大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI基因及其編碼蛋白和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明提供了克隆了一個(gè)大腹園蛛的絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI基因，其cDNA全長(zhǎng)為572bp，該基因具有SEQ?ID?No.1中的堿基序列，編碼具有SEQ?ID?No.2中的氨基酸序列，氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，AvSPI同時(shí)含有TIL（Trypsin?Inhibitor?Like?Cysteine?Rich?Domain）和Kunitz兩種結(jié)構(gòu)域，體外重組了該基因的編碼蛋白，重組蛋白具有較強(qiáng)的胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶A和蛋白酶K抑制活性。該基因及其重組蛋白活性的研究，對(duì)進(jìn)一步了解同時(shí)含有TIL和Kunitz兩種結(jié)構(gòu)域與其他已報(bào)道絲氨酸蛋白酶之間的差異及該抑制劑基因在大腹園蛛先天性免疫中的作用，對(duì)研制新的人類(lèi)疾病防治藥物具有重要的意義。
【專利說(shuō)明】大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI基因及其編碼蛋白和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地指一種大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白酶是所有生物體維持正常生命活動(dòng)所必需的一類(lèi)蛋白，其活性通過(guò)不同的方式在生物體內(nèi)被嚴(yán)格控制，其中，蛋白酶抑制劑是蛋白酶活性的主要調(diào)節(jié)因子，通過(guò)調(diào)控蛋白酶的生物活性而控制生物體的生理活動(dòng)并發(fā)揮其功能。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶抑制劑廣泛存在于病毒，細(xì)菌及動(dòng)植物等生物體內(nèi)。根據(jù)蛋白酶抑制劑的作用靶標(biāo)主要分為絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑和天冬氨酸蛋白酶抑制劑四大家族。其中以絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPI)研究較為廣泛和深入,至今,絲氨酸蛋白酶抑制劑家族已報(bào)道幾百個(gè)成員，根據(jù)序列的同源性、半胱氨酸殘基和分子中二硫鍵數(shù)目，絲氨酸蛋白酶抑制劑可分為 Kunitz>Kazal>Bowman-Birk>Serpin>TIL(Trypsin Inhibitor Like CysteineRich Domain)等幾個(gè)家族。絲氨酸蛋白酶抑制劑通過(guò)與祀標(biāo)酶相互結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合體調(diào)節(jié)酶的活性，防止絲氨酸蛋白酶的過(guò)度水解激活，在一系列的生理和病理過(guò)程中:如凝血、纖溶、補(bǔ)體活化、感染、細(xì)胞遷移等發(fā)揮著關(guān)鍵性的調(diào)控作用，同時(shí)也是生物體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。
[0003]同時(shí)，絲氨酸蛋蛋白酶抑制劑在醫(yī)學(xué)上具有良好的藥用價(jià)值，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，絲氨酸蛋白酶抑制劑Aprotinin已在臨床上用于胃炎、胰腺炎等疾病的治療。藥用水蛭中發(fā)現(xiàn)的胰蛋白酶抑制劑hirudin和吸血椿象中兩個(gè)Kazal型結(jié)構(gòu)域絲氨酸蛋白酶抑制劑具有抗凝血酶活性。水蛭來(lái)源的胰蛋白酶抑制劑LDTI能夠抑制HIV-1的復(fù)制，可用于艾滋病的防治。
[0004]蜘蛛是陸地上最成功的無(wú)脊椎動(dòng)物之一，蜘蛛毒素具有良好的藥用功效，據(jù)報(bào)道，蜘蛛毒液對(duì)治療腦溢血等疾病的 效果較好，可預(yù)防癲痛、老年性癡呆、腦動(dòng)脈硬化、腦供血不足、中風(fēng)后遺癥等疾病；其綜合利用潛力有待進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)，以提聞其藥用價(jià)值。研究表明，截至目前只對(duì)少數(shù)蜘蛛的絲氨酸蛋蛋白酶抑制劑進(jìn)行了研究。其功能為胰蛋白酶抑制活性、抗纖維蛋白溶解活性及神經(jīng)毒性。因此，對(duì)大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI的研究可以進(jìn)一步揭示蜘蛛自身防御機(jī)制，又可為其在藥用領(lǐng)域的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于提供一種大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI基因
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種涉及制備胰凝乳蛋白酶類(lèi)抑制劑藥物、制備枯草桿菌蛋白酶類(lèi)抑制劑藥物和制備蛋白酶K類(lèi)抑制劑藥物中的應(yīng)用。
