一種產(chǎn)酶溶桿菌突變菌株及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供的一種產(chǎn)酶溶桿菌(Lysobacter?enzymogenes)的突變菌株TGJZC-041，并利用此菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，30±1℃靜置培養(yǎng)2-3天，再以5%-10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于30±1℃恒溫?fù)u床中以215-225rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)3天制備賴(lài)氨酸肽鏈內(nèi)切酶，其有益效果在于，本突變株產(chǎn)生的Lys-C表達(dá)量相對(duì)較高且發(fā)酵周期較短。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種產(chǎn)酶溶桿菌突變菌株及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于誘變育種領(lǐng)域，特別涉及產(chǎn)酶溶桿菌太空誘變育種方法，以及太空誘變育種得到的產(chǎn)酶溶桿菌突變菌株。
【背景技術(shù)】
[0002]賴(lài)氨酸肽鏈內(nèi)切酶Lys-C (Endoproteinase Lys-C)是一種堿性蛋白酶,分子量約為30kD，屬于絲氨酸蛋白酶家族成員之一。它能特異性地水解蛋白質(zhì)或肽鏈中賴(lài)氨酸殘基的C端，也可用于通過(guò)肽質(zhì)譜指紋印跡或MS/MS光譜匹配進(jìn)行蛋白鑒定，因此在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中有著很好的應(yīng)用前景。另外，Lys-C也可用于重組蛋白(如胰島素及其類(lèi)似物)工業(yè)生產(chǎn)中前體的切割，相比常用的胰蛋白酶，Lys-C具有幾個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn):1.專(zhuān)一性強(qiáng)，酶活高，顯著提高酶切轉(zhuǎn)化率(由10%提高到約77%) ；2.顯著提高酶切后的純度(由11%提高到約80%) ；3.具有廣泛的pH作用范圍(pH8.5-10.5) ；4.穩(wěn)定性高，在強(qiáng)變性劑如4mol/L尿素或0.1%SDS的溶液中依然保持大部分酶活性。
[0003]目前市場(chǎng)上的賴(lài)氨酸肽鏈內(nèi)切酶(Lys-C)大多為天然菌種表達(dá)產(chǎn)物，價(jià)格極為昂貴,如Promega的Lys-C市價(jià)為每微克約370元。重組表達(dá)生產(chǎn)賴(lài)氨酸肽鏈內(nèi)切酶(Lys-C)技術(shù)不成熟，商業(yè)化產(chǎn)品極少，Promega公司銷(xiāo)售的重組Lys-C,市價(jià)為每微克約130元,與天然Lys-C相比，價(jià)格有一定的優(yōu)勢(shì)，但仍較為昂貴。國(guó)內(nèi)尚未有賴(lài)氨酸肽鏈內(nèi)切酶的生產(chǎn)企業(yè)。
[0004]目前已知有三種微生物可以合成Lys-C:銅綠假單胞菌，無(wú)色桿菌，產(chǎn)酶溶桿菌。主要由產(chǎn)酶溶桿菌表達(dá)生產(chǎn)，其次為無(wú)色桿菌培養(yǎng)液中分離得到。產(chǎn)酶溶桿菌作為L(zhǎng)ys-C的主要產(chǎn)生菌，目前市場(chǎng)上該菌主要有原始菌，傳代菌，以及各種亞種，生產(chǎn)Lys-C效率均不高，且發(fā)酵周期較長(zhǎng)，這阻礙了 Lys-C的進(jìn)一步應(yīng)用。Chohnan S等在IOL罐上對(duì) Lysobacter sp.1B-9374 發(fā)酵 9.4 `天后得到 10.9mg/L 的 Lys-C0 Philip A 利用Lysobacter enzymogenes ATCC27796 發(fā)酵 4 天得到 5.6mg/L 的 Lys_C。GB2083477A 報(bào)導(dǎo)，菌株 Lysobacter enzymogenes DSM1895 (即 ATCC27796)在 206L 耀上發(fā)酵后得到 50_140mg的目的蛋白，即產(chǎn)量為0.24-0.68mg/L。
[0005]上述報(bào)導(dǎo)的技術(shù)方法均存在生產(chǎn)周期過(guò)長(zhǎng)或表達(dá)量較低的問(wèn)題，因此篩選一株穩(wěn)定高產(chǎn)、且發(fā)酵周期較短的Lys-C產(chǎn)生菌具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一株產(chǎn)酶溶桿菌突變菌株。
[0007]本發(fā)明提供的一種產(chǎn)酶溶桿菌(Lysobacter enzymogenes)的突變菌株TGJZC-041，保藏號(hào)為CGMCC N0.8328，于2013年10月12日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵政編碼為100101)。
[0008]本發(fā)明還提供一種產(chǎn)酶溶桿菌突變株的發(fā)酵方法。將突變株產(chǎn)酶溶桿菌(L.enzymogens) TGJZC-041接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，30± 1°C靜置培養(yǎng)2~3天，再以5%-10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 土 1°C恒溫?fù)u床中以215-225rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)3天；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:1% (W/ν)多聚蛋白胨，1% (W/V)蔗糖，0.01% (w/ν)磷酸氫二鉀，0.01% (W/V)磷酸二氫鉀，0.02% (W/V)硫酸鎂，余量為純化水，ρΗ7.2±0.I。
