一種β-內(nèi)切葡聚糖酶突變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種β-內(nèi)切葡聚糖酶突變體，是氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1的β-內(nèi)切葡聚糖酶的第56位氨基酸由Val變?yōu)镮le，第212位氨基酸由Asp變?yōu)锳sn。所述突變體的最適作用溫度為65℃，且在60-70℃范圍內(nèi)能保持80%以上的酶活；所述突變體在75℃條件下處理5min，仍能保持40%以上的酶活，80℃條件下處理2min，能保持50%以上的酶活，與野生型相比，突變體的耐熱性得到顯著提升。本發(fā)明所述里氏木霉工程菌能高效重組表達(dá)突變體蛋白，20L發(fā)酵罐發(fā)酵酶活高達(dá)7120U/mL，比野生型提高了50.5%。
【專利說明】一種內(nèi)切葡聚糖酶突變體及其應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于功能基因改造【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種0 -內(nèi)切葡聚糖酶突變體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在當(dāng)前世界糧食危機(jī)和能源危機(jī)的背景下，纖維素乙醇等新能源技術(shù)被愈發(fā)重視。作為最豐富的可再生資源之一，每年由光合作用產(chǎn)生的纖維素可達(dá)到1000億噸。發(fā)展纖維素降解技術(shù)，將農(nóng)林廢棄物轉(zhuǎn)化為能源或者工業(yè)原料是全球關(guān)注的熱點(diǎn)。對(duì)于纖維素乙醇的生產(chǎn)，木質(zhì)纖維素的糖化水解是最關(guān)鍵的一步，占到了整個(gè)纖維素乙醇生產(chǎn)成本的一半以上，而木質(zhì)纖維素的糖化水解主要依賴于纖維素降解酶。當(dāng)前，降低用酶成本，提高還原糖得率及纖維素轉(zhuǎn)化率成為研究的主要目標(biāo)。
[0003](6-內(nèi)切葡聚糖酶是纖維素酶系中的一個(gè)重要組成成分，它作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解(6-1,4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量帶有非還原末端的小分子纖維素。而在木質(zhì)纖維素糖化水解過程中，底物一般要經(jīng)過高溫預(yù)處理，而且纖維素酶參與的反應(yīng)一般都是在較高的溫度條件下，所以尋找耐高溫的(6-內(nèi)切葡聚糖酶對(duì)于木質(zhì)纖維素的糖化水解走向工業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。[0004]定向進(jìn)化是蛋白質(zhì)工程中常用的一種蛋白改造方法，可以在對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能信息不清楚的情況下對(duì)目的蛋白進(jìn)行改造，使用高通量篩選方法找出性能改善的突變體，進(jìn)行多輪的突變和篩選，可以進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的性能。定向進(jìn)化這種改造策略對(duì)于提高蛋白質(zhì)的耐熱性顯示出了巨大的優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種(6-內(nèi)切葡聚糖酶突變體及其應(yīng)用。本發(fā)明通過對(duì)來源于斜臥青霉(Penicillium decumbens)的P -內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造,獲得了突變體蛋白，與野生型相比，突變體的耐熱性得到顯著提高，從而有利于實(shí)現(xiàn)其在纖維素糖化水解中的廣泛應(yīng)用。
[0006] 申請(qǐng)人:對(duì)斜臥青霉P -內(nèi)切葡聚糖酶利用定向進(jìn)化技術(shù)進(jìn)行分子改造，經(jīng)過大量的篩選，發(fā)現(xiàn)V56I和D212N這兩個(gè)突變位點(diǎn)能引起(6-內(nèi)切葡聚糖酶耐熱性的改變，從而促成本發(fā)明。
[0007]本發(fā)明一方面提供了一種P -內(nèi)切葡聚糖酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO:I的P -內(nèi)切葡聚糖酶的第56位氨基酸由Val變?yōu)镠e，第212位氨基酸由Asp變?yōu)锳sn。