[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的一種大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI，其氨基酸序列為:
[0008]I)由SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或者；[0009]2)與序列SEQ ID N0.2限定的氨基酸序列同源性在95~100%編碼相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列，或者；
[0010]3) SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有同等活性的由I)衍生的蛋白。
[0011]編碼上述大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI的基因?qū)儆诒景l(fā)明的范圍，本發(fā)明提供一個(gè)大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI的核苷酸序列如SEQ ID N0.1。
[0012]本發(fā)明合成用于編碼大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI的基因，其全長(zhǎng)為572bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。其中，該基因ORF為432bp，該基因編碼的蛋白具有144個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2。
[0013]應(yīng)該明確的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的SEQ ID N0.2氨基酸序列，在不影響其蛋白生物活性的前提下，對(duì)于其實(shí)施取代、缺少和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)序列比對(duì)同源性在95%以上，所得到所述蛋白的突變體序列。因此本發(fā)明還包括對(duì)SEQID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺少和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸得到高同源性且具有生物活性和相同功能的衍生蛋白。
[0014]本發(fā)明還提供了一種含有權(quán)利要求大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI基因的供體質(zhì)粒，供體質(zhì)粒是pFastBacl。
[0015]本發(fā)明還提供了一種含有大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI基因的大腸桿菌DHlOBac 菌株。
[0016]本發(fā)明還提供了一種含有大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI基因的重組病毒基因組。
[0017]作為優(yōu) 選方案，上述重組病毒基因組為重組桿狀病毒基因組Bacmid DNA
[0018]本發(fā)明提供了一種大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI制備方法，包括以下步驟:將由SEQ ID N0.1中第15位至第446位核苷酸克隆入pFastBacl (購(gòu)于Invitrogen)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，獲得重組供體質(zhì)粒pFastBacl-AvSPI,再將重組供體質(zhì)粒pFastBacl-AvSPI轉(zhuǎn)入大腸桿菌DHlOBac (購(gòu)于Invitrogen)菌株中，使其在大腸桿菌體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)座，產(chǎn)生含AvSPI基因的重組桿狀病毒基因組Bacmid DNA，將上述重組桿狀病毒基因組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染sf21細(xì)胞獲得重組桿狀病毒AcMNPV-AvSPI，再用AcMNPV-AvSPI感染sf21細(xì)胞至細(xì)胞出現(xiàn)腫脹和破裂，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用Ni2+-NTA親和層析純化，即制得重組大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI。
[0019]本發(fā)明的有益效果在于:
[0020]1、本發(fā)明的大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI全序列氨基酸結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋比對(duì)分析，未發(fā)現(xiàn)有任何相同蛋白。本發(fā)明的大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋比對(duì)分析，未發(fā)現(xiàn)任何相同基因。
