一種降解速率可控的微孔淀粉及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種降解速率可控的微孔淀粉及其制備方法。微孔淀粉具有較大的比表面積,一定條件下分散在水及其它溶劑中,仍能保持結構的完整性,但使用安全性較低。本發(fā)明配制玉米淀粉漿溶液后,用稀酸進行出孔預處理,中和洗滌,加入α-淀粉酶和糖化酶恒溫反應,再中和離心,真空冷凍凍干得微孔淀粉,與膠原蛋白混合并加入交聯(lián)劑,恒溫反應,洗滌凍干得目的產(chǎn)品。本發(fā)明作為可生物降解組織工程用止血材料,具有適宜的微觀結構和孔隙率,具有優(yōu)良的止血性能和可控的降解速率;當出血時,適于血細胞附著在材料表面形成一種凝膠狀混合物,從而達到止血的效果。
【專利說明】一種降解速率可控的微孔淀粉及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領域,具體涉及一種降解速率可控的微孔淀粉及其制備方法。
【背景技術】
[0002]微孔淀粉又稱為多孔淀粉,是原淀粉顆粒經(jīng)人工方法處理,即用鹽酸、淀粉酶適當水解后得到的多孔狀淀粉,是一種全新的變性淀粉。它具有較大的比表面積,一定條件下分散在水及其它溶劑中,仍能保持結構的完整性,因此具有良好的吸水、吸油性能,可作為香精、香料、風味物質、色素、藥劑及保健食品中功能成分的吸附載體,并且成本較低,可自然降解。它的優(yōu)勢在于:⑴對物體吸附是一種物理方式;⑵具有較大的比孔容、比表面積和良好的吸附性(吸水能力);⑶堆積密度和顆粒密度小,結構疏松K4)具有分子篩的作用。
[0003]類人膠原蛋白是將人體已知序列膠原蛋白的一段mRNA逆轉錄生成cDNA后,經(jīng)過特定序列重復和修飾,轉化于大腸桿菌中,并經(jīng)過高密度發(fā)酵、分離提取及純化而得。該蛋白從根本上解決了動物提取膠原蛋白的水不溶性和病毒隱患(瘋牛病、豬瘟疫、禽流感)等問題,具有良好的促新細胞形成和促上皮細胞、成纖維細胞生長功能,相比動物膠原蛋白更具有良好的生物相容性,免疫排異反應低。
【發(fā)明內容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種使用安全性大幅度提高的降解速率可控的微孔淀粉及其制備方法。
[0005]本發(fā)明所采用的技術方案是:
一種降解速率可控的微孔淀粉的制·備方法,其特征在于:
由以下步驟實現(xiàn):
步驟一:配制質量分數(shù)為38~40%的玉米淀粉溶液;
步驟二:用稀酸對玉米淀粉漿溶液進行出孔預處理,置于50°C恒溫水浴鍋中;反應4h后加入緩沖液中和,離心洗滌,離心條件為3000r/min,4°C,lOmin,反復操作3次,移去上清;
步驟三:以每克干基玉米淀粉加入60國際單位α-淀粉酶的比例稱取α-淀粉酶,再按國際單位比α-淀粉酶:糖化酶=1:(1~5)的比例稱取糖化酶,將α-淀粉酶和糖化酶混合,加入步驟二得到的玉米淀粉漿溶液中,加入緩沖液調節(jié)pH至4.5~5.0,在恒溫攪拌器上反應,反應時間為18~22h,反應溫度為45~55°C ;
步驟四:加堿中和,離心3~5次,轉速為3000r/min,反應溫度為4°C,每次離心lOmin,棄上清,真空冷凍干燥機凍干,得微孔淀粉;
步驟五:將膠原蛋白與微孔淀粉按照(10~20):1的質量比,在50mL離心管中混合并加入交聯(lián)劑,于37°C恒溫培養(yǎng)箱中反應24~72h后取出洗滌,凍干,得降解速率可控的微孔淀粉。[0006]步驟一中,所用玉米淀粉的分子量為7000~lOOOODa ;
步驟一中,配制玉米淀粉溶液使用蒸餾水。
[0007]步驟二中,稀酸選取摩爾濃度為1.5~3.0mol/L的稀鹽酸;
步驟二中,緩沖液選取摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04溶液。
[0008]步驟三中,α -淀粉酶活度為5.0 X 104IU/g,糖化酶活度為1.0 X 105IU/g ;
步驟三中,緩沖液由摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04溶液和摩爾濃度為0.lmol/L的檸檬酸溶液按體積比2:1的比例混合而成。
[0009]步驟四中,堿指摩爾濃度為1.5~2.0mol/L的NaOH溶液。
[0010]步驟五中,交聯(lián)劑為質量分數(shù)為0.05~0.2%的戍二醒溶液;
步驟五中,交聯(lián)反應體系的溶劑為體積分數(shù)為95%的乙醇;
步驟五中,膠原蛋白選取基因工程技術高密度發(fā)酵生產(chǎn)的人源型膠原蛋白。