[0008]上述0 -內(nèi)切葡聚糖酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO:3，其一種編碼基因的核酸序列為SEQ ID NO:4。
[0009]本發(fā)明另一方面提供了攜帶有編碼序列為SEQ ID NO:4的P -內(nèi)切葡聚糖酶突變體基因的表達(dá)載體。
[0010]本發(fā)明還提供攜帶上述表達(dá)載體的里氏木霉(Trichoderma reesei)工程菌株。[0011]本發(fā)明通過定向進(jìn)化技術(shù)獲得了一種(6-內(nèi)切葡聚糖酶突變體，并構(gòu)建得到重組表達(dá)該突變體的里氏木霉工程菌株。所述突變體的最適作用溫度為65°c，且在60-70°C范圍內(nèi)能保持80%以上的酶活；所述突變體在75°C條件下處理5min，仍能保持40%以上的酶活，80°C條件下處理2min，能保持50%以上的酶活，與野生型相比，突變體的耐熱性得到顯著提升。本發(fā)明所述里氏木霉工程菌能高效重組表達(dá)突變體蛋白，20L發(fā)酵罐發(fā)酵酶活高達(dá)7120U/mL，比野生型提高了 50.5%。本發(fā)明獲得的P -內(nèi)切葡聚糖酶突變體能顯著提高木質(zhì)纖維素的糖化率，且在高溫條件下酶解效果顯著優(yōu)于野生型，更適合于纖維素轉(zhuǎn)糖工業(yè)化生產(chǎn)條件,能大幅度降低用酶成本,從而降低生產(chǎn)成本,有利于(6-內(nèi)切葡聚糖酶突變體在纖維素轉(zhuǎn)糖工業(yè)中的廣泛應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1: P -內(nèi)切葡聚糖酶突變體GluM15與野生型Glu98最適作用溫度比較圖；
[0013]圖2: P -內(nèi)切葡聚糖酶突變體GluM15與野生型Glu98的耐熱性比較圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下實(shí)施例是為了更好地說明闡述本
【發(fā)明內(nèi)容】
，本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實(shí)施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護(hù)和權(quán)利要求范圍不限于所提供的案例。
[0015]實(shí)施例1 P -內(nèi)切葡聚糖酶突變體基因的合成及擴(kuò)增
[0016]為了提高來源于斜臥青霉(Penicillium decumbens)的P -內(nèi)切葡聚糖酶(命名為Glu98，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1，基因序列為SEQ ID NO:2)的耐熱性， 申請(qǐng)人:使用定向進(jìn)化技術(shù)獲得了數(shù)目較多的該酶的突變體，然后對(duì)突變體進(jìn)行了篩選。
`[0017]設(shè)計(jì)PCR 引物 Glu98-F、Glu98_R 如下:
[0018]Glu98-Fl:GGCGAATTCGAGCTGGCTCAGTTCTGTGACCAATATGG (下劃線為限制性內(nèi)切酶EcoRI識(shí)別位點(diǎn))
[0019]Glu98-Rl:ATAGCGGCCGCCTAGTACACGCTCGCAGACCAGTGG (下劃線為限制性內(nèi)切酶NotI識(shí)別位點(diǎn))
[0020]使用P -內(nèi)切葡聚糖酶Glu98的基因序列作為模板,通過上述引物用GeneMorphII隨機(jī)突變PCR試劑盒(Stratagene)對(duì)目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，使用EcoRI和NotI對(duì)回收純化好的PCR產(chǎn)物和pET21a載體進(jìn)行雙酶切，將雙酶切后的兩種片段用Ligase連接，經(jīng)過測序后選擇目的基因測序正確的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，涂布于含有Amp的LB平板，在37°C倒置培養(yǎng)，待轉(zhuǎn)化子長出后，用牙簽逐個(gè)挑入96孔板，每個(gè)孔中加入150ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培養(yǎng)基，37°C 220rpm培養(yǎng)6h左右，離心后棄上清，用緩沖液將菌體重懸，反復(fù)凍融破壁，獲得含有(6-內(nèi)切葡聚糖酶的大腸桿菌細(xì)胞裂解液。