[0021]2、本發(fā)明克隆了一個(gè)大腹園蛛的絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI基因的cDNA全長(zhǎng)，該基因具有SEQ ID N0.1中的堿基序列，編碼具有SEQ ID N0.2中的氨基酸序列，氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯不，AvSPI 同時(shí)含有 TIL (Trypsin Inhibitor Like Cysteine Rich Domain)和Kunitz兩種結(jié)構(gòu)域，體外重組了該基因的編碼蛋白，重組蛋白具有較強(qiáng)的胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶A和蛋白酶K抑制活性。該基因及其重組蛋白活性的研究，對(duì)進(jìn)一步了解同時(shí)含有TIL和Kunitz兩種結(jié)構(gòu)域與其他已報(bào)道絲氨酸蛋白酶之間的差異及該抑制劑基因在大腹園蛛先天性免疫中的作用，對(duì)研制新的人類(lèi)疾病防治藥物具有重要的意義。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為AvSPI cDNA全長(zhǎng)序列及其編碼的氨基酸序列，其中方框內(nèi)為起始密碼子和終止密碼子，下劃虛線為信號(hào)肽序列，單下劃線部分為T(mén)IL結(jié)構(gòu)域，雙下劃線部分為Kunitz結(jié)構(gòu)域，灰色背景方框?yàn)楸Ｊ匕腚装彼釟埢?，灰色背景圓框?yàn)榉磻?yīng)位點(diǎn)Pl殘基，斜體加粗為可能的多腺苷酸化信號(hào)。
[0023]圖2為AvSPI中TIL結(jié)構(gòu)域與TIL家族其他成員的序列比對(duì)，其中保守的半胱氨酸殘基用黑色圓點(diǎn)標(biāo)出，黑色星號(hào)所標(biāo)示的為反應(yīng)位點(diǎn)Pl殘基。
[0024]圖3為AvSPI中Kunitz結(jié)構(gòu)域與Kunitz家族其他成員的序列比對(duì)，其中保守的半胱氨酸殘基用黑色圓點(diǎn)標(biāo)出，黑色星號(hào)所標(biāo)示的為反應(yīng)位點(diǎn)Pl殘基。
[0025]圖4為重組大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI的純化電泳圖。
[0026]圖5為重組大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI的糖蛋白染色電泳圖。
[0027]圖6為重組大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI對(duì)胰凝乳蛋白酶抑制活性，誤差棒表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3 )。
[0028]圖7為重組大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI對(duì)枯草桿菌蛋白酶A的抑制活性，誤差棒表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3 )。
[0029]圖8為重組 大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI對(duì)蛋白酶K抑制活性，誤差棒表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)。
[0030]圖9 為 pFastBacl 的圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0031]為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。
[0032]實(shí)施例1大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI基因的克隆和序列分析
[0033]大腹園蛛cDNA 文庫(kù)構(gòu)建:利用 Promega 公司的 SV Total RNA Isolation System從大腹園蛛組織中提取總RNA,根據(jù)ZAP-cDNA? Synthesis Kit及ZAP-cDNA?Gigapack III Gold Cloning Kit (Stratagene)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)分離純化mRNA,合成cDNA第一條鏈、第二條鏈，補(bǔ)平cDNA末端，連接EcoR I接頭并磷酸化，XhoI限制性內(nèi)切酶消化，獲得兩端具有不同粘性末端的完全單向cDNA。
[0034]將該片段插入U(xiǎn)n1-ZAP XR VectorC lambda phage)。經(jīng)包裝,滴度測(cè)定和擴(kuò)增,利用 Exassist? Help Phage 和 SOLR 菌株從 Un1-ZAPXR Vector 上體外切割 pBluescript? 噬菌體。
[0035]大腹園蛛cDNA文庫(kù)EST序列的大規(guī)模測(cè)定:文庫(kù)中篩選陽(yáng)性克隆，使用載體通用引物T3進(jìn)行序列測(cè)定，利用DNAMAN軟件將獲得的EST數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)拼接，生成拼接而成的Contigs和未拼接的Singletons。分別將所獲得Contigs與Singletons在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTx分析。對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析尋找出與絲氨酸蛋白酶抑制劑基因同源的EST序列。