[0011]所述的一種降解速率可控的微孔淀粉的制備方法制備的降解速率可控的微孔淀粉。
[0012]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
本發(fā)明提供的一種降解速率可控的微孔淀粉,作為可生物降解組織工程用止血材料,具有適宜的微觀結構和孔隙率,具有優(yōu)良的止血性能和可控的降解速率。當出血時,適于血細胞附著在材料表面形成一種凝膠狀混合物,從而達到止血的效果。與現(xiàn)有技術相比,該止血材料又具有其自身顯著的優(yōu)點:免疫排異反應更低,而且徹底杜絕了膠原蛋白止血材料不可避免的病毒隱患,使用安全性大幅度提高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為微孔淀粉掃描電鏡(SEM)。左側為微孔淀粉酶解后表面成孔情況,右側為與少量類人膠原蛋白交聯(lián)的微孔淀粉。
[0014]圖2為在兔子肝臟做出創(chuàng)面的照片。
[0015]圖3為微孔淀粉的止血效果對比照片。左側為外購的阿里斯泰止血粉,右側為類人膠原蛋白-微孔淀粉組。
【具體實施方式】
[0016]下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細的說明。
[0017]本發(fā)明說涉及的一種降解速率可控的微孔淀粉的制備方法,由以下步驟實現(xiàn):步驟一:配制質量分數(shù)為38~40%的玉米淀粉溶液;所用玉米淀粉的分子量為7000~
lOOOODa,配制玉米淀粉溶液使用蒸餾水。
[0018]步驟二:用摩爾濃度為1.5~3.0mol/L的稀鹽酸對玉米淀粉漿溶液進行出孔預處理,置于50°C恒溫水浴鍋中;反應4h后加入摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04緩沖液中和,離心洗滌,離心條件為3000r/min,4°C,lOmin,反復操作3次,移去上清。
[0019]步驟三:以每克干基玉米淀粉加入60國際單位α-淀粉酶的比例稱取α-淀粉酶,再按國際單位比α-淀粉酶:糖化酶=1:(1~5)的比例稱取糖化酶,α-淀粉酶活度為5.0 X 104IU/g,糖化酶活度為1.0 X 105IU/g,將α -淀粉酶和糖化酶混合,加入步驟二得到的玉米淀粉漿溶液中,加入緩沖液調節(jié)pH至4.5~5.0,緩沖液由摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04溶液和摩爾濃度為0.lmol/L的檸檬酸溶液按體積比2:1的比例混合而成;在恒溫攪拌器上反應,反應時間為18~22h,反應溫度為45~55°C。
[0020]步驟四:加摩爾濃度為1.5~2.0mol/L的NaOH溶液中和,離心3~5次,轉速為3000r/min,反應溫度為4°C,每次離心lOmin,棄上清,將沉淀轉移至一次性培養(yǎng)皿中,于-80°C超低溫保藏箱預凍6h,后移入冷阱預冷完成的真空冷凍干燥機進行干燥48h,得微孔淀粉;
步驟五:將膠原蛋白與微孔淀粉按照(10~20):1的質量比,在50mL離心管中混合并加入交聯(lián)劑,交聯(lián)劑為質量分數(shù)為0.05~0.2%的戊二醛溶液,交聯(lián)反應體系的溶劑為體積分數(shù)為95%的乙醇,密封后放入生化培養(yǎng)箱或電熱鼓風干燥箱中進行交聯(lián),溫度為37°C,持續(xù)交聯(lián)24h。交聯(lián)結束后,使用無菌注射用水進行離心洗滌,共洗滌6次,移去上清液。洗滌結束后于真空冷凍干燥機中凍干48h。凍干結束后,加以內包裝密封,然后以> 25KGY的照射劑量進行Co,輻照滅菌,得降解速率可控的微孔淀粉。膠原蛋白選取基因工程技術高密度發(fā)酵生產(chǎn)的人源型膠原蛋白。
[0021]淀粉經(jīng)酸解酶解反應處理后,顆粒表面成孔明顯,孔隙分布密集均勻,淀粉顆粒大小均勻,與對照品阿里斯泰止血粉相比,吸水性能好,生物相容性更優(yōu)。
[0022]實施例1:
步驟一:配制質量分數(shù)為38%的玉米淀粉溶液;所用玉米淀粉的分子量為7000Da,配制玉米淀粉溶液使用蒸餾水。
[0023]步驟二:用摩爾濃度為1.5mol/L的稀鹽酸對玉米淀粉漿溶液進行出孔預處理,置于50°C恒溫水浴鍋中;反應4h后加入摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04緩沖液中和,離心洗漆,離心條件為3000r/min, 4°C,lOmin,移去上清。
