一種柑桔衰退病毒的表達載體構建方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種柑桔衰退病毒的表達載體構建方法。本發(fā)明設計了ZYC349/ZYC350，ZYC357/ZYC358，ZYC412/ZYC415，ZYC479/ZYC4804對特異性引物，這些引物可用于擴增含有外源綠色熒光蛋白基因，驅動其翻譯的柑桔衰退病毒p23基因啟動子，進而通過雙酶切將連接后的片段插入柑桔衰退病毒全長侵染性克隆35S-148中p23基因的末端，從而使得柑桔衰退病毒能夠作為表達載體在本生煙中穩(wěn)定、高效的表達綠色熒光蛋白基因達2個月以上。本發(fā)明為研究柑桔衰退病毒在植株中的分布、移動，以及將其作為生物反應器大量表達優(yōu)質蛋白提供了極其重要的技術平臺。
【專利說明】一種柑桔衰退病毒的表達載體構建方法及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種病毒的表達載體構建方法，尤其涉及一種柑桔衰退病毒的表達載體構建方法及試劑盒，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]中國的柑桔種植面積和產量均居世界第一。柑桔衰退病毒(Citrus tristezavirus，CTV)引起的柑桔衰退病是一種重要的世界性柑桔病害，通過蚜蟲和帶病苗木傳播。我國廣泛分布柑桔衰退病毒的多種強毒株和強力傳媒褐色桔蚜，隨著20世紀80年代末進行柑桔產業(yè)結構調整，柚類和甜橙的種植比例增加，柑桔衰退病對柚類和某些甜橙的為害加劇。
[0003]隨著分子生物學技術的發(fā)展，農桿菌表達載體和植物病毒載體是當前表達外源基因的兩種主要途徑載體。與農桿菌表達載體相比，植物病毒載體具有寄主范圍廣、表達效率高等優(yōu)點，且大多數植物病毒可通過機械接種進行傳播，適于大規(guī)模商業(yè)操作，除用于獲得大量、優(yōu)質的外源重組蛋白外，植物病毒載體也是反向遺傳學中研究基因功能，以及基因沉默現(xiàn)象等的重要工具。由于目前研究中主要使用的基于草本植物病毒的表達載體不能侵染果樹，且其穩(wěn)定性較差，容易丟失插入的外源基因，因此該類載體無法滿足果樹研究的需要。
[0004]綠色熒光蛋白(GFP)也越來越多的被作為基因表達的標記物用于科研的各個領域，其產物GFP對細胞無毒性，且檢測簡單，不用任何底物或者其他輔助物即可以在熒光顯微鏡下直接觀察到熒光，極大地方便了基因表達水平的檢測與定位等。

【發(fā)明內容】

[0005]針對我國現(xiàn)有基于果樹病毒的表達載體研究不足的問題，本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種柑桔衰退病毒的表達載體構建方法。
[0006]本發(fā)明所提供的柑桔衰退病毒的表達載體構建方法，包括以下步驟:
[0007]I)提取病株中柑桔衰退病毒的總RNA ；
[0008]2)以上述總RNA為模板，用引物ZYC357/ZYC358擴增啟動子，用引物ZYC412/ZYC415和ZYC479/ZYC480分別擴增柑桔衰退病毒基因組的片段I和片段2，所述的引物核苷酸序列分別為:
[0009]ZYC357:5’ -TACGCGATTTGGGTAAGTACCTATAGCAATTACAGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACT-3，
[0010]ZYC358:5’ -ACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATGGACGACGAA ACAAAGAAATTGAAGA-3’
[0011]ZYC412:5’ -GCCTCTTAGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCAGTG-3，
[0012]ZYC415:5’ -CGAGAAGTCCTACCACTTTATAGTTGGCCTTTA-3，
[0013]ZYC479:5’ -CAAAC CATGCGAGCTTACTTTAGTATG-3’[0014]ZYC480:5’ -ATTCCCGGGGGTGATTTTGGGTTTAGAC-3’
[0015]3)用含有綠色熒光蛋白的質粒和特異引物ZYC349/ZYC350擴增綠色熒光蛋白基因，引物ZYC349/ZYC350序列為:
[0016]ZYC349:5’ -AGTTCTTCTCCTTTGCTAGCCATCTGTAATTGCTATAGGTACTTACCCAAATCGCGTA-3’
[0017]ZYC350: 5，-AGAGCTAATGTGGGTAGTTGAGTCAGGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3，
[0018]4)將步驟2、3中獲得的啟動子、片段1、片段2和綠色熒光蛋白基因的擴增產物經切膠純化后，分別與載體進行鏈接、轉化，并對獲得的菌液進行質粒純化；
[0019]5)取步驟4中的純化后分別含啟動子和片段2的質粒混合,通過overloop PCR進行連接，正反向引物為ZYC479/ZYC358，從而得到35S-127，并進行濃縮；將純化后分別含片段I和綠色熒光蛋白基因的質粒進行混合，通過overloop PCR進行連接，正反向引物為ZYC349/415，從而得到35S-126 ;將濃縮后的35S-126和35S-127混合，再次通過overloopPCR進行連接，正反向引物為ZYC479/ZYC415，從而得到35S-128，并進行濃縮；
[0020]6)取步驟5中所述濃縮后的35S-128與柑桔衰退病毒全長侵染性克隆35S-148分別進行StuI/PacI雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳后，進行切膠回收，純化后的酶切產物混合并進行鏈接，鏈接產物經轉化、質粒純化后從而得到柑桔衰退病毒的表達載體35S-149。
[0021]所述步驟2中的啟動子為柑桔衰退病毒p23基因啟動子，所述片段I為柑桔衰退病毒基因組19025-19296nt的區(qū)域，片段2為柑桔衰退病毒基因組17261_19024nt的區(qū)域；所述擴增反應條件為:94°C 2min ；45°C 30min ；92°C Imin ；92°C 20sec，55°C 20sec,68°C 2min循環(huán)35次，最`后68°C延伸lOmin。
[0022]所述步驟3 中的擴增反應條件為:94°C 2min ；94°C 30sec, 58°C 45sec, 72°C Imin循環(huán)35次，最后72°C延伸lOmin。
[0023]所述步驟4中的克隆載體為PMD18-T，所述步驟4和6中的感受態(tài)細胞為JM109。
[0024]所述步驟5中啟動子和片段2連接反應條件為94°C2min ；94°C 30sec, 58°C 45sec,72°C 2min循環(huán)35次；最后72°C延伸IOmin ;所述步驟5中片段I與綠色熒光蛋白質粒連接反應條件為 94°C 2min ；94°C 30sec, 58°C 45sec, 72°C 2min 循環(huán) 35 次；最后 72°C延伸 IOmin ；所述步驟 5 中 35S126 與 35S-127 的連接反應條件為 94°C 2min ；94°C 30sec，58°C 45sec,72°C 4min循環(huán)35次；最后72°C延伸IOmin。
[0025]所述步驟6中的柑桔衰退病毒全長侵染性克隆35S-148的獲得，包括以下步驟:
[0026]I)提取柑桔病株中柑桔衰退病毒分離株FS-577的總RNA ；
[0027]2)以所述總RNA為模板，用隨機引物反轉錄合成第一鏈cDNA ；
[0028]3)用柑桔衰退病毒分離株FS-577的全序列設計的6對特異性引物，分段擴增所述步驟2中第一鏈cDNA的6個片段:cDNA片段I~6，所述的特異性引物的核苷酸序列分別為:
[0029]弓丨物I上游引物序列ZYC214:
[0030]5， -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3，；
[0031]弓丨物I下游引物序列ZYC1293:
[0032]5， -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3，；[0033]引物2上游引物序列ZYC749:
[0034]5’ -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3’ ；
[0035]弓丨物2下游引 物序列ZYC1894:
[0036]5， -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3，；
[0037]弓丨物3上游引物序列ZYC253:
[0038]5’ -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3’ ；
[0039]弓丨物3下游引物序列ZYC1436:
[0040]5， -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3，；
[0041]引物4 上游引物序列 ZYC126:5’ -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3’ ；
[0042]弓丨物4下游引物序列ZYC1493:
[0043]5， -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3，；
[0044]弓丨物5上游引物序列ZYC431:
[0045]5’ -GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3’ ；
[0046]弓丨物5下游引物序列ZYC1478:
[0047]5， -GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3，；
[0048]弓丨物6上游引物序列ZYC2158:
[0049]5’ -CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3’ ；
[0050]引物6 下游引物序列 ZYCl 14:5’ -CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3’ ；
[0051]4)將步驟3中擴增得到的cDNA片段I與雙元載體pUC119_ Λ 9分別進行PmeI/PstI雙酶切，雙酶切產物經切膠純化后混合進行鏈接，鏈接產物經轉化、質粒純化后得到35S-143 ;將35S-143與cDNA片段2分別進行Pstl/Swal雙酶切，雙酶切產物經切膠純化后混合進行鏈接，鏈接產物經轉化、質粒純化后，得到35S-144 ;將35S-144與cDNA片段3分別進行Xmal/Pmel雙酶切，雙酶切產物經切膠純化后混合進行鏈接，鏈接產物經轉化、質粒純化后得到35S-145 ;將35S-145與cDNA片段4分別進行XmaI/Bsu36I雙酶切，雙酶切產物經切膠純化后混合進行鏈接，鏈接產物經轉化、質粒純化后得到35S-146 ;將35S-146與cDNA片段5分別進行Rsr II/Bsu36I雙酶切，雙酶切產物經切膠純化后混合進行鏈接，鏈接產物經轉化、質粒純化后，得到35S-147 ;將35S-147與cDNA片段6分別進行Rsr II/AscI雙酶切，雙酶切產物經切膠純化后混合進行鏈接，鏈接產物經轉化、質粒純化后，得到柑桔衰退病毒全長侵染性克隆35S-148。
[0052]本發(fā)明還提供了一種柑桔衰退病毒的表達載體構建試劑盒，包括:
[0053]I)柑桔衰退病毒的表達載體構建的4對特異性引物:
[0054]ZYC357:5’ -TACGCGATTTGGGTAAGTACCTATAGCAATTACAGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACT-3，
[0055]ZYC358:5’ -ACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATGGACGACGAA ACAAAGAAATTGAAGA-3’
[0056]ZYC412:5’ -GCCTCTTAGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCAGTG-3’
[0057]ZYC415:5’ -CGAGAAGTCCTACCACTTTATAGTTGGCCTTTA-3’
[0058]ZYC349:5’ -AGTTCTTCTCCTTTGCTAGCCATCTGTAATTGCTATAGGTACTTACCCAAATCGCGTA-3’[0059]ZYC350:5’ -AGAGCTAATGTGGGTAGTTGAGTCAGGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3，
[0060]ZYC479:5’ -CAAAC CATGCGAGCTTACTTTAGTATG-3’
[0061 ] ZYC480: 5，-ATTCCCGGGGGTGATTTTGGGTTTAGAC-3，
[0062]所述的柑桔衰退病毒的表達載體構建試劑盒，還包括:2X —步法緩沖液:200mMρΗ8.8Tris-HCl，IOOmM(NH4)2S04，IOOmM KCl，20mM MgSO4,l%Triton X-100,IOmM dNTP,0.02M DTT，10 μ M正反向引物。
[0063]10XPCR 緩沖液:200mM pH8.8Tris-HCl, IOOmM(NH4)2S04, IOOmM KCl,20mM MgSO4,l%Triton?X-100, IOmM dNTP, 10 μ M 正反向引物。
[0064]雙酶切緩沖液:100XBSA，IOmMBis-Tris-Propane-HCl, IOmM MgCl2, ImMDTT。
[0065]鏈接緩沖液:0.5M Tris-HCl pH7.8,0.1M MgCl2, 50mM DTT,5mM ΑΤΡ,Ο.25mg/LBSA,2% ~3%PEG3500。
[0066]裂解液I:2mg/ml 溶菌酶，IM ρΗ8.0Tris HCl，0.5Μ EDTA0
[0067]裂解液I1:0.2Μ NaOH, 1%SDS。
[0068]有益效果:本發(fā)明公開了一種基于柑桔衰退病毒的表達載體構建方法，為提高柑桔衰退病毒表達載體對外源基因的表達量和穩(wěn)定性，發(fā)明人根據柑桔衰退病毒蛋白表達策略的特殊性，設計了 ZYC349/ZYC350，ZYC357/ZYC358，ZYC412/ZYC415 和 ZYC479/ZYC4804 對特異性引物，這些引物可用于擴增含有外源綠色熒光蛋白基因和驅動其翻譯的柑桔衰退病毒p23基因啟動子序列，以及柑桔衰退病毒基因組中19025-19296nt和17261_19024nt的區(qū)域，并通過overloop PCR`將這四個片段連接起來，進而通過雙酶切將連接后的片段插入到柑桔衰退病毒全長侵染性克隆35S-148基因組19024nt的位置，從而使得柑桔衰退病毒能夠作為表達載體在本生煙中穩(wěn)定、高效的表達綠色熒光蛋白基因達2個月以上。本發(fā)明為研究柑桔衰退病毒在植株中的分布、移動，以及將其作為生物反應器大量表達優(yōu)質蛋白提供了極其重要的技術平臺。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0069]圖1為本發(fā)明本生煙接種柑桔衰退病毒的表達載體后檢測結果圖；A:白光照射；B:紫外激發(fā)熒光