[0021]將30uL細(xì)胞裂解液對(duì)應(yīng)加入兩個(gè)新的96孔板，一個(gè)于70°C處理lOmin，另一個(gè)對(duì)應(yīng)板4°C冷藏，兩個(gè)96孔板都加入30uL葡聚糖酶底物，于37°C反應(yīng)30min后，用DNS法測定生成的還原糖，以生成的還原糖的量來測定突變子經(jīng)高溫處理和未經(jīng)高溫處理后的酶活力。篩選結(jié)果顯示，絕大多數(shù)的突變體的耐熱性并沒有發(fā)生明顯變化，部分突變體的耐熱性出現(xiàn)了下降，部分突變體甚至失去了酶活力，只有極少數(shù)的突變體對(duì)高溫條件表現(xiàn)出了耐受性。以此方法對(duì)突變體進(jìn)行大量篩選后，篩選到了一株耐熱性得到明顯提高的突變體。對(duì)突變體的目的基因測序，確定了突變的氨基酸位點(diǎn)。最終 申請(qǐng)人:獲得了能提高(6-內(nèi)切葡聚糖酶耐熱性的突變組合V56I和D212N。
[0022]測序結(jié)果顯示，本發(fā)明獲得的含V56I和D212N兩點(diǎn)突變的P -內(nèi)切葡聚糖酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO:3，編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:4。
[0023]將(6-內(nèi)切葡聚糖酶突變體基因命名為GluM15，設(shè)計(jì)兩端引入了 BamHI和XbaI酶切位點(diǎn)的引物Glu98-F2、Glu98-R2如下:
[0024]Glu98-F2:GGCGGATCCGAGCTGGCTCAGTTCTGTGACCAATATGG (下劃線為限制性內(nèi)切酶BamHI識(shí)別位點(diǎn))
[0025]Glu98-R2:ATATCTAGACTAGTACACGCTCGCAGACCAGTGG (下劃線為限制性內(nèi)切酶 XbaI識(shí)別位點(diǎn))
[0026]使用上述引物，以獲得的突變體作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了兩端帶有BamHI和XbaI酶切位點(diǎn)的P -內(nèi)切葡聚糖酶突變體基因GluM15。PCR反應(yīng)條件為:94°C變性5min ；94°C變性 30s，56°C復(fù)性 30s，72°C延伸 lmin,30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin0
[0027]通過上述同樣的PCR方法擴(kuò)增得到野生型P -內(nèi)切葡聚糖酶Glu98的基因片段，其編碼核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
[0028]實(shí)施例2里氏木霉工程菌株的構(gòu)建
[0029]將上述克隆得到的P -內(nèi)切葡聚糖酶突變體基因GluM15，通過BamHI和XbaI位點(diǎn)與里氏木霉表達(dá)載體PPST相連接，構(gòu)建得到表達(dá)載體pPST-GluM15。依照同樣方法構(gòu)建野生型的表達(dá)載體pPST-Glu98。
[0030]接種里氏木霉(Trichoderma reesei)菌絲于PDA平板上至生長出孢子；用接種刀切取邊長為3cm正方形菌塊，接種于IOOmL YEG(含1%葡萄糖、0.5%酵母粉)液體培養(yǎng)基中，30°C、220rpm培養(yǎng)12_16h ;使用多層濾紙過濾收集菌絲；將收集到的菌絲用無菌水沖洗，放入盛有20mL裂解酶液(Sigma L1412)的三角瓶中30°C緩慢旋轉(zhuǎn)震搖約1.5-2小時(shí)；觀察原生質(zhì)體的生成情況，當(dāng)有大量原生質(zhì)體生成時(shí),將酶解液倒于三層滅菌擦鏡紙過濾,收集濾液，3000rpm 離心 IOmin ;棄上清，用 STC 溶液(20% 蔗糖，50mM Tris-Cl，50mM CaCl2)洗滌兩次后，加適量STC溶液重懸，使游離原生質(zhì)體濃度約IO7個(gè)/mL。
[0031]取5 ii g pPST-GluM15DNA加入到100 u L原生質(zhì)體中，加入25 u L25%PEG輕輕混勻，冰浴20min ;然后緩慢分多次加入lmL25%PEG，輕輕混勻，室溫靜置5min后加入2mLSTC溶液，把原生質(zhì)體加到含100 u g/mL潮霉素的上層再生培養(yǎng)基(0.l%MgS04, 1%KH2P04, 0.6%(NH4)2S04, 1%葡萄糖，18.3%山梨醇，0.7%瓊脂糖)中，輕輕混勻后覆蓋到含100 u g/mL潮霉素下層基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板(2% 葡萄糖，0.5%(NH4) 2S04, 1.5%KH2P04, 0.06%MgS04, 0.06%CaCl2, 2%瓊脂)，28°C黑暗培養(yǎng)數(shù)天至轉(zhuǎn)化子長出。