`[0024]步驟三:以每克干基玉米淀粉加入60國際單位α-淀粉酶的比例稱取淀粉酶,再按國際單位比α-淀粉酶:糖化酶=1:1的比例稱取糖化酶,α-淀粉酶活度為5.0 X 104IU/g,糖化酶活度為1.0 X 105IU/g,將α -淀粉酶和糖化酶混合,加入步驟二得到的玉米淀粉漿溶液中,加入緩沖液調節(jié)pH至4.5~5.0,緩沖液由摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04溶液和摩爾濃度為0.lmol/L的檸檬酸溶液按體積比2:1的比例混合而成;在恒溫攪拌器上反應,反應時間為18h,反應溫度為45°C。
[0025]步驟四:加摩爾濃度為1.5mol/L的NaOH溶液中和,離心3次,轉速為3000r/min,反應溫度為4°C,每次離心lOmin,棄上清,真空冷凍干燥機凍干,得微孔淀粉;
步驟五:將膠原蛋白與微孔淀粉按照10:1的質量比,在50mL離心管中混合并加入交聯(lián)劑,交聯(lián)劑為質量分數(shù)為0.05%的戊二醒溶液,交聯(lián)反應體系的溶劑為體積分數(shù)為95%的乙醇,于37°C恒溫培養(yǎng)箱中反應24h后取出洗滌,凍干,得降解速率可控的微孔淀粉。膠原蛋白選取基因工程技術高密度發(fā)酵生產(chǎn)的人源型膠原蛋白。
[0026]實施例2:
步驟一:配制質量分數(shù)為39%的玉米淀粉溶液;所用玉米淀粉的分子量為8000Da,配制玉米淀粉溶液使用蒸餾水。
[0027]步驟二:用摩爾濃度為2.0mol/L的稀鹽酸對玉米淀粉漿溶液進行出孔預處理,置于50°C恒溫水浴鍋中;反應4h后加入摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04緩沖液中和,離心洗漆,離心條件為3000r/min, 4°C,lOmin,移去上清。[0028]步驟三:以每克干基玉米淀粉加入60國際單位α-淀粉酶的比例稱取淀粉酶,再按國際單位比α-淀粉酶:糖化酶=1:3的比例稱取糖化酶,α-淀粉酶活度為5.0 X 104IU/g,糖化酶活度為1.0 X 105IU/g,將α -淀粉酶和糖化酶混合,加入步驟二得到的玉米淀粉漿溶液中,加入緩沖液調節(jié)pH至4.5~5.0,緩沖液由摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04溶液和摩爾濃度為0.lmol/L的檸檬酸溶液按體積比2:1的比例混合而成;在恒溫攪拌器上反應,反應時間為20h,反應溫度為50°C。
[0029]步驟四:加摩爾濃度為1.7mol/L的NaOH溶液中和,離心4次,轉速為3000r/min,反應溫度為4°C,每次離心lOmin,棄上清,真空冷凍干燥機凍干,得微孔淀粉;
步驟五:將膠原蛋白與微孔淀粉按照15:1的質量比,在50mL離心管中混合并加入交聯(lián)劑,交聯(lián)劑為質量分數(shù)為0.1%的戊二醒溶液,交聯(lián)反應體系的溶劑為體積分數(shù)為95%的乙醇,于37°C恒溫培養(yǎng)箱中反應48h后取出洗滌,凍干,得降解速率可控的微孔淀粉。膠原蛋白選取基因工程技術高密度發(fā)酵生產(chǎn)的人源型膠原蛋白。
[0030]實施例3:
步驟一:配制質量分數(shù)為40%的玉米淀粉溶液;所用玉米淀粉的分子量為lOOOODa,配制玉米淀粉溶液使用蒸餾水。
[0031]步驟二:用摩爾濃度為3.0mol/L的稀鹽酸對玉米淀粉漿溶液進行出孔預處理,置于50°C恒溫水浴鍋中;反應4h后加入摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04緩沖液中和,離心洗漆,離心條件為3000r/min, 4°C,lOmin,移去上清。
[0032]步驟三:以每克干基玉米淀粉加入60國際單位α-淀粉酶的比例稱取淀粉酶,再按國際單位比α-淀粉酶:糖化酶=1:5的比例稱取糖化酶,α-淀粉酶活度為
5.0 X 104IU/g,糖化酶活度為·1.0 X 105IU/g,將α -淀粉酶和糖化酶混合,加入步驟二得到的玉米淀粉漿溶液中,加入緩沖液調節(jié)pH至4.5~5.0,緩沖液由摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04溶液和摩爾濃度為0.lmol/L的檸檬酸溶液按體積比2:1的比例混合而成;在恒溫攪拌器上反應,反應時間為22h,反應溫度為55°C。
[0033]步驟四:加摩爾濃度為2.0mol/L的NaOH溶液中和,離心5次,轉速為3000r/min,反應溫度為4°C,每次離心lOmin,棄上清,真空冷凍干燥機凍干,得微孔淀粉;
