一種兔骨髓間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種兔骨髓間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)方法，屬于干細胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。以MSCSFM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加細胞外基質(zhì)和細胞因子，將骨髓細胞懸液離心后，在上述培養(yǎng)基中，37℃情況下，以1x（乘號）104/cm2細胞密度進行恒溫接種培養(yǎng)。本發(fā)明采用無血清方式進行細胞培養(yǎng)，具有安全性、可靠性高等優(yōu)點。
【專利說明】一種兔骨髓間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種兔骨髓間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)方法，屬于干細胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，隨著干細胞的研究不斷深入，其在疾病治療應(yīng)用價值也被不斷發(fā)現(xiàn)和證實。骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一類來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層的成體干細胞，是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞。MSCs可來源于骨髓、脂肪、臍帶血、真皮、胎盤等組織；此外與其他干細胞相比，MSCs容易提取分離、增殖以及基因?qū)耄云湓诩毎浦仓委熀突蛑委熤杏泻艽蟮膬?yōu)勢。同時MSCs具有多向分化的潛能，能夠誘導(dǎo)分化為許多不同的組織，歸巢特性，以及免疫調(diào)節(jié)作用，對于組織修復(fù)和免疫疾病等的治療有很大的作用。已有不少文獻證實了 MSCs對肝臟疾病積極的治療作用。
[0003]然而，MSCs的細胞治療應(yīng)用依然存在一些問題:
(1)MSCs的血清培養(yǎng)存在潛在的安全風(fēng)險。血清成分不明確，其中可能含有動物攜帶的已知的或未知的病原體，在臨床應(yīng)用中具有潛在的危險；
(2)需更多動物實驗研究證實MSCs移植治療的有效性和安全性。雖有一些MSCs移植治療的臨床案例，但數(shù)量少，且缺少對照。
[0004](3)利用人MSCs作為研究對象，存在取材不便及安全倫理道德的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中血清培養(yǎng)所存在的安全性、有效性等方面的因素，本發(fā)明提供一種無血清方式的骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)方法。
[0006]一種兔骨髓間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)方法，以MSC SFM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加細胞外基質(zhì)和細胞因子，將骨髓細胞懸液離心后，在上述培養(yǎng)基中，37°C情況下，以1‘ IO4 /cm2細胞密度進行恒溫接種培養(yǎng)。
[0007]進一步的，作為優(yōu)選:
所述的細胞外基質(zhì)包括Cell start和Fibronectin,細胞因子為10Pg/L bFGF。
[0008]所述的MSC SFM 為 99%MSC SFM +l%Supplement+雙抗。
[0009]所述的細胞外基質(zhì)Cell start使用前先以1:1000的濃度稀釋于α -MEM,置37°C培養(yǎng)箱沉淀，實驗前吸去上清液，晾干備用。
[0010]其中，MSC SFM為商品化的試劑，公司:invitrogen，目錄號:A10675_01 ;產(chǎn)品全稱:StemPro? MSC SFM XenoFree。
[0011]Cell start:公司:invitrogen,目錄號:A10142 ;產(chǎn)品全稱:CELLstartTMCTS?substrate ο
[0012]bFGF:堿性成纖維生長因子。[0013]a -MEM: 一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0014]Fibronectin:纖維連接蛋白。
[0015]本發(fā)明以StemPro? MSC SFM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，這種無血清培養(yǎng)的細胞個體及集落形態(tài)與有血清培養(yǎng)的具有很大的相似性，但也存在差異，其原理、有益效果以及與有血清培養(yǎng)的差異主要如下:
1.有血清和無血清培養(yǎng)的MSCs單個細胞均呈典型的梭性，集落呈菊花狀或漩渦狀，與典型的MSCs細胞形態(tài)和集落特性相符合。血清培養(yǎng)的MSCs貼壁時細胞形態(tài)狹長，鋪展較開，在增殖過程中由于細胞數(shù)量及緊密度的增加使得個體細胞形態(tài)逐漸收縮變短小，集落中各細胞連接緊密；無血清培養(yǎng)的MSCs在貼壁時細胞形態(tài)短小，鋪展程度不高，而在增殖過程中逐漸鋪展開，隨著細胞數(shù)量的增加，細胞形態(tài)逐漸變得狹長，在集落中細胞與細胞間連接不緊密。這些差異性可能是由于培養(yǎng)基的不同造成的，但并不影響MSCs的基本生物學(xué)特性。
[0016]2.無血清培養(yǎng)培養(yǎng)體系保持了 MSCs的干性特征:具有典型的MSCs細胞和集落形態(tài)，表型特征，及具有脂肪，成骨，軟骨的分化潛能。采用脂肪、成骨、軟骨分化培養(yǎng)液對無血清體外擴增的MSCs進行分化培養(yǎng)，并取分化后細胞RNA進行各分化標(biāo)志基因(Ppar、RUNX2、S0X9)及干性標(biāo)志基因(⑶29、⑶44)的熒光定量分析，結(jié)果顯示，無血清體外培養(yǎng)的MSCs也具有向脂肪、成骨、軟骨分化的能力，在分化的過程中，各分化標(biāo)志基因的表達能力逐漸增強，干性標(biāo)志基因的表達能力逐漸減弱。
[0017]3.基于上述兩點，無血清培養(yǎng)方式解決了常規(guī)有血清培養(yǎng)所存在的安全性、有效性的問題，采用本發(fā)明無血清培養(yǎng)方式，取材更方便，也更符合人性化和倫理道德對細胞培養(yǎng)的要求。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為不同培養(yǎng)條件下骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)(100倍下，A-C:有血清培養(yǎng)，分別培養(yǎng)第1、6、12天；D-F:無血清培養(yǎng)，分別為培養(yǎng)第1、6、12天)；
圖2為不同組別細胞生長曲線圖；
圖3為不同組別細胞MTT增殖能力分析；
圖4為MSCs向脂肪細胞，成骨細胞及軟骨細胞分化(A-C:血清培養(yǎng)的MSCs體外分化，D-F:無血清培養(yǎng)的MSCs體外分化)；
圖5-1到5-5為有血清與無血清培養(yǎng)MSCs干性標(biāo)志物與分化標(biāo)志物檢測；
圖6為RT-PCR檢測無血清培養(yǎng)間充質(zhì)干性陰性標(biāo)志物。
【具體實施方式】
[0019]培養(yǎng)基
以bFGF為生長因子,Cell start/fibronectin為細胞外基質(zhì),分別建立了以下各培養(yǎng)體系:①無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+bFGF+Cellstart、②無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+Ce 11 start、③無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+bFGF+f ibronectin、④無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+f ibronectin、⑤無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+bFGF、⑥無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基。通過相互之間的比較，在添加生長因子bFGF的情況下，以Cell start作為細胞外基質(zhì)對于MSCs的體外無血清培養(yǎng)最為有利，此培養(yǎng)體系能保證細胞在短時間內(nèi)呈增長趨勢，較長時間內(nèi)維持細胞的體外存活數(shù)量。
[0020]材料與方法 2.1實驗動物
新西蘭白兔由紹興文理學(xué)院動物實驗基地提供，正常飼養(yǎng)管理，觀察一周正常后用于實驗；實驗動物實驗程序按本校實驗動物倫理規(guī)范(2013051201)執(zhí)行。
[0021]主要試劑和儀器
試劑:D-氨基半乳糖(D-gal，Hanghong,上海)，a-MEM (吉諾，杭州)，PBS (吉諾，杭州)，抗生素(吉諾，杭州)，胎牛血清(Hyclone,美國),StemPro? MSC SFM (Invitrogen,美國),Fibronectin (Invitrogen,美國),Cellstart (Invitrogen,美國)，脂肪細胞分化培養(yǎng)基(Invitrogen,美國),成骨細胞分化培養(yǎng)基(Invitrogen,美國),軟骨細胞分化培養(yǎng)基(Invitrogen,美國)，DMSO (Sigma,美國),細胞中性脂質(zhì)油紅O染色試劑盒(Genmed,美國)，細胞堿性磷酸酶活性染色試劑盒(Genmed,美國),動物細胞糖蛋白高碘酸希爾法阿爾新藍染色試劑盒(Genmed,美國)，Trizol Reagent (Invitrogen,美國),反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(艾德萊，北京)，PCR Mix (Invitrogen,美國)，PKH26GL 試劑盒(Sigma,美國)；MTT(Sigma,美國)。