[0070]圖2為本發(fā)明本生煙接種柑桔衰退病毒的表達載體后提取的總蛋白溶液;A:白光照射:紫外激發(fā)熒光
【具體實施方式】
[0071]本發(fā)明中的DTT為Dithiothreitol的簡稱，中文名稱為二硫蘇糖醇(鼎國，中國)。Triton X-100中文名稱為聚乙二醇辛基苯基釀(鼎國，中國)。Bis-Tris-Propane為1，3- 二 [三(輕甲基)甲氨基]丙烷(Sigma，美國)，用HCl調節(jié)為ρΗ7.8，得到Bis-Tris-Propane-HCl。ATP 為 Adenosine Triphosphate 的簡稱，中文名稱為三憐酸腺苷(鼎國，中國)。EDTA為Ethylene Diamine Tetraacetic Acid的簡稱，中文名稱為乙二胺四乙酸(鼎國，中國)。SDS為Sodium lauryl sulfate的簡稱，中文名稱為十二烷基硫酸鈉(鼎國，中國)。BSA為bovine serum albumin,中文名稱為小牛血清白蛋白(Bio Basic Inc,加拿大)。溶菌酶為來源于雞蛋白的溶菌酶(Sigma，美國)。PEG3500為聚乙二醇(Sigma，美國)。
[0072]柑桔衰退病毒分離株FS-577的全序列公布在NCBI網站上，ID號為KC517488.1。
[0073]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明:
[0074]實施例一、柑桔衰退病毒分離株FS-577的鑒定、分離和保存
[0075](I)柑桔衰退病毒的鑒定、分離
[0076]從田間植株的四個不同方向采集已經老熟且?guī)в腥~片的枝條。采用直接組織點免疫的方法進行檢測，具體操作如下:用剃須刀片橫切樣品的莖干或葉柄，隨即均勻地壓在硝酸纖維素膜上，并設置正負對照，室溫下干燥15min以上。將印跡膜置于含1%BSA的0.02M, pH7.2 的磷酸緩沖液(0.13M NaCl, 0.02M Na2HPO4.12H20,14mM KH2PO4, 20mM KCl,20mM NaN3)中封閉Ih后直接加入1000:1 (v/v)堿性磷酸酯酶(Ap)標記的CTV?；贵wIgG (BioRad，美國)中，在室溫下?lián)u動反應2h。倒去含Ap-1gG的緩沖液，加入磷酸吐溫緩沖液(0.13M NaCl, 0.02M Na2HPO4.12H20,14mM KH2PO4, 20mM KCl,20mM NaN3,0.5%吐溫-20)洗膜3次，每次在室溫下?lián)u動反應5min。倒出磷酸吐溫緩沖液，依次加入5ml堿性磷酸緩沖液(1M Tris-base, 0.15M NaCl, 0.34M MgCl2), 1.7 μ g 氣化硝基四氣唑藍(Promega,美國)和0.85 μ g5-溴-4-氯_3_ Π引哚基-磷酸鹽(Promega,美國),在室溫下避光搖動15min后，用蒸餾水沖洗硝酸纖維素膜終止反應。通過觀察待測樣品的葉柄或枝條在硝酸纖維素膜上的印記是否與正對照一樣在其韌皮部處出現(xiàn)了黑褐色環(huán)狀物的方式來判斷植株是否感染 了柑桔衰退病毒。如果在韌皮部出現(xiàn)了黑褐色環(huán)狀物，則說明感染了柑桔衰退病毒。
[0077]由于柑桔衰退病毒FS-577屬于T36基因型，因此使用Hilf M E等
[0078](Phytopathology, 2005)發(fā)表的針對T36基因型柑桔衰退病毒的外殼蛋白基因、5’非翻譯區(qū)、K17和POL的特異性引物對T36CP (正向引物:5’ -ATGGACGACGAAACAAAGAAATTG-’ 3，反向引物:5’ -TCAACGTGTGTTGAATTTCCCA-3’)，T36-5(正向引物:5’ -AATTTCACAAATTCAACCTG-3’，反向引物:5’ -CTTTGCCTGACGGAGGGACC-3’)，T36K17F (正向引物:5’ -GTTTTCTCGTTTGAAGCGGAAA-3’，反向引物:5’ -CAACACATCAAAAATAGCTAGT-3’)，T36P0L (正向引物:5’ -TGACGCTAACGACGATAACG-3’，反向引物:5’ -ACCCTCGGCTTGTTTTCTTATG-3’)進行鑒定。具體操作如下:使用RNAisoplus試劑盒(Takara，日本)提取感染了柑桔衰退病毒的植株葉片中的總RNA。I μ L總RNA在95°C下變性3min后置于冰上，并混入4μ L水，40 μ L2X反應緩沖液(200mM pH8.8Tris_HCl，IOOmM(NH4)2SO4, IOOmM KCl，20mM MgSO4, l%Triton X-100, IOmM dNTP，0.02M DTT，5mMMgCl2，10mM正反向引物)，lyL RT/Taq 酶(Invitrogen，美國)。反應條件為:42°C,20min,94°C, lmin, [94°C, 30sec,45°C, 30sec, 72°C,60sec]循環(huán) 35 次，72°C，5min。RT-PCR 產物經切膠純化后取I μ L純化產物，與I μ L平末端載體pSMPLE-19EcoR V/BAP (Takara,日本)，2 4 1^水，5“1^鏈接緩沖液(300通 pH7.8Tris-HCl, IOOmM MgCl2, IOOmM DTT，IOmM ATP),I μ L3U/ μ L T4DNA連接酶(Promega，美國)混合，16°C反應30min，加入50 μ L感受態(tài)細胞JM109 (Promega，美國)輕輕混勻，冰上放置30min。42°C水浴熱激90sec，冰浴2min。沿管壁輕輕加800 μ L室溫平衡后的LB液體培養(yǎng)基(l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)，37°C，150rpm復蘇培養(yǎng)lh。吸取50 μ L菌液涂布于含抗生素的LB培養(yǎng)基(0.1%氨芐青霉素，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)中。37 °C過夜培養(yǎng)。挑取單個白斑在Iml LB液體培養(yǎng)基(l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)中37°C，150rpm培養(yǎng)10h。按照質粒純化試劑盒(Takara，日本)純化質粒。純化方法參照試劑盒操作說明書，在此不做贅述。對分別插入到質粒中的4個PCR片段進行測序分析。如果上述4個PCR片段分別與NCBI數據庫中ID號為KC517488.1序列中的外殼蛋白基因、5’端區(qū)域、K17區(qū)域和POL區(qū)域的序列都完全匹配時，則可確認分離到了柑桔衰退病毒分離株FS-577。
[0079](2 )柑桔衰退病毒FS-577的保存:
[0080]將田間感染了 FS-577的植株枝條的皮和芽嫁接于錦橙實生苗。每株錦橙實生苗上腹接毒源植株枝條的一個芽和兩塊皮，并各設立3株作為正負對照，接種后保存在網室中。每半個月觀察一次，若發(fā)現(xiàn)有接芽或接皮死亡，需立即補接，至少每株有兩塊皮存活。每隔一個月施用一次復合肥。接種3個月后步驟I用“柑桔衰退病毒的鑒定、分離”中的直接組織點免疫方法檢測FS-577是否保存成功。