步驟五:將膠原蛋白與微孔淀粉按照20:1的質量比,在50mL離心管中混合并加入交聯(lián)劑,交聯(lián)劑為質量分數(shù)為0.2%的戊二醒溶液,交聯(lián)反應體系的溶劑為體積分數(shù)為95%的乙醇,于37°C恒溫培養(yǎng)箱中反應72h后取出洗滌,凍干,得降解速率可控的微孔淀粉。膠原蛋白選取基因工程技術高密度發(fā)酵生產(chǎn)的人源型膠原蛋白。
[0034]類人膠原蛋白-微孔淀粉止血材料性能測試:
1、孔隙率的測定
干燥的類人膠原蛋白一微孔淀粉止血材料成品若干塊:矩形,正圓形和不規(guī)則形狀各3個樣,本實驗室自制。選一個容積為50mL的燒杯,倒?jié)M乙醇稱重Mi,把重為Ms的材料浸入乙醇中,超聲脫氣,務必使乙醇充盈于材料,然后稱重為M2,把浸滿了乙醇的樣品取出后,稱剩余的乙醇的重量為M3,計算孔隙率Θ,每組測三個樣,最后求平均值。
[0035]Θ = (JM2—M3—Ms) / (i/j—#3)
表1類人膠原蛋白-微孔淀粉止血材料孔隙率的測定
【權利要求】
1.一種降解速率可控的微孔淀粉的制備方法,其特征在于:由以下步驟實現(xiàn):步驟一:配制質量分數(shù)為38~40%的玉米淀粉溶液;步驟二:用稀酸對玉米淀粉漿溶液進行出孔預處理,置于50°C恒溫水浴鍋中;反應4h后加入緩沖液中和,離心洗滌,離心條件為3000r/min,4°C,lOmin,反復操作3次,移去上清;步驟三:以每克干基玉米淀粉加入60國際單位α-淀粉酶的比例稱取α-淀粉酶,再按國際單位比α-淀粉酶:糖化酶=1:(1~5)的比例稱取糖化酶,將α-淀粉酶和糖化酶混合,加入步驟二得到的玉米淀粉漿溶液中,加入緩沖液調節(jié)pH至4.5~5.0,在恒溫攪拌器上反應,反應時間為 18~22h,反應溫度為45~55°C ;步驟四:加堿中和,離心3~5次,轉速為3000r/min,反應溫度為4°C,每次離心lOmin,棄上清,真空冷凍干燥機凍干,得微孔淀粉;步驟五:將膠原蛋白與微孔淀粉按照(10~20):1的質量比,在50mL離心管中混合并加入交聯(lián)劑,于37°C恒溫培養(yǎng)箱中反應24~72h后取出洗滌,凍干,得降解速率可控的微孔淀粉。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種降解速率可控的微孔淀粉的制備方法,其特征在于:步驟一中,所用玉米淀粉的分子量為7000~lOOOODa ;步驟一中,配制玉米淀粉溶液使用蒸餾水。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種降解速率可控的微孔淀粉的制備方法,其特征在于:步驟二中,稀酸選取摩爾濃度為1.5~3.0mol/L的稀鹽酸;步驟二中,緩沖液選取摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04溶液。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種降解速率可控的微孔淀粉的制備方法,其特征在于:步驟三中,α -淀粉酶活度為5.0 X 104IU/g,糖化酶活度為1.0 X 105IU/g ;步驟三中,緩沖液由摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04溶液和摩爾濃度為0.lmol/L的檸檬酸溶液按體積比2:1的比例混合而成。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種降解速率可控的微孔淀粉的制備方法,其特征在于:步驟四中,堿指摩爾濃度為1.5~2.0mol/L的NaOH溶液。
6.根據(jù)權利要求5所述的一種降解速率可控的微孔淀粉的制備方法,其特征在于:步驟五中,交聯(lián)劑為質量分數(shù)為0.05~0.2%的戊二醛溶液;步驟五中,交聯(lián)反應體系的溶劑為體積分數(shù)為95%的乙醇;步驟五中,膠原蛋白選取基因工程技術高密度發(fā)酵生產(chǎn)的人源型膠原蛋白。
7.一種根據(jù)權利要求6所述的一種降解速率可控的微孔淀粉的制備方法制備的降解速率可控的微孔淀粉。
【文檔編號】C12P19/14GK103710409SQ201310698617
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權日:2013年12月18日
【發(fā)明者】范代娣, 馬曉軒, 段志廣, 楊嬋媛, 蒙俊樺, 王琪凱 申請人:西北大學