng)10-12h后，每瓶取樣l_2mL，純化水適當(dāng)稀釋后用可見光分光光度計(jì)檢測(cè)并計(jì)算0D600值約為I即可；
[0025]二、二級(jí)擴(kuò)增液:接種前，在超凈工作臺(tái)中向2瓶擴(kuò)增培養(yǎng)基(500mL)中加入50mg/mL氨芐青霉素500 μ 1，然后取一級(jí)種子液5mL接種到二級(jí)擴(kuò)增培養(yǎng)基中，于全溫振蕩培養(yǎng)箱中恒溫37±1°C、轉(zhuǎn)速170r/min振蕩培養(yǎng)12_14h后，每瓶取樣l_2mL，純化水適當(dāng)稀釋后用可見光分光光度計(jì)檢測(cè)并計(jì)算0D600值約為1.5即可；
[0026]三、一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng):(1)電極校正:pH電極校正，種子培養(yǎng)基滅菌前，在室溫下用PH6.86和pH9.18的標(biāo)準(zhǔn)液校正。DO電極的設(shè)定:培養(yǎng)基配制前把DO電極放入飽和亞硫酸鈉溶液中設(shè)定DO值為O ;接種前設(shè)定通氣為2500L/h，罐壓為0.04Mp,攪拌速度為560rpm，溫度為37°C時(shí)的溶解氧為100%。(2)接種前工作:連接500mL濃氨溶液(濃度約28%)溶液補(bǔ)料瓶以及500mL稀鹽酸(濃度約10%)溶液補(bǔ)料瓶，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至6.8-7.0 ; (3)接種:將0D600符合要求的二級(jí)擴(kuò)增液在火焰保護(hù)下以5%-7%的接種量接種二級(jí)擴(kuò)增液到種子罐內(nèi)的IOL發(fā)酵培養(yǎng)基中；(4)發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)溫度37± 1°C，初始攪拌速度為lOOrpm，通氣量為300L/h，罐壓0.02-0.04Mpa，pH6.8-7.0，培養(yǎng)過程中自動(dòng)補(bǔ)加濃氨溶液以及稀鹽酸調(diào)節(jié)PH，溶氧設(shè)定35%，控制在30%-40%之間，溶氧與轉(zhuǎn)速偶聯(lián)，若溶氧低于30%，加大通氣量，培養(yǎng)2-4h至0D_2~3，培養(yǎng)過程中每隔半小時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的0D600值；
[0027]四、二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng):(1)電極校正:pH電極校正:培養(yǎng)基滅菌前，用pH6.86和PH9.18的標(biāo)準(zhǔn)液校正pH電極。DO電極的設(shè)定:培養(yǎng)基配制前把DO電極放入飽和亞硫酸鈉溶液中設(shè)定DO值為O ;接種前設(shè)定通氣為16m3/h，罐壓為0.04Mp,攪拌速度為400rpm，溫度為37± 1°C時(shí)的溶解氧為100%; (2)接種前工作:連接500mL濃氨溶液補(bǔ)料瓶、500mL稀HCl溶液補(bǔ)料瓶、4L80%碳源補(bǔ)料瓶；(3)接種:將種子罐內(nèi)0D600符合要求的一級(jí)發(fā)酵液以5-10%的接種量接種到發(fā)酵罐內(nèi)120L發(fā)酵培養(yǎng)基中；⑷發(fā)酵培養(yǎng):初始攪拌速度為1OOrpm,通氣量為1.8m3/h，ρΗ6.8-7.0, 37± 1°C培養(yǎng)，溶解氧下降至35%后，設(shè)定DO為35%與轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián)控制，控制在30%-40%，若關(guān)聯(lián)控制溶氧仍低于30%，取消關(guān)聯(lián)，可調(diào)轉(zhuǎn)速及逐漸調(diào)大通氣量，最大可調(diào)至16m3/h，培養(yǎng)過程中自動(dòng)補(bǔ)加濃氨溶液以及稀鹽酸溶液以調(diào)節(jié)pH，溶解氧設(shè)定值為15%，當(dāng)0D600 ≥ 3時(shí)，，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速控制溶氧在10%-20%，通氣量仍保持誘導(dǎo)前的通氣量，當(dāng)DO顯著上升時(shí)，以碳源限制模式流加入滅菌的80%碳源。37±1°C繼續(xù)連續(xù)通氣培養(yǎng)約4至5小時(shí)后0D600 ≥ 8收菌，培養(yǎng)過程中每隔約半小時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的0D600值；