[0081]實施例二、一種柑桔衰退病毒全長侵染性克隆的構建方法，按照以下步驟操作:
[0082](I)總RNA提取:采用Trizol試劑盒(Invitrogen,美國)提取病株中柑桔衰退病毒分離株FS-577的總RNA。提取方法參照Trizol試劑盒操作說明書，在此不做贅述。
[0083](2)第一鏈cDNA的合成:將8 μ L提取的總RNA，與I μ L50ng/ μ L隨機引物(Promega公司，美國)，I μ LlOmM dNTP混合后65°C下反應5min,冰上放置lmin。隨后在此反應液中加入 10μ LlOX 反轉錄緩沖液(IOOmM pH9.0Tris-HCl, 500mM KCl, l%TritonX-100, IOmM MgC12，0.02M DTT)，4U RNaseOUT (Invitrogen，美國)，2U SuperScript IIIRT (Invitrogen，美國)。混勻后分別在25°C下反應lOmin，50°C下反應50min，85°C下反應5min。隨后在冰上至少放置lmin再加入I μ L2U/ μ L RnaseH (Invitrogen,美國),在37。。下反應20min終止反應。-20°C保存。
`[0084](3) cDNA片段的擴增:根據NCBI已公布的柑桔衰退病毒FS-577全序列(ID號KC517488.1)設計 6 對特異性引物 ZYC214/ZYC1293, ZYC749/ZYC1894, ZYC253/ZYC1436,ZYC126/ZYC1493, ZYC431/ZYC1478和ZYC2158/ZYC114，從而依次合成柑桔衰退病毒分離株FS-577 全序列上 PmeI 到 PstI (cDNA 片段 I), PstI 到 SwaI (cDNA 片段 2)，PmeI 到 XmaI(cDNA 片段 3)，XmaI 到 Bsu36I (cDNA 片段 4)，Rsr II 到 Bsu36I (cDNA 片段 5)和 Rsr II到AscI (cDNA片段6)的序列。200 μ L擴增體系中含有140 μ L10XPCR緩沖液(200mMpH8.8Tris-HCl,IOOmM(NH4)2S04,IOOmM KCl,20mM MgS04,l%TritoniX-100,IOmM dNTP),10 μ M正反向引物，2 μ L4U/μ L Vent DNA聚合酶(ΝΕΒ，美國)，50 μ L水和4 μ L第一鏈cDNA。其中 cDNA 片段 I 使用引物 ZYC214/ZYC1293，cDNA 片段 2 使用引物 ZYC749/ZYC1894，cDNA片段3使用引物ZYC253/ZYC1436，cDNA片段4使用引物ZYC126/ZYC1493，cDNA片段5使用引物 ZYC431/ZYC1478，cDNA 片段 6 使用引物 ZYC2158/ZYC114。反應條件為 94°C，2min，[94°C，30sec，58°C，45sec，72°C，4min]循環(huán) 35 次，最后在 72°C延伸 lOmin，終止反應。
[0085]所述的根據柑桔衰退病毒分離株FS-577全序列設計的6對特異引物序列如下:
[0086]弓丨物I上游引物序列ZYC214:
[0087]5， -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3，；
[0088]弓丨物I下游引物序列ZYC1293:
[0089]5， -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3，；
[0090]弓丨物2上游引物序列ZYC749:
[0091]5’ -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3’ ；[0092]弓丨物2下游引物序列ZYC1894:
[0093]5， -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3，；
[0094]弓丨物3上游引物序列ZYC253:
[0095]5’ -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3’ ；
[0096]弓丨物3下游引物序列ZYC1436:
[0097]5’ -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3’ ；
[0098]引物4 上游引物序列 ZYC126:5’ -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3’ ；
[0099]弓丨物4下游引物序列ZYC1493:
[0100]5， -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3，；
[0101]引物5上游引物序列ZYC431:
[0102]5’ -GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3’ ；
[0103]弓丨物5下游引物序列ZYC1478:
[0104]5， -GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3，；
[0105]弓丨物6上游引物序列ZYC2158:`[0106]5’ -CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3’ ；
[0107]引物6 下游引物序列 ZYCl 14:5’ -CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3’ ；
[0108](4) PCR 產物的濃縮:200 μ L cDNA 片段 I 的 PCR 產物加入 20 μ L3M pH5.2Na0Ac和200 μ L無水乙醇。充分混勻后置于-80°c中15分鐘。12000rpm離心lOmin，去除上清。加入700 μ L70%乙醇清洗、干燥后用87 μ L雙蒸水溶解待用。同樣的方法用于濃縮其余的cDNA 片段 2-6。
[0109](5)改造PUC119獲得雙元載體pUC119-A9:在華大基因公司(中國)合成2條雙鏈DNA片段:多克隆位點I (其為ASC1-RSrI1-BSu361-XmaI酶切位點的序列:5’ -AGGCGCGCCTGCWGGWCCG CCTNAGGCCCCCGGGGG-3’，及相應的互補鏈)和多克隆位點 2 (為Xmal-Pmel-Pst1-Swa1-SacI 酶切位點的序列:CCCCCCGGGGGGITTAAACCTGCACTGCAGTGCAITTAAATTCCGAGCTCGGA，W:A/T, N:A/C/G/T)以及相應的互補鏈，由此構成雙鏈的多克隆位點I和雙鏈的多克隆位點2。
[0110]將5 μ g多克隆位點I的雙鏈DNA與25 μ L pUC119(Promega，美國)分別進行AscI/XmaI雙酶切。酶切體系為限制性內切酶AscI (NEB，美國)和XmaI (NEB，美國)各10U，10 μ L雙酶切緩沖液(100 X BSA，IOmMBis-Tris-Propane-HCl, IOmM MgCl2, ImM DTT)，其余用水將總體積定為100 μ L0 37°C下反應過夜。多克隆位點I和PUC119經Ascl/Xmal雙酶切后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，用20 μ L水溶解切膠回收、純化后的雙酶切產物，并取15.5 μ L混入