[0009]更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種產(chǎn)酶溶桿菌的突變株在制備賴(lài)氨酸肽鏈內(nèi)切酶中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案提供的一種產(chǎn)酶溶桿菌的突變菌株，其有益效果在于，本突變株產(chǎn)生的Lys-C表達(dá)量相對(duì)較高且發(fā)酵周期較短。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為不同氮源對(duì)Lys-C酶活的影響。代表Polypeton對(duì)Lys-C酶活的影響，代表Yeast extract對(duì)Lys-C酶活的影響，代表水解干酪素對(duì)Lys-C酶活的影響，-代表干酪素對(duì)Lys-C酶活的影響，代表Tryptone對(duì)Lys-C酶活的影響，代表干酪素+牛肉膏Lys-C酶活的影響。
[0012]圖2為不同碳源對(duì)Lys-C酶活的影響。+代表1%蔗糖對(duì)Lys-C酶活的影響，
代表2%蔗糖對(duì)Lys-C酶活的影響，--τ代表1%葡萄糖對(duì)Lys-C酶活的影響，ΦΗ代表2%葡萄糖對(duì)Lys-C酶活的影響，_fr代表1%乳糖對(duì)Lys-C酶活的影響，代表2%乳糖對(duì)Lys-C酶活的影響，—代表山梨醇對(duì)Lys-C酶活的影響，+代表果糖對(duì)Lys-C酶活的影響。
[0013]圖3為本發(fā)明產(chǎn) 酶溶桿菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)3天后的菌落形態(tài)。 [0014]圖4為純化后得到的Lys-C的SDS-PAGE圖；1:蛋白質(zhì)marker ；2:純化后樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下所述的是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明所保護(hù)的不限于以下優(yōu)選實(shí)施方式。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)在此發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的基礎(chǔ)上，做出的若干變形和改進(jìn)，都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016]實(shí)施例1培養(yǎng)基的優(yōu)化
[0017]培養(yǎng)基A:干酪素0.5%，蔗糖1%，牛肉浸膏1%，磷酸氫二鉀0.01%，磷酸二氫鉀
0.01%，硫酸鎂 0.02%，調(diào) pH 至 7.2±0.1。
[0018]以培養(yǎng)基A為初始培養(yǎng)基，進(jìn)行氮源和碳源的簡(jiǎn)單優(yōu)化。優(yōu)化過(guò)程如下:
[0019]氮源的考察:培養(yǎng)基A中其他組分不變，分別以1%的多聚蛋白胨、1%的Yeastextract、1%的Tryptone、l%的水解干酪素、1%的干酪素及0.5%干酪素+1%牛肉膏作為氮源進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。在第3、4、5和6天取樣進(jìn)行酶活測(cè)定。結(jié)果結(jié)果如圖1所示，確定以1%的多聚蛋白胨為最適氮源。
[0020]碳源考察:培養(yǎng)基A中其他組分不變，氮源為1%的多聚蛋白胨，考察分別以1%蔗糖、2%蔗糖、1%葡萄糖、2%葡萄糖、1%乳糖、2%乳糖、1%山梨醇及1%果糖為碳源進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。分別在發(fā)酵的第3、4、5和6天測(cè)定其酶活力。結(jié)果如圖2，確定以2%蔗糖為最適碳源。
[0021]其中所述酶活力定義:在反應(yīng)溫度30°C，每分鐘催化I μ mol的底物N-(p_T0Syl)-Gly-Pro-Lys-4-nitroaniIide acetate salt水解所需的酶量定義為I個(gè)酶活單位。[0022]酶活力測(cè)定方法:發(fā)酵結(jié)束后，取I μ M的Tris-HCL ΡΗ8.5的緩沖液180 μ L至96孔板,加入2mM底物10 μ L，再加入發(fā)酵液樣品10 μ L作為反應(yīng)體系，混勻并啟動(dòng)反應(yīng)。每一樣品設(shè)2次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。對(duì)照品與樣品的區(qū)別在于加入標(biāo)準(zhǔn)品代替發(fā)酵液樣品?？瞻讓?duì)照與樣品區(qū)別在于加入滅菌純化水代替發(fā)酵液樣品。用酶標(biāo)儀30°C恒溫測(cè)定405nm的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)曲線(xiàn)，反應(yīng)時(shí)間為30min。計(jì)算酶活情況。
[0023]實(shí)施例2初步篩選賴(lài)氨酸肽鏈內(nèi)切酶高產(chǎn)菌株