[0022]主要儀器:熒光顯微鏡(Nikon，日本)，-80°C冰箱(三洋，日本)，ELX-800酶標(biāo)儀(Bio-rad,美國)，培養(yǎng)箱(三洋，日本)，以及其他常規(guī)儀器設(shè)備。
[0023]培養(yǎng)器皿:25cm2 (Corning,美國)，75 cm2 (Corning,美國)，4 孔板(NUNC，丹麥)6 孔板(Corning,美國)，12 孔板(Corning,美國),96 孔板(Corning,美國)。
[0024]方法
2.3.1 MSCs體外培養(yǎng)
2.3.1.1 MSCs體外有血清培養(yǎng)
觀察正常的新西蘭大白兔，耳緣靜脈空氣栓塞法處死，無菌分離出兩腿股骨，用碎骨鉗去除骨兩端骨骺，用注射器吸取適量PBS反復(fù)沖洗骨髓腔至含有肝素鈉的無菌離心管中，將得到的骨髓細胞懸液離心后，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基為:a -MEM+10%FBS+雙抗；之后每隔3日換一次培養(yǎng)液，待培養(yǎng)瓶中的原代MSCs生長至80%匯合后，用胰酶消化，加入含血清培養(yǎng)液終止胰酶作用，以1: 3進行傳代培養(yǎng)。
[0025]體外無血清培養(yǎng)
骨髓細胞懸液離心后，為比較優(yōu)化無血清培養(yǎng)體系，以MSC SFM作為無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基((99%MSC SFM +l%Supplement+雙抗)，組合添加細胞外基質(zhì)(Cell start和Fibronectin)和細胞因子(lOPg/L bFGF)，共設(shè)置了 7種培養(yǎng)條件，分別是:①無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+bFGF+Cellstart (SF_b_C)、②無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+Cell start (SF-C)、③無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+bFGF+fibronectin (SF_b_F)、④無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+fibronectin (SF-F)、⑤無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+bFGF (SF-b)、⑥無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基(SF)和⑦10%血清培養(yǎng)液(S)。放置37°C培養(yǎng)箱內(nèi)孵化備用。細胞外基質(zhì)實驗前Cell start和ECM在細胞培養(yǎng)前以1:1000的濃度稀釋于α -MEM,置37°C培養(yǎng)箱沉淀，實驗前吸去上清液，晾干備用。其中無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+bFGF+Cell start (SF_b_C)細胞增殖效果最佳，并用于后續(xù)實驗研究。
[0026]增殖潛能鑒定
1)細胞生長曲線實驗:按1.3.1.2上述的7種培養(yǎng)基，設(shè)置6個平行組，以f IO4 /cm2細胞密度在四孔板內(nèi)進行細胞接種培養(yǎng)。從第2天到第7天，每天取I組細胞，胰酶消化完全后用紅細胞計數(shù)板分別對不同培養(yǎng)組分的細胞數(shù)量進行計數(shù)，得到7種不同培養(yǎng)條件下的MSCs細胞數(shù)量增長曲線。
[0027]) MTT測定:按1.3.1.2的7種培養(yǎng)條件，在96孔板內(nèi)設(shè)置7組細胞，每組5個重復(fù)，2d后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2-3遍，每孔加入30mL MTT溶液(5mg.mL—1)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸凈培養(yǎng)液，每孔加入IOOmL DMS0，振蕩lOmin，在酶標(biāo)儀492nm波長下測得各孔的吸光度。
[0028]分化潛能鑒定
傳2-3代生長穩(wěn)定的MSCs，待其長至80%滿時，分別在脂肪、成骨、軟骨分化培養(yǎng)液體外誘導(dǎo)分化7-10天。之后參照Genmed公司的操作說明書，用細胞中性脂質(zhì)油紅O染色試劑盒、細胞堿性磷酸酶活性染色試劑盒、動物細胞糖蛋白高碘酸希爾法阿爾新藍染色試劑盒分別對分化的脂肪、成骨、軟骨細胞進行鑒定。
[0029]標(biāo)志物表達水平鑒定
2.3.4.1 RNA的提取與cDNA的合成