3.5μ L鏈接緩沖液(300mM pH7.8Tris-HCl, IOOmM MgCl2, IOOmM DTT，IOmM ΑΤΡ)，I μ L3U/μ L T4DNA連接酶(Promega，美國)。16°C下反應過夜。鏈接液中加入50 μ L感受態(tài)細胞JM109 (Promega，美國)，冰上放置30min，42°C水浴熱激90sec后，冰浴2min，加入400 μ LLB液體培養(yǎng)基(l%NaCl,0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)，37°C，150rpm復蘇培養(yǎng)Ih，菌液涂布于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基(0.1%卡那霉素，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨，1.5%瓊脂粉)中，37°C培養(yǎng)過夜。挑取陽性克隆置于40ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)基(0.1%卡那霉素，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)中，37°C，220rpm，過夜培養(yǎng)。
[0111]提取上述菌液中的質粒并進行純化:將上述培養(yǎng)過夜的菌液4°C，4000rpm離心15min，用 3ml 裂解液 I (2mg/ml 溶菌酶，IM pH8.0Tris HCl，0.5M EDTA)溶解沉淀，并依次加入 6ml 裂解液 II (0.2M NaOH，1%SDS)，和 3.75ml3M pH5.8NaOAc。12000rpm 離心 15min后在上清中加入20 ii LlOOmg/ml RnaseA。37°C處理30min。取上清，并加入等體積95%冰乙醇，-20°C過夜。4°C 1000Orpm離心lOmin。70%乙醇清洗沉淀。沉淀干燥后用300 y L水溶解，從而得到pUC119- A 7。通過測序進行驗證。
[0112]5u g多克隆位點2的DNA與25 ii LpUCl 19-A 7分別進行Xmal/SacI雙酶切。雙酶切時，除限制內切酶為XmaI (NE B，美國)和SacI (NEB，美國)各IOU外，其余酶切體系與多克隆位點I和PUC119雙酶切時相同。此外，后續(xù)的切膠純化、鏈接、轉化反應和質粒的純化方法都與獲得PUC119- A 7時的方法一致。由此得到改造后的載體pUC119- A 9，通過測序進行驗證。
[0113](6)35S-143的獲得:將25iiL pUC119_ A 9載體與濃縮后的87 y L cDNA片段I分別進行Pmel/PstI雙酶切。雙酶切時，除限制性內切酶為PmeI (NEB，美國)和PstI (NEB，美國)各IOU外，其余酶切條件與步驟5中的雙酶切條件一致。后續(xù)的切膠純化、鏈接、轉化反應和質粒純化方法也與步驟5中的方法相同。從而將cDNA片段I插入到pUC119-A9中，由此得到35S-143。
[0114](7) 35S-144的獲得:取20 u L35S-143與濃縮后87 y L的cDNA片段2分別進行Pstl/Swal雙酶切。雙酶切時，除限制性內切酶為PstI (NEB，美國)和SwaI (NEB，美國)各IOU外，雙酶切體系與步驟5中的相同。此外，后續(xù)的切膠純化、鏈接、轉化反應和質粒純化方法也與步驟5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段I和2的35S-144。
[0115](8) 35S-145的獲得:取20 u L35S-144與濃縮后87 y L的cDNA片段3分別進行Xmal/Pmel雙酶切。雙酶切時，除限制性內切酶為XmaI (NEB，美國)和PmeI (NEB，美國)各IOU外，雙酶切體系與步驟5中的相同。此外，后續(xù)的切膠純化、鏈接、轉化反應和質粒純化方法也與步驟5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段1-3的35S-145。
[0116](9) 35S-146的獲得:取20 u L35S-145與濃縮后87 y L的cDNA片段4分別進行XmaI/Bsu36I雙酶切。雙酶切時，除限制性內切酶為XmaI (NEB，美國)和Bsu36I (NEB，美國)各IOU外，雙酶切體系與步驟5中的相同。此外，后續(xù)的切膠純化、鏈接、轉化反應和質粒純化方法也與步驟5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段1-4的35S-146。
[0117](10) 35S-147的獲得-M 20UL35S-146與濃縮后87 y L的cDNA片段5分別進行RsrII/Bsu36I雙酶切。雙酶切時，除限制性內切酶為RsrII/Bsu36I各IOU外，雙酶切體系與步驟5中的相同。此外，后續(xù)的切膠純化、鏈接、轉化反應和質粒純化方法也與步驟5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段1-5的35S-147。
[0118](11) 35S-148的獲得:取20UL35S-147與濃縮后87 y L的cDNA片段6分別進行RsrII/AscI雙酶切。雙酶切時，除限制性內切酶為Rsr II (NEB，美國)和AscI (NEB，美國)各IOU外，雙酶切體系與步驟5中的相同。此外，后續(xù)的切膠純化、鏈接、轉化反應和質粒純化方法也與步驟5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段1-6的35S-148，即柑桔衰退病毒全長克隆35S-148。
[0119]將獲得的全長侵染性克隆35S-148測序，到NCBI網站與野生型FS-577序列(ID號KC517488.1)進行Blast比對，序列完全一致。
[0120]實施例三、一種柑桔衰退病毒表達載體構建方法，按照以下步驟操作:[0121](I)柑桔衰退病毒的鑒定、獲得。
[0122]按照實施例1中的直接組織點免疫方法在田間篩選出感染了柑桔衰退病毒的植株。
[0123](2)總RNA提取。采用Trizol試劑盒(Invitrogen,美國)提取直接組織點免疫法確定感染了柑桔衰退病毒病株的總RNA。提取方法參照Trizol試劑盒操作說明書，在此不做贅述。
[0124](3)啟動子、片段I和片段2的擴增。將8iiL提取的總RNA在95°C下解鏈2min后，與 190iiL2X —步法緩沖液(200mM pH8.8Tris-HCl, IOOmM (NH4) 2S04, IOOmM KCl,20mMMgSO4, l%Triton X-100，IOmM dNTP，0.02MDTT), IOuM 正反向引物(引物 ZYC357/ZYC358 用于擴增p23基因的啟動子，引物ZYC412/ZYC415和ZYC479/ZYC480分別用于擴增柑桔衰退病毒基因組19025-19296nt,以及17261_19024nt區(qū)域的片段I和片段2,2u L2.5U/ u LRT/Taq 混合酶混合。反應條件為 94°C，2min, 45°C，30min ；92°C，Imin ； [92°C，20sec ；55°C,20sec ；68°C,2min]循環(huán) 35 次，最后 68°C，lOmin。所述引物 ZYC357 序列為:5，_TACGCGATTTGGGTAAGTACCTATAGCAATTACAGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACT-3，；