[0024]從ATCC購(gòu)買(mǎi)L.enzymogens,菌株號(hào)為ATCC27796,對(duì)該菌株復(fù)蘇后，進(jìn)行單菌落分離，取10-5，10-6，10-7等合適稀釋度涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板3個(gè)，30 土 TC靜置培養(yǎng)2-3天；再轉(zhuǎn)接于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，30土 1°C靜置培養(yǎng)2-3天；再以5%-10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，裝瓶量為16%，進(jìn)行高通量篩選，發(fā)酵培養(yǎng)5天，然后進(jìn)行酶活力測(cè)定。發(fā)酵培養(yǎng)基為:1% (W/V)多聚蛋白胨，1% (W/V)蔗糖，0.01% (W/V)磷酸氫二鉀，0.01% (ff/V)磷酸二氫鉀，0.02% (W/V)硫酸鎂，余量為純化水，pH7.2±0.1。將初篩菌株，以5%_10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(40mL培養(yǎng)基/250mL三角瓶)中發(fā)酵，于30 土 1°C恒溫?fù)u床中以215-225rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)5天，然后進(jìn)行酶活力測(cè)定。從732個(gè)單菌落中篩選到一株酶活較高的菌株L.enzymogens PGJZC30，將其作為太空誘變的出發(fā)菌株。
[0025]實(shí)施例3篩選賴(lài)氨酸肽鏈內(nèi)切酶突變高產(chǎn)菌株
[0026](I)將自然選育得到酶活力最高的菌株L.enzymogens PGJZC30接種于LB液體培養(yǎng)基，至于溫度為30±1°C且轉(zhuǎn)速為215-225rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)20h進(jìn)行復(fù)蘇；用牙簽一端沾濕培菌液后，穿刺于裝有220 μ L的LB半固體培養(yǎng)基的太空管中，設(shè)置對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組各I管，30土1°C靜置培養(yǎng)2-3天后，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別送至北京航天局，實(shí)驗(yàn)組于2013年6月搭載“神州十號(hào)”進(jìn)入太空，接受空間宇宙射線(xiàn)、微重力、交變磁場(chǎng)等各種太空因素的誘變，并于17天之后隨返回艙返回地面。期間，對(duì)照組一直在4°C放置。誘變結(jié)束后，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組菌液進(jìn)行梯度稀釋并涂布平板(單菌落數(shù)在50-300cfu)，培養(yǎng)2-3天后，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率。所述的致死率為(對(duì)照組活菌落數(shù)-搭載組活菌落數(shù))/對(duì)照組活菌落數(shù)。其中發(fā)酵培養(yǎng)基同實(shí)施例2中的發(fā)酵培養(yǎng)基；LB液體培養(yǎng)基:0.5%(ff/V)Yeast Extract, 1%(W/V)Tryptone, l%(W/V)Nacl,余量為純化水；LB 半固體培養(yǎng)基:LB 液體培養(yǎng)基含0.9%(ff/V)瓊脂。結(jié)果如下表3:
[0027]表3太空誘變菌株致死率考察
[0028]
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)酶溶桿菌(L.enzymogens)的突變株，所述突變株為T(mén)GJZC-041，已于2013年10月12日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號(hào)為CGMCCN0.8328。
2.如權(quán)利要求1所述的突變株在制備賴(lài)氨酸肽鏈內(nèi)切酶中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述TGJZC-041接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，30 土 I °〇靜置培養(yǎng)2~3天，再以5%-10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 ± I °C恒溫?fù)u床中以215-225rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)3天，最終經(jīng)純化獲得賴(lài)氨酸肽鏈內(nèi)切酶；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為，以W/V計(jì):1%多聚蛋白胨，1%蔗糖，0.01%磷酸氫二鉀，0.01%磷酸二氫鉀，0.02%硫酸鎂，余量為純化水，pH7.2±0.1 ;所述營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基為:胰蛋白胨1.5%(W/V)，大豆蛋白胨0.5% (W/V)，氯化鈉0.5% (W/V)，用蒸餾水配制而成，調(diào)節(jié)pH為7.2±0.I。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中的純化步驟為:上述發(fā)酵液經(jīng)離心后，獲得上清液；加入XAD1180至上清液中，并置于水浴振蕩器中振蕩3-4h，采用75%乙醇洗脫，收集洗脫樣品；把收集到的洗脫樣品調(diào)pH值至4.0-5.0,進(jìn)行S-Sepharose ff陽(yáng)離子層析,用0.2M氯化鈉+0.01M醋酸鈉(pH5.0)的洗脫液洗脫，收集洗脫樣品；用81(濾膜超濾陽(yáng)離子的收集液，最后凍干， 即可得到純度較高，具有酶活的賴(lài)氨酸肽鏈內(nèi)切酶凍干粉。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103865836SQ201310704805
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】劉長(zhǎng)庭, 常德, 方向群, 王俊峰, 蘇龍翔, 張學(xué)林, 嚴(yán)凌斌, 林樹(shù)珊, 李利佳 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院, 廣東東陽(yáng)光藥業(yè)有限公司