按Invitrogen Trizol說明書細胞提取RNA,然后按反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:5 m I RNA 中加入 I ml Random Primer p (dN) 6 (0.2mg.ι?1_1)>5 ml Rnase-free ddH20,70。C 溫浴 5min,冰浴 10s,離心后加入下列試劑:4 ml 5, Reaction Buffer、2 ml dNTPMix (IOmmol d I ml Rnase inhibitor (20U ?mF1)>2 ml AMV Reverse Transcriptase(IOU.ι?1_1)>20 ml Total volume,混勻后 37° C 溫浴 5min;42° C 溫浴 60min;70° C 溫浴IOmin終止反應(yīng)，-79° C保存?zhèn)溆谩?br> [0030]實時定量PCR檢測基因表達
采用SYBR? Green法分別檢測各樣本的基因表達情況。20μ1 PCR反應(yīng)體系:10 μ?SybrGreen qPCR Master MixU μ? 引物 F (IOuM)、1 μ? 引物 R (IOuM)、7 μ? ddH20、l μ?Template (cDNA)。反應(yīng)程序:95°C 2 min，95°C 10s，60°C 40s，以 0.5°C.s-1 的速度從65°C到95°C每隔5s記錄一次熒光值，最后獲得溶解曲線。完成上述步驟后，加樣到96孔板，置于ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀中進行反應(yīng)，采用相對定量法分別分析各組基因標(biāo)志物的表達水平,其計算公式為:基因標(biāo)志物相對表達量=2_(繼)’ 100%，其中ACt=Ct
檢測干性標(biāo)志物基因CD29，CD44，Ppar，Runx2與Sox9，以GAPDH為內(nèi)參基因，引物序列如表1。
[0031] 檢測基因表達
對陰性標(biāo)志物⑶34，⑶166采用RT-PCR檢測，以GAPDH為對照將按1.3.4.1反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進行Ρα?，20μ1 PCR反應(yīng)體系:10 μ? 2XPCR MixU μ?弓丨物F (IOuM)Uμ? 引物R (IOuM)、7 μ? ddH20、l μ? Template (cDNA)，預(yù)變性95°C 3 min，95°C 40s, 60°C40s, 72°C 408，30個循環(huán)，最終721: I min，取5 μ?擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測，所用引物如表1。
[0032] 表1熒光定量PCR與RT-PCR引物序列表
【權(quán)利要求】
1.一種兔骨髓間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)方法，以MSC SFM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加細胞外基質(zhì)和細胞因子，將骨髓細胞懸液離心后，在上述培養(yǎng)基中，37°C情況下，以1’IO4 /cm2細胞密度進行恒溫接種培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種兔骨髓間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的細胞外基質(zhì)包括Cell start和Fibronectin,細胞因子為10Pg/L bFGF。
3.如權(quán)利要求1所述的一種兔骨髓間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的 MSC SFM 為 99%MSC SFM +l%Supplement+雙抗。
4.如權(quán)利要求1-3任一項所述的一種兔骨髓間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的細胞外基質(zhì)Cell start使用前先以1:1000的濃度稀釋于α -ΜΕΜ，置37°C培養(yǎng)箱沉淀，實驗前吸去上清液，晾干備用。
5.一種兔骨髓間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于:該培養(yǎng)基以MSC SFM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加細胞外基質(zhì)和細胞因子。
6.如權(quán)利要求5所述的一種兔骨髓間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述的細胞外基質(zhì)包括Cell start和Fibronectin,細胞因子為10Pg/L bFGF。
7.如權(quán)利要求5所述的一種兔骨髓間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述的MSC SFM 為 99%MSC SFM +l%Supplement+雙抗。
【文檔編號】C12N5/0775GK103740640SQ201310701008
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】金立方, 倪堅 申請人:紹興文理學(xué)院