[0036]SEQ ID N0.1為目的基因大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI基因的核酸序列，AvSPI cDNA序列全長(zhǎng)572nt (SEQ ID N0.1中第I位至572位核苷酸)，開(kāi)放閱讀框(ORF)為432nt(SEQ ID N0.1中第15位至446位核苷酸)，共編碼144個(gè)氨基酸(SEQ ID N0.2中第I位至144位氨基酸)，其中包括一個(gè)含有15個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽(SEQ ID N0.2中第I位至15位氨基酸)，預(yù)測(cè)編碼蛋白的分子量為14432.06Da，等電點(diǎn)為4.23，由一個(gè)含有10個(gè)半胱氨酸殘基的TIL結(jié)構(gòu)域和一個(gè)含有6個(gè)半胱氨酸殘基的Kunitz結(jié)構(gòu)域組成，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。
[0037]利用MacVector (ver.6.5，Oxford Molecular Ltd.，Oxford, UK)軟件將 AvSPI 中TIL 與 Kunitz 結(jié)構(gòu)域分別與 TIL 家族(AMC1、BiVSP1、AT1、BST1、AcC1、Ixodidin 和 BmS1-7)和Kunitz家族化111(:1、(^&1110^、01111-1、8?9和HlChI)其他成員進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果由圖2和圖3所示，與TIL家族其他成員相比，AvSPI中TIL結(jié)構(gòu)域含有高度保守的10個(gè)半胱氨酸殘基，共形成5對(duì)二硫鍵(1-7、2-6、3-5、4-10和8_9)，AvSPI中TIL結(jié)構(gòu)域?qū)儆诘湫偷腡H家族絲氨酸蛋白酶抑制劑，根據(jù)Bania等對(duì)TIL類(lèi)蛋白酶抑制劑反應(yīng)位點(diǎn)Pl殘基的研究，預(yù)測(cè)AvSPI中TIL結(jié)構(gòu)域中Pl反應(yīng)位點(diǎn)為Arg殘基。同時(shí)，Kunitz家族其他成員進(jìn)行比對(duì)分析顯示，AvSPI中Kunitz結(jié)構(gòu)域含有高度保守的6個(gè)半胱氨酸殘基,共形成3對(duì)二硫鍵(1-6、2_4和3-5), AvSPI中Kunitz結(jié)構(gòu)域?qū)儆诘湫偷腒unitz家族絲氨酸蛋白酶抑制劑，預(yù)測(cè)AvSPI中Kunitz結(jié)構(gòu)域中P反應(yīng)位點(diǎn)為L(zhǎng)eu殘基。AvSPI與目前所報(bào)道的絲氨酸蛋白酶抑制劑其他成員不同，根據(jù)上述的保守半胱氨酸數(shù)目和結(jié)構(gòu)域，推測(cè)本發(fā)明所述的AvSPI為絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的新成員。
[0038]實(shí)施例2大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI真核表達(dá)和純化
[0039]對(duì)AvSPI基因整個(gè)開(kāi)放閱讀框(SEQ ID N0.1中第15位至446位核苷酸)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，
[0040]引物序列如下:
[0041]正向 引物為_(kāi)-ccggaattcatgaaagtcttggtgctgttatca^3_l,
[0042]EcoRI
[0043]反向引物為 5j_-cggggtaccttaatgatgatgatgatgatgagccagacaagtagcttcgcattc-3’
[0044]KpnI
[0045]以文庫(kù)中篩選的EST質(zhì)粒為模版，擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性2分鐘；然后94°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸60秒，共30個(gè)循環(huán)；最后延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分離割膠回收純化(promega)目的片段,經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I和Kpn I消化后與同樣被EcoR I和Kpn I消化后的pFastBacl在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接，獲得重組供體質(zhì)粒 pFastBac1-AvSPI。
[0046]重組供體質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DHlOBac菌株中，使其在大腸桿菌體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)座，產(chǎn)生含AvSPI基因的重組桿狀病毒基因組Bacmid DNA，將上述重組桿狀病毒基因組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染sf21細(xì)胞獲得重組桿狀病毒AcMNPV-AvSPI，再用AcMNPV-AvSPI感染sf21細(xì)胞至細(xì)胞出現(xiàn)腫脹和破裂，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用Ni2+-NTA親和層析純化，用10%Tricine - SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，重組桿狀病毒AcMNPV-AvSPI侵染sf21細(xì)胞可高量表達(dá)重組AvSPI。純化后蛋白經(jīng)糖蛋白染色試劑盒(GelCode GlycoproteinStaining Kit, Pierce, Rockford, IL, USA)檢測(cè)顯示,重組大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI為糖蛋白，結(jié)果見(jiàn)圖5。后續(xù)活性實(shí)驗(yàn)中所述重組AvSPI采用Bio-Rad Protein Assay試劑盒(Bio-Rad, Hercules, CA，USA)進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。