[0032]提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，利用引物HyB-F和HyB-R (HyB-F:ACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACT ;和 HyB-R:AGAAGAAGATGTTGGCGACCTCGTATT )擴(kuò)增潮霉素基因驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。利用實(shí)施例1所述引物Glu98-F和Glu98-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。PCR擴(kuò)增條件為94°C變性5min ;94°C變性30s，56°C復(fù)性30s，72。。延伸lmin,30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin。通過瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR片段大小。經(jīng)過上述兩個(gè)PCR反應(yīng)驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子。將其中一株陽性轉(zhuǎn)化子命名為里氏木霉GluM15 (Trichoderma reeseiGluM15)。
[0033]采用上述同樣的轉(zhuǎn)化方法將野生型的表達(dá)載體pPST_Glu98轉(zhuǎn)化入里氏木霉中，構(gòu)建得到重組表達(dá)野生型(6-內(nèi)切葡聚糖酶Glu98的里氏木霉工程菌，命名為里氏木霉Glu98 (Trichoderma reesei Glu98)。
[0034]實(shí)施例3轉(zhuǎn)化子發(fā)酵驗(yàn)證
[0035]將上述兩株工程菌里氏木霉GluM15和里氏木霉Glu98分別接種于MM發(fā)酵培養(yǎng)基(1.5% 葡萄糖，1.7% 乳糖，2.5% 玉米漿，0.44%(NH4) 2S04,0.09%MgS04, 2%KH2P04,0.04%CaCl2,0.018%吐溫-80，0.018%微量元素，0.018%聚丙二醇-2000)，28°C培養(yǎng)48小時(shí)，然后25°C培養(yǎng)48小時(shí)，分別取發(fā)酵液上清，測定其酶活。結(jié)果顯示，野生型(6-內(nèi)切葡聚糖酶Glu98的發(fā)酵酶活為670U/mL，而突變體GluM15的發(fā)酵酶活高達(dá)1032U/mL，比野生型提高了 54%。
[0036]實(shí)施例4重組表達(dá)0 -內(nèi)切葡聚糖酶的耐熱性實(shí)驗(yàn)
[0037]分別在30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C，pH5.5 條件下，
對(duì)實(shí)施例3所述發(fā)酵上清液進(jìn)行3 -內(nèi)切葡聚糖酶酶活測定，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，做溫度-相對(duì)酶活曲線。結(jié)果如圖1所示，野生型(6-內(nèi)切葡聚糖酶Glu98的最適作用溫度為45°C ;而突變體GluM15的最適作用溫度為65°C，且在60_70°C范圍內(nèi)能保持80%以上的酶活。
[0038]將實(shí)施例3所述發(fā)酵上清液用pH5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋至約20U/mL，在75°C和80°C條件下分別處理2min和5min后，測定殘余酶活，以未處理樣品的酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。結(jié)果如圖2所示，野生型(6-內(nèi)切葡聚糖酶Glu98在75°C條件下處理2min，酶活僅剩不到20%，到80°C時(shí)酶活`幾乎為0 ;而突變體GluM15在75°C條件下分別處理2min和5min，仍能保持70%和50%的酶活，80°C條件下處理2min，仍能保持40%左右的酶活。
[0039]綜上所述，與野生型相比，本發(fā)明獲得的(6-內(nèi)切葡聚糖酶突變體的耐熱性得到顯著提升，有利于其在纖維素轉(zhuǎn)糖中的廣泛應(yīng)用。
[0040]實(shí)施例5發(fā)酵驗(yàn)證與P -內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)品制備