[0028]五、收菌:采用管式高速離心機(jī)以45Hz頻率(約14000rpm)進(jìn)行離心菌液棄上清液，流速為1.4-1.8L/min，將菌體收集存放于潔凈容器中。
[0029]六、質(zhì)量指標(biāo):涂片革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察到發(fā)酵后的菌體呈典型的革蘭氏陰性桿菌，通過SDS-PAGE檢測(cè)到菌體總蛋白中rTPA38蛋白為19%，發(fā)酵收率:為12g/L，計(jì)算公式:發(fā)酵收率(g/L)=濕菌重量(g)/發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基量(L)。
[0030]實(shí)施例3普通的培養(yǎng)方法培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌
[0031]取斜面單菌落，置于含有3mL羅氏雞蛋斜面培養(yǎng)基的試管中，于全溫振蕩培養(yǎng)箱中恒溫37土TC、轉(zhuǎn)速170r/min振蕩培養(yǎng)過夜；在超凈工作臺(tái)中向每瓶擴(kuò)增培養(yǎng)基(8mL)中加入50mg/mL氨芐青霉素8μ 1，然后接種80 μ I試管中的菌種，于全溫振蕩培養(yǎng)箱中恒溫37± 1°C、轉(zhuǎn)速170r/min振蕩培養(yǎng)10_12h后，每瓶取樣l_2mL，純化水適當(dāng)稀釋后用可見光分光光度計(jì)檢測(cè)并計(jì)算OD600值約為I即可；以5%-7%的接種量接種到種子罐內(nèi)的IOL羅氏雞蛋斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)基中，采用常規(guī)的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)過程中自動(dòng)補(bǔ)加濃氨溶液以及稀鹽酸調(diào)節(jié)pH，經(jīng)過大約12h培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵收率--為3g/L，菌體總蛋白中目的蛋白rTPA38 為 15%。
【權(quán)利要求】
1.結(jié)核分枝桿菌菌體發(fā)酵的方法，包括以下步驟: 一、一級(jí)擴(kuò)增液制備:取結(jié)核分枝桿菌斜面單菌落，置于含有3mL擴(kuò)增培養(yǎng)基的試管中，于全溫振蕩培養(yǎng)箱中恒溫37 ± I °C、轉(zhuǎn)速170r/min振蕩培養(yǎng)過夜；在超凈工作臺(tái)中向含有8mL擴(kuò)增培養(yǎng)基的三角瓶中加入50mg/mL氨芐青霉素8 μ I，然后接種80 μ I試管中的菌種，于全溫振蕩培養(yǎng)箱中恒溫37土 1°C、轉(zhuǎn)速170r/min振蕩培養(yǎng)10_12h后，取樣，至0D600值約為I即可停止培養(yǎng)； 二、二級(jí)擴(kuò)增液:接種前，在超凈工作臺(tái)中向2瓶含有500mL擴(kuò)增培養(yǎng)基的三角瓶中加入50mg/mL氨芐青霉素500 μ 1，然后取一級(jí)擴(kuò)增液5mL接種到二級(jí)擴(kuò)增培養(yǎng)基中，于全溫振蕩培養(yǎng)箱中恒溫37±1°C、轉(zhuǎn)速170r/min振蕩培養(yǎng)12_14h后，取樣，至0D600值約為1.5即可； 三、一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng):接種前設(shè)定通氣為2500L/h，罐壓為0.04Mp，攪拌速度為560rpm，溫度為37°C時(shí)的溶解氧為100% ；(2)接種前工作:連接500mL濃度為28%濃氨溶液補(bǔ)料瓶以及500mL濃度10%稀鹽酸溶液補(bǔ)料瓶，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至6.8-7.0 ; (3)接種:以5%_7%的接種量接種到種子罐內(nèi)的IOL發(fā)酵培養(yǎng)基中；(4)發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)溫度37土1°C，初始攪拌速度為IOOrpm,通氣量為300L/h,罐壓0.02-0.04Mpa, ρΗ6.8-7.0,培養(yǎng)過程中自動(dòng)補(bǔ)加濃氨溶液以及稀鹽酸調(diào)節(jié)ΡΗ，溶氧設(shè)定35%，控制在30%-40%之間，溶氧與轉(zhuǎn)速偶聯(lián)，若溶氧低于30%，加大通氣量，培養(yǎng)2-4h至OD_2~3，培養(yǎng)過程中每隔半小時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的0D600值； 四、二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng):(I)接種前設(shè)定通氣為16m3/h,罐壓為0.04Mp,攪拌速度為400rpm,溫度為37±1°C時(shí)的溶解氧為100% ； (2)接種前工作:連接500mL濃度為28%濃氨溶液補(bǔ)料瓶、500mL濃度10%稀HCl溶液補(bǔ)料瓶、4L80%碳源補(bǔ)料瓶；(3)接種:將一級(jí)發(fā)酵后的0D600符合要求的種子液以5-10%的接種量接種到發(fā)酵罐內(nèi)120L發(fā)酵培養(yǎng)基中；(4)發(fā)酵培養(yǎng):初始攪拌速度為IOOrpm,通氣量為1.8m3/h, pH6.8-7.0, 37土 TC培養(yǎng)，溶解氧下降至35%后，設(shè)定DO為35%與轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián)控制，控制在30%-40%，若關(guān)聯(lián)控制溶氧仍低于30%，取消關(guān)聯(lián)，可調(diào)轉(zhuǎn)速及逐漸調(diào)大通氣量，最大可調(diào)至16m3/h，培養(yǎng)過程中自動(dòng)補(bǔ)加濃氨溶液以及稀鹽酸溶液以調(diào)節(jié)PH，溶解氧設(shè)定值`為15%，當(dāng)0D600 > 3時(shí)，，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速控制溶氧在10%_20%，通氣量仍保持誘導(dǎo)前的通氣量，當(dāng)DO顯著上升時(shí)，以碳源限制模式流加入滅菌的80%碳源。37± I°C繼續(xù)連續(xù)通氣培養(yǎng)4至5小時(shí)后0D600 ^ 8收菌，培養(yǎng)過程中每隔約半小時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的0D600值； 收菌:采用管式高速離心機(jī)以45Hz頻率、14000rpm進(jìn)行離心菌液棄上清液，流速為`1.4-1.8L/min，將菌體收集存放于潔凈容器中，記得到發(fā)酵好的目的菌體； 五、培養(yǎng)基配制如下: (1)結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增培養(yǎng)基為羅氏雞蛋斜面培養(yǎng)基，購買自羅氏公司。 (2)發(fā)酵培養(yǎng)基(1000mL):硒酸鈉10mg，磷酸二氫鉀2.4g，b)硫酸鎂0.24g，c)枸櫞酸`0.6g, d)天門冬素3.6g, e)甘油20mL, f)馬鈴薯淀粉40g, g)新鮮雞卵液930mL, h)谷氨酸鈉0.15g余量為水。 (3)其它補(bǔ)料液的配制: 稀鹽酸溶液分裝(1000mL):取稀鹽酸HCl 1000mL各分裝500mL入2個(gè)500mL已滅菌補(bǔ)料瓶中，濃氨溶液分裝(1000mL):取濃氨溶液1000mL各分裝500mL入2個(gè)500mL已滅菌補(bǔ)料瓶中； 80%碳源配制(8L):稱取甘油6400g溶于純化水中至總體積為8L，分裝入5L補(bǔ)料瓶中，每瓶4L，121°C滅菌20min，冷卻后常溫密閉存放。 50mg/mL氨芐青 霉素(1OmL):稱取1g氨芐青霉素用20mL純化水溶解。在超凈工作臺(tái)中，用無菌針頭過濾器過濾除菌，分裝入已滅菌容器中，分裝規(guī)格為lmL/1.5ml EP管，共10管，2-8 °C冰箱中保存待用。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103695348SQ201310692668
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月16日
【發(fā)明者】何秀云, 崔玉華, 李申建, 賀運(yùn)泉 申請(qǐng)人:廣東瀚森生物藥業(yè)有限公司