[0125]ZYC358 序列為:
[0126]5， -ACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATGGACGACGAA ACAAAGAAATTGAAG A_3，；
[0127]ZYC412 序列為:
[0128]5’ -GCCTCTTAGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCC
[0129]CAGTG-3，；
[0130]ZYC415 序列為:5’ -CGAGAAGTCCTACCACTTTATAGITGGCCTTTA-3’ ；ZYC479 序列為:5’ -CAAAC CATGCGAGCTTACTTTAGTATG-3’ ；
[0131]ZYC480 序列為:5 ’ -ATTCCCGGGGGTGATTTTGGGTTTAGAC-3 ’。
[0132](4)綠色熒光蛋白基因的擴增。200111擴增體系中含有14011110\?0?緩沖液(200mM pH8.8Tris-HCl, IOOmM(NH4)2S04, IOOmM KCl,20mM MgS04, l%Triton X-100, IOmMdNTP), IOuM 正反向引物 ZYC349/ZYC350,1 u L2U/ u LPrimeStar HS DNA 聚合酶(Takara，日本)，51iiL水和8iiL含有綠色熒光蛋白基因的質粒pCMV-GFP (Addgene，美國)。反應條件為 94°C，2min，[94°C, 30sec, 58°C, 45sec, 72°C, lmin]循環(huán) 35 次，最后 72°C，lOmin。所述引物 ZYC349 序列為:5’ -AGTTCTTCTCCTTTGCTAGCCATCTGTAATTGCTATAGGTACTTACCCAAATCGCGTA-3，；
[0133]ZYC350 序列為:
[0134]5’ -AGAGCTAATGTGGGTAGTTGAGTCAGGATGGCTAGCAAAGGA
[0135]GAAGAACTTTTCA-3，。
[0136](5)啟動子、片段I和綠色熒光蛋白基因的克隆、純化。將步驟3、4中獲得的p23基因的啟動子、片段I和綠色熒光蛋白基因的擴增產物分別經切膠純化后，各取2 y L純化產物與I U L平末端載體pSIMPLE-19EcoR V/BAPCTakara,日本)，3.5 y L水，5 y L鏈接反應液(0.5M Tris-HCl pH7.8,0.1M MgCl2,50mMDTT, 5mM ATP,0.25mg/L BSA，2%~3%PEG3500)，I u L3U/ u L T4DNA連接酶(Promega，美國)混合。16°C過夜。將連接液與50 y L感受態(tài)細胞JM109 (Promega，美國)輕輕混勻，冰上放置30min。42°C水浴熱激90sec，冰浴2min。沿管壁輕輕加800 u L室溫平衡后的LB液體培養(yǎng)基(l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)，37°C，150rpm復蘇培養(yǎng)lh。吸取50uL菌液涂布于含抗生素的LB培養(yǎng)基(0.1%氨芐青霉素，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨沖。37 °C過夜培養(yǎng)。挑取單個白斑在1ml LB液體培養(yǎng)基(l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)中37°C，150rpm培養(yǎng)10h。按說明書，使用微量質粒純化試劑盒(Takara,日本)純化質粒。
[0137](6)啟動子與片段2的連接。在200u L反應體系中含有:步驟5中純化后分別含啟動子和片段2的質粒各4 u L，140 u LlO X PCR緩沖液(200mM pH8.8Tris_HCl，1OOmM(MM)2SO4，1OOmM KCl,20mM MgSO4, l%Triton?X-100, IOmM dNTP)，10uM 正反向引物ZYC479/ZYC358,1.5 u L2U/ u L Vent DNA 聚合酶(NEB，美國)和 50.5uL 水。反應條件為94°C，2min，[94°C，30sec，58°C，45sec，72°C，2min]循環(huán) 35 次，最后 72°C，lOmin。終止反應。從而將啟動子與片段2連接在一起，得到35S-127。
[0138](7) 35S-127 的濃縮。200u L35S-127 的 PCR 產物加入 20 uL3M pH5.2Na0Ac 和200uL無水乙醇。充分混勻后置于_80°C中15分鐘。12000rpm離心lOmin，去除上清。加A 700 u L70%乙醇清洗、干燥后用50uL雙蒸水溶解待用。
[0139](8)片段1與綠色熒光蛋白的連接與濃縮。按照步驟5的方法，在200 uL反應體系中含有:純化后分別含有片段I和綠色熒光蛋白質粒各4 uL，140 u HO X PCR緩沖液(200mMpH8.8Tris-HCl, 1OOmM(NH4)2SO4, lOOmM KCl,20mM MgSO4, l%Triton?X-100, 1OmM dNTP, 1Ou M正反向引物2￥0349/415)，1.51u2U/uL Vent DNA 聚合酶(NEB，美國)和 50.5u L 水。反應條件為 94°C，2min, [94°C，30sec, 58°C，45sec, 72°C，2min]循環(huán) 35 次，最后 72°C，1Omin0從而將35S-127與綠色熒光蛋白連接在一起，得到35S-126。按照步驟7的方法進行濃縮。
[0140](9) 35S-126與35S-127的連接和濃縮。在200uL反應體系中含有:步驟7、8中濃縮后的 35S-126 和 35S-127 各 L，140 u LlOXPCR 緩沖液(200mM pH8.8Tris_HCl，1OOmM(MM)2SO4，1OOmM KCl,20mM MgSO4, l%Triton X-100, IOmM dNTP)，10u M 正反向引物ZYC479/ZYC415,1.5 u L2U/ u L Vent DNA 聚合酶(NEB，美國)和 50.5u L 水。反應條件為94°C 2min ； [94°C 30sec，58°C 45sec，72°C 4min]循環(huán) 35 次；最后 72°C延伸 lOmin，從而得到35S-128。按照步驟7的方法進行濃縮。
[0141](10)柑桔衰退病毒表達載體的構建。將50iiL濃縮后的35S-128與2iig柑桔衰退病毒全長侵染性克隆35S-148分別進行StuI/PacI雙酶切。雙酶切反應液為，1OU/u L限制性內切酶StuI (NEB，美國)和PacI (NEB，美國)各1 uL，10 uL雙酶切緩沖液(100XBSA，1OmM Bis-Tris-Propane-HCl, 1OmM MgCl2, ImMDIT)，用水補足到 100u L。37°C下反應過夜。酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收、純化后用20yL水進行溶解。溶解后混入