[0047]實(shí)施例3重組大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI對(duì)不同絲氨酸蛋白酶的抑制活性
[0048]不同濃度的重組大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI溶解于0.05M Tris-HCl(pH=8.0)緩沖溶液分別與胰凝乳蛋白酶(終濃度為lOOnM)、枯草桿菌蛋白酶A (終濃度為IOOnM)和蛋白酶K (終濃度為IOOnM)于0.05M Tris-HCl緩沖液于37°C下孵育30分鐘后，再加入終濃度為 0.5mM 發(fā)色底物 succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroaniIide (Suc-AAPF-pNA, Sigma)啟動(dòng)反應(yīng)，應(yīng)用Bio-rad (美國(guó))公司生產(chǎn)的iMark吸收光酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)A410的數(shù)值，加入同體積的0.05M Tris-HCl緩沖溶液與空白對(duì)照，此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7和圖8，重組大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI能很有效的抑制胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶A和蛋白酶K的活性。
[0049]綜合上述研究結(jié)果:本發(fā)明克隆得到了一個(gè)含有TIL和Kunitz兩種結(jié)構(gòu)域的新型絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI,制備了重組大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI并驗(yàn)證了AvSPI對(duì)胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶A和蛋白酶K具有很強(qiáng)的抑制活性。重組大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI可能有助于胰凝乳蛋白酶類(lèi)抑制劑、枯草桿菌蛋白酶類(lèi)抑制劑和蛋白酶K類(lèi)抑制劑藥物的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。
[0050]其它未詳細(xì)說(shuō)明的部分均為現(xiàn)有技術(shù)。盡管上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，人們還可以根據(jù)本實(shí)施例在不經(jīng)創(chuàng)造性前提下獲得其他實(shí) 施例，這些實(shí)施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI，其氨基酸序列為: 1)由SEQID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或者； 2)與序列SEQID N0.2限定的氨基酸序列同源性在95~100%編碼相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列，或者； 3)SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有同等活性的由I)衍生的蛋白。
2.編碼權(quán)利要求1所示蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所示基因，其核苷酸序列如SEQID N0.1。
4.一種重組供體質(zhì)粒，其特征在于:它含有權(quán)利要求2和3所述基因的供體質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組供體質(zhì)粒,其特征在于:所述的供體質(zhì)粒是pFastBacl。
6.含有根據(jù)權(quán)利要求4或5所述重組供體質(zhì)粒的大腸桿菌DHlOBac菌株。
7.含有權(quán)利要求2和3所述基因的重組病毒基因組。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重 組病毒基因組，其特征在于:所述重組病毒基因組為重組桿狀病毒基因組Bacmid DNA。
9.下述各項(xiàng)之一在制備胰凝乳蛋白酶類(lèi)抑制劑藥物、制備枯草桿菌蛋白酶類(lèi)抑制劑藥物和制備蛋白酶K類(lèi)抑制劑藥物中的應(yīng)用。 1)權(quán)利要求4或5所述的重組供體質(zhì)粒； 2)含有根據(jù)權(quán)利要求4或5所述重組供體質(zhì)粒的大腸桿菌DHlOBac菌株； 3)含有權(quán)利要求2和3所述基因的重組病毒基因組。
10.一種大腹園蛛絲氨酸蛋白酶抑制劑AvSPI制備方法，其特征在于:是將權(quán)利要求2或3所述的基因轉(zhuǎn)入病毒基因組中。
【文檔編號(hào)】C12N15/15GK103641911SQ201310695392
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月17日
【發(fā)明者】萬(wàn)虎, 李建洪, 高娃, 游紅 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)