[0041]將上述兩株工程菌里氏木霉GluM15和里氏木霉Glu98分別接種于搖瓶種子培養(yǎng)基(葡萄糖 10-30g/L，土豆 100-200g/L)，溫度 28-30°C，轉(zhuǎn)速 200rpm，培養(yǎng)時(shí)間 23_25h，將發(fā)酵液接入二級(jí)種子培養(yǎng)基(培養(yǎng)基為:葡萄糖20-50g/L，硫酸銨10-30g/L，硫酸鎂5_10g/L,磷酸二氫鉀15-30g/L)，30°C，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)48h之后，將種子液轉(zhuǎn)入20L發(fā)酵罐(發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖30-50g/L，乳糖2.0-10g/L，玉米漿20-50g/L，硫酸銨10_30g/L，硫酸鎂5-10g/L，磷酸二氫鉀15-30g/L)，裝液量為12.5L，接種量為500mL，轉(zhuǎn)速300rpm，通風(fēng)量為
0.5m3/h，發(fā)酵溫度為30°C，pH值3.50。當(dāng)葡萄糖濃度低于5g/L，溶氧上升之后開始補(bǔ)加乳糖。發(fā)酵時(shí)間約為150h。發(fā)酵結(jié)束之后，通過板框過濾機(jī)過濾獲得澄清的濾液，即為(6-內(nèi)切葡聚糖酶液體產(chǎn)品。
[0042]分別對(duì)上述(6-內(nèi)切葡聚糖酶液體產(chǎn)品進(jìn)行酶活和蛋白含量測定，結(jié)果顯示，在20L發(fā)酵罐發(fā)酵條件下，野生型P -內(nèi)切葡聚糖酶體的發(fā)酵酶活為4730U/mL，而突變體的發(fā)酵酶活高達(dá)7120U/mL，比野生型酶活提高了 50.5%。
[0043]實(shí)施例6 P -內(nèi)切葡聚糖酶在木質(zhì)纖維素糖化中的應(yīng)用
[0044]本發(fā)明提供了一種木質(zhì)纖維素糖化的方法，其步驟包括:[0045]I)稱取一定量絕干的木糖渣(含木質(zhì)纖維素60-70%)，按照固液比為1:10 (m/v)添加pH為4.5~5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，混勻；
[0046]2)按照5-10mg蛋白/g底物(所述底物為上述絕干的木糖渣)的比例向步驟I)中添加本發(fā)明實(shí)施例5所述P-內(nèi)切葡聚糖酶液體產(chǎn)品；
[0047]3) 50°C~60°C下震蕩酶解24_48h后，取樣用生物傳感分析儀測定葡萄糖含量；
[0048]4)計(jì)算木質(zhì)纖維素的糖化率:糖化率)=酶解后得到的葡萄糖的含量(mg/g底物)+總的葡萄糖含量(mg/g底物)X 100%。
[0049]結(jié)果顯示:當(dāng)本發(fā)明實(shí)施例5所述野生型P -內(nèi)切葡聚糖酶添加量分別為5和9mg蛋白/g底物時(shí)，底物的葡萄糖產(chǎn)量分別為420和490mg/g底物，糖化率分別為62%和72% ；當(dāng)突變型P -內(nèi)切葡聚糖酶添加量分別為5和9mg蛋白/g底物時(shí)，底物的葡萄糖產(chǎn)量分別為560和645mg/g底物，糖化率高達(dá)82%和95%，比野生型的糖化率分別提高了 20%和23%。[0050]上述結(jié)果表明，本發(fā)明獲得的P -內(nèi)切葡聚糖酶突變體能顯著提高木質(zhì)纖維素的糖化率，且在高溫條件下酶解效果顯著優(yōu)于野生型，更適合纖維素轉(zhuǎn)糖工業(yè)生產(chǎn)條件，能大幅度降低用酶成本，從而降低生產(chǎn)成本。
【權(quán)利要求】
1.一種(6-內(nèi)切葡聚糖酶突變體，其特征在于，所述的(6-內(nèi)切葡聚糖酶突變體是氨基酸序列為SEQ ID NO:1的P -內(nèi)切葡聚糖酶的第56位氨基酸由Val變?yōu)镠e，第212位氨基酸由Asp變?yōu)锳sn。
2.如權(quán)利要求1所述的(6-內(nèi)切葡聚糖酶突變體，其特征在于，所述的(6-內(nèi)切葡聚糖酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO:3。
3.一種基因，其特征在于，所述的基因用于編碼權(quán)利要求1或2所述的(6-內(nèi)切葡聚糖酶突變體。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列為SEQID N0:4。
5.一種表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體攜帶有權(quán)利要求4所述的基因。
6.一種里氏木霉， 其特征在于，所述的里氏木霉攜帶有權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體。
【文檔編號(hào)】C12N15/56GK103642778SQ201310699638
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】崔巍, 董計(jì)巧, 肖志壯 申請(qǐng)人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司, 濰坊康地恩生物科技有限公司