3.L鏈接緩沖液(0.5M Tris-HCl pH7.8,0.1M MgCl2, 50mM DTT,5mM ATP，0.25mg/L BSA,2% ~3%PEG3500)和 luL3U/uL T4DNA 連接酶(Promega，美國)。15°C下反應過夜。鏈接液中加入50 u L感受態(tài)細胞JM109 (Promega，美國)，冰上放置30min，42°C水浴熱激90sec后，冰浴2min，加入400 uL LB液體培養(yǎng)基(l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)，37°C，150rpm復蘇培養(yǎng)lh，菌液涂布于含抗生素的LB培養(yǎng)基(0.1%卡那霉素，l%NaCl,0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨，1.5%瓊脂粉)中，37°C培養(yǎng)過夜。挑取陽性克隆置于40ml含抗生素的LB培養(yǎng)基(0.1%卡那霉素，l%NaCl,0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)中，37°C，220rpm,培養(yǎng)2d。
[0142](11)表達載體的純化。步驟9中的菌液在4°C,4000rpm離心15min,用3ml裂解液I (2mg/ml溶菌酶，IM pH8.0Tris HC1,0.5M EDTA)溶解沉淀，并依次加入6ml裂解液II (0.2M NaOH，1%SDS)和 3.75ml3M pH5.2NaOAc。12000rpm 離心 15min 后在上清中加入20 u L100mg/ml RnaseA。37°C處理30min。取上清，并加入等體積95%冰乙醇，_20°C過夜。40C 1000Orpm離心lOmin。70%乙醇清洗沉淀。沉淀干燥后用300 y L水溶解，從而得到基于柑桔衰退病毒的表達載體35S-149。
[0143]實施例四、基于柑桔衰退病毒的表達載體35S-149的應用實例。具體操作如下:
[0144]分別將35S-149，沉默抑制子pl9和p24各2 y g加入到50 y L農桿菌EHA105感受態(tài)細胞中，37°C熱激5min，冰上放置5min后加入Iml LB培養(yǎng)基(l%NaCl，0.5%酵母提取物，1% 胰蛋白胨)，28°C，220rpm 搖動生長 4h。菌液 4000rpm 離心 5min，用 100 u L LB(l%NaCl,
0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)溶解沉淀，并涂布于含抗生素的LB培養(yǎng)基(0.1%卡那霉素，
0.1%利福平，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨，1.5%瓊脂粉)，28°C生長2天。挑單斑在5ml LB培養(yǎng)基(0.1%卡那霉素，0.1%利福平，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)中28 0C，220rpm搖動生長1-2天。取50 yl菌液接種到IOml LB (l%NaCl，0.5%酵母提取物，1% 胰蛋白胨，IOmM pH5.85MES，20 u M 乙酰丁香酮，50 u g/ml
[0145]卡拉霉素,50 ii g/ml利福平)28°C, 220rpm搖菌過夜。菌液室溫下5000rpm離心15min。用 15ml 接種緩沖液(IOmM pH5.85MES，IOmMMgCl2,150 y M 乙酰丁香酮)溶解沉淀。最后將獲得的分別含有35S-149和沉默抑制子pl9、p24的菌液按等比例混合后注射接種于I月齡的本生煙(25°C，16h光照，8h黑暗)。如圖1所示，接種I個半月后在植株上可以觀察到強烈的綠色熒光信號，并持續(xù)表達綠色熒光蛋白基因達2個月以上。由此表明本發(fā)明中構建的基 于相結裳退病毒的表達載體可穩(wěn)定、聞效的表達插入的外源基因。
【權利要求】
1.一種柑桔衰退病毒的表達載體構建方法，包括以下步驟: 1)提取病株中柑桔衰退病毒的總RNA； 2)以上述總RNA為模板，用引物ZYC357/ZYC358擴增啟動子，用引物ZYC412/ZYC415和ZYC479/ZYC480分別擴增柑桔衰退病毒基因組的片段I和片段2，所述的引物核苷酸序列分別為:
ZYC357:5’ -TACGCGATTTGGGTAAGTACCTATAGCAATTACAGATGGCTAGCA AAGGAGAAGAACT-3，
ZYC358:5’ -ACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATGGACGACGAA ACAAAGAAATTGAAG A-3’
ZYC412:5’ -GCCTCTTAGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCAGTG-3，
ZYC415:5’ -CGAGAAGTCCTACCACTTTATAGTTGGCCTTTA-3，
ZYC479:5’ -CAAAC CATGCGAGCTTACTTTAGTATG-3’
ZYC480:5’ -ATTCCCGGGGGTGATTTTGGGTTTAGAC-3’ 3)用含有綠色熒光蛋白的質粒和特異引物ZYC349/ZYC350擴增綠色熒光蛋白基因，弓丨物 ZYC349/ZYC350 序列為:
ZYC349:5’ -AGTTCTTCTCCTTTGCTAGCCATCTGTAATTGCTATAGGTACTTACCCAAATCGCGTA-3，
ZYC350:5’ -AGAGCTAATGTGGGTAGTTGAGTCAGGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3， 4)將步驟2、3中獲得的啟動子、片段1、片段2和綠色熒光蛋白基因的擴增產物經切膠純化后，分別與載體進行鏈接、轉化，并對獲得的菌液進行質粒純化； 5)取步驟4中的純化后分別含啟動子和片段2的質?；旌?，通過overloopPCR進行連接，正反向引物為ZYC479/ZYC358，從而得到35S-127，并進行濃縮；將純化后分別含片段I和綠色熒光蛋白基因的質粒進行混合，通過overloop PCR進行連接，正反向引物為ZYC349/415，從而得到35S-126 ;將濃縮后的35S-126和35S-127混合，再次通過overloopPCR進行連接，正反向引物為ZYC479/ZYC415，從而得到35S-128，并進行濃縮； 6)取步驟5中所述濃縮后的35S-128與柑桔衰退病毒全長侵染性克隆35S-148分別進行StuI/PacI雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳后，進行切膠回收，純化后的酶切產物混合并進行鏈接，鏈接產物經轉化、質粒純化后從而得到柑桔衰退病毒的表達載體35S-149。
2.根據權利要求1所述的一種柑桔衰退病毒的表達載體構建方法，其特征在于:所述步驟6中的柑桔衰退病毒全長侵染性克隆35S-148的獲得，包括以下步驟: O提取柑桔病株中柑桔裳退病毒分尚株FS-577的總RNA ； 2)以所述總RNA為模板，用隨機引物反轉錄合成第一鏈cDNA； 3)用柑桔衰退病毒分離株FS-577的全序列設計的6對特異性引物，分段擴增所述步驟2中第一鏈cDNA的6個片段:cDNA片段I~6,所述的特異性引物的核苷酸序列分別為: 引物I上游引物序列ZYC214:
5’ -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3’ ； 引物I下游引物序列ZYC1293:
5’ -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3’ ； 引物2上游引物序列ZYC749:
5’ -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3’ ； 引物2下游引物序列ZYC1894:
5’ -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3’ ；引物3上游引物序列ZYC253:
.5’ -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3’ ； 引物3下游引物序列ZYC1436:
.5’ -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3’ ； 引物 4 上游引物序列 ZYC126:5’ -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3’ ； 引物4下游引物序列ZYC1493:
.5’ -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3’ ； 引物5上游引物序列ZYC431:
.5’ -GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3’ ； 引物5下游引物序列ZYC1478: . 5， -GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3，； 引物6上游引物序列ZYC2158:
.5’ _CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3’ ； 引物 6 下游引物序列 ZYCl 14:5’ -CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3’ ； .4)將步驟3中擴增得到的cDNA片段I與雙元載體pUCl 19-Λ 9分別進行Pmel/PstI雙酶切，雙酶切產物經切膠純化后混合進行鏈接，鏈接產物經轉化、質粒純化后得到35S-143 ；將35S-143與cDNA片段2分別進行Pstl/Swal雙酶切，雙酶切產物經切膠純化后混合進行鏈接，鏈接產物經轉化、質粒純化后，得到35S-144 ;將35S-144與cDNA片段3分別進行Xmal/Pmel雙酶切，雙酶切產物經切膠純化后混合進行鏈接，鏈接產物經轉化、質粒純化后得到35S-145 ;將35S-145與cDNA片段4分別進行XmaI/Bsu36I雙酶切，雙酶切產物經切膠純化后混合進行鏈接，鏈接產物經轉化、質粒純化后得到35S-146 ;將35S-146與cDNA片段5分別進行Rsr II/Bsu36I雙酶切，雙酶切產物經切膠純化后混合進行鏈接，鏈接產物經轉化、質粒純化后，得到35S-147 ;將35S-147與cDNA片段6分別進行Rsr II/AscI雙酶切，雙酶切產物經切膠純化后混合進行鏈接，鏈接產物經轉化、質粒純化后，得到柑桔衰退病毒全長侵染性克隆35S-148。
3.根據權利要求1所述的一種柑桔衰退病毒的表達載體構建方法，其特征在于:所述步驟2中的啟動子為柑桔衰退病毒p23基因啟動子，所述片段I為柑桔衰退病毒基因組19025-19296nt的區(qū)域，片段2為柑桔衰退病毒基因組17261_19024nt的區(qū)域；所述擴增反應條件為:94°C 2min ；45°C 30min ；92°C Imin ；92°C 20sec,55°C 20sec,68°C 2min 循環(huán) 35次，最后68°C延伸lOmin。
4.根據權利要求1所述的一種柑桔衰退病毒的表達載體構建方法，其特征在于:所述步驟3中的擴增反應條件為:94°C 2min ；94°C 30sec，58°C 45sec，72°C Imin循環(huán)35次，最后 72°C延伸 IOmin0
5.根據權利要求1所述的一種柑桔衰退病毒的表達載體構建方法，其特征在于:所述步驟4中的克隆載體為PMD18-T，所述步驟4和6中的感受態(tài)細胞為JM109。
6.根據權利要求1所述的一種柑桔衰退病毒的表達載體構建方法，其特征在于:所述步驟5中啟動子和片段2連接反應條件為94°C 2min ；94°C 30sec, 58°C 45sec, 72°C 2min循環(huán)35次；最后72°C延伸IOmin ;所述步驟5中片段I與綠色熒光蛋白質粒連接反應條件為940C 2min ；94°C 30sec, 58°C 45sec, 72°C 2min 循環(huán) 35 次；最后 72°C延伸 IOmin ;所述步驟 5中 35S126 與 35S-127 的連接反應條件為 94°C 2min ；94°C 30sec，58°C 45sec，72°C 4min 循環(huán)35次；最后72°C延伸lOmin。
7.一種柑桔衰退病毒的表達載體構建試劑盒，其特征在于:包括4對特異性引物: ZYC357:5’ -TACGCGATTTGGGTAAGTACCTATAGCAATTACAGATGGCTAGCA AAGGAGAAGAACT-3， ZYC358:5’ -ACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATGGACGACGAA ACAAAGAAATTGAAG A-3’ ZYC412:5’ -GCCTCTTAGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCAGTG-3’
ZYC415:5’ -CGAGAAGTCCTACCACTTTATAGTTGGCCTTTA-3’
ZYC349: 5，-AGTTCTTCTCCTTTGCTAGCCATCTGTAATTGCTATAGGTACTTACCCAAATCGCGTA-3，
ZYC350:5’ -AGAGCTAATGTGGGTAGTTGAGTCAGGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3，
ZYC479:5’ -CAAAC CATGCGAGCTTACTTTAGTATG-3’
ZYC480:5’ -ATTCCCGGGGGTGATTTTGGGTTTAGAC-3’。
8.根據權利要求7所述的一種柑桔衰退病毒的表達載體構建試劑盒，其特征在于:還包括以下溶液: 2X —步法緩沖液:200mM pH8.8Tris-HCl, IOOmM(NH4)2SO4, IOOmM KCl,20mM MgSO4,l%Triton X-100,IOmM dNTP，0.02M DTT ；
10XPCR 緩沖液:200mM pH8.8Tris-HCl, IOOmM(NH4)2S04, IOOmM KCl,20mM MgSO4,l%Triton X-100,IOmM dNTP ； 雙酶切緩沖液:100XBSA，IOmM Bis-Tris-Propane-HCl, IOmM MgCl2, ImMDTT ；
鏈接緩沖液:0.5M Tris-HCl pH7.8,0.1M MgCl2, 50mM DTT,5mM ΑΤΡ,Ο.25mg/L BSA,2% ~3%PEG3500 ；
裂解液 I:2mg/ml 溶菌酶，IM ρΗ8.0Tris HCl，0.5Μ EDTA ；
裂解液 II:0.2Μ NaOH，1%SDS。
【文檔編號】C12N15/82GK103642834SQ201310703042
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月19日 優(yōu)先權日:2013年12月19日
【發(fā)明者】周彥, 周常勇, 李中安 申請人:中國農業(yè)科學院柑桔研究所