熒光重組病毒競爭實驗體系的建立的制作方法
【專利摘要】熒光重組病毒競爭實驗體系的建立，本發(fā)明屬基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。在該體系中，分別以表達(dá)綠色熒光蛋白（EGFP）和紅色熒光蛋白（DsRed2）的B亞型標(biāo)準(zhǔn)株NL4.3（△Env）為骨架，將源自兩種不同HIV-1病毒的env基因通過同源重組的方法，構(gòu)建熒光重組嵌合病毒。兩種攜有不同熒光蛋白的競爭病毒分別單獨感染及共感染靶細(xì)胞U87。不同的熒光蛋白作為區(qū)分兩種競爭病毒的標(biāo)簽，通過流式細(xì)胞技術(shù)分別計算帶有不同熒光的細(xì)胞個數(shù)，可以快速準(zhǔn)確地獲得不同病毒感染的細(xì)胞數(shù)量。經(jīng)過相應(yīng)計算可以得到兩種競爭病毒的相對適應(yīng)性。HIV-1復(fù)制適應(yīng)性可以通過一系列統(tǒng)計計算得到，其成為反應(yīng)HIV-1對特定宿主細(xì)胞環(huán)境適應(yīng)能力的量化指標(biāo)。
【專利說明】熒光重組病毒競爭實驗體系的建立
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS),由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)感染引起,是最嚴(yán)重的感染性疾病之一。艾滋病傳播的途徑有三種:血液傳播、性傳播和母嬰傳播。在HIV-1傳播過程中，只有一小部分病毒被傳播，目前，對限制性傳播與病毒的生物學(xué)特征之間的關(guān)系還缺乏了解，病毒復(fù)制適應(yīng)性在HIV-1選擇性傳播中變化特點引起較大關(guān)注。而HIV-1的復(fù)制適應(yīng)性在很大程度上由糖蛋白Env決定。關(guān)于HIV-1適應(yīng)性的研究，在目前所采用的病毒競爭實驗中，多采用異源雙鏈?zhǔn)聚櫃z測(heteroduplex tracking assay, ΗΤΑ)法和real-time PCR定量的方法來測定病毒的產(chǎn)量。HTA需放射性同位素檢測，昂貴、費時；real-time PCR批量間差異比較大，重復(fù)性相對較差；而且二者均需要提取感染宿主細(xì)胞基因組，之后對其進(jìn)行相應(yīng)的目的基因的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是建立新型熒光重組病毒競爭實驗體系，以便檢測受糖蛋白Env影響的HIV-1復(fù)制適應(yīng)性。
[0004]在該體系中，分別以表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)和紅色熒光蛋白(DsRed2)的B亞型標(biāo)準(zhǔn)株NL4.3 (Δ Env)為骨架，將源自兩種不同HIV-1病毒的env基因通過同源重組的方法，構(gòu)建熒光重組嵌合病毒，見附圖1。兩種攜有不同熒光蛋白的競爭病毒分別單獨感染及共感染靶細(xì)胞U87-CD4-CCR5，見附圖2。單獨感染的兩種不同病毒分別作為兩種競爭病毒的自身對照，不同的熒光蛋白作為區(qū)分兩種競爭病毒的標(biāo)簽，通過流式細(xì)胞技術(shù)分別計算帶有不同熒光的細(xì)胞(已感染病毒)個數(shù)，可以快速準(zhǔn)確地獲得不同病毒感染的細(xì)胞數(shù)量，見附圖3。經(jīng)過相應(yīng)的計算可以得到兩種競爭病毒的相對適應(yīng)性(relative fitness)。HIV-1復(fù)制適應(yīng)性可以通過一系列統(tǒng)計計算得到，其成為反應(yīng)HIV-1對特定宿主細(xì)胞環(huán)境適應(yīng)能力的量化指標(biāo)。
[0005]本發(fā)明首先提供了構(gòu)建表達(dá)EGFP或者DsRed2熒光蛋白標(biāo)記的重組HIV-1病毒的方法，通過PCR方法擴增出基因；使用限制性內(nèi)切酶Xba I (New England Biolabs)酶切 NL4.3 Δ EnvEGFP 或 NL4.3 Δ EnvDsRed2 載體使其線性化。使用 FuGENE 6 (Roche,Indiana polis, IN)將相同分子數(shù)的PCR擴增產(chǎn)物片段與線性化的NL4.3 Λ EnvEGFP或NL4.3 Δ EnvDsRed2載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(2.5 X IO6個細(xì)胞/IOcm培養(yǎng)皿)，由于PCR引物(EnvB-F:5-AGAAAGAGCAG A AG ACAGTGGC AAT GA-3 ；EnvB-R: 5-TTGT ACTACTTCTATAACCTTATCTGT-3)與線性 NL4.3 Δ EnvEGFP 或 NL4.3 Δ EnvDsRed2 (本研究領(lǐng)域常用質(zhì)粒，序列網(wǎng)上可以查到)的5’及3’端具有相同的核苷酸序列，利用細(xì)胞的重組酶和NL4.3ΛEnvEGFP或NL4.3ΛEnvDsRed2進(jìn)行同源重組，得到了 HIV熒光重組病毒。轉(zhuǎn)染后60h收獲病毒上清，并用0.45μπι的濾膜(Millipore)過濾，_80°C保存用于病毒滴度測定和生長競爭分析。
[0006]利用上述方法構(gòu)建的熒光重組病毒通過生長競爭實驗的方法來評價病毒復(fù)制適應(yīng)性，該方法用流式細(xì)胞儀計數(shù)綠色或紅色重組熒光病毒感染的細(xì)胞數(shù)，分別表示重組熒光病毒產(chǎn)生的子代病毒數(shù)；用公式(I)和公式(2)計算出病毒的適應(yīng)性數(shù)值，
W (R) = [ (b/a) / (c/d+b/a) ] X 2(I)
和 W(G) = [(c/d)/(b/a+c/d)] X2 (2)
其中，W(R)、W(G)分別表示DsRed2和EGFP重組病毒的適應(yīng)性，a為表達(dá)DsRed2重組病毒單獨感染的陽性細(xì)胞率，d為表達(dá)EGFP熒光重組病毒單獨感染的陽性細(xì)胞率，b、c分別為兩種競爭病毒共同感染時，分別表達(dá)DsRed2和EGFP的陽性細(xì)胞率；
在這里選用表達(dá)紅色或綠色不同熒光蛋白的NL4.3熒光重組病毒作為陽性對照，通過流式細(xì)胞儀測定單獨感染和共同感染時帶有不同熒光的細(xì)胞陽性率，將這些數(shù)值帶入公式(I)和公式(2)即可得出病毒的適應(yīng)性數(shù)值。具體內(nèi)容包括:
1、評價病毒復(fù)制適應(yīng)性的生長競爭實驗的方法。
[0007]生長競爭實驗涉及到兩種不同HIV病毒共感染一種細(xì)胞培養(yǎng)物。在我們的系統(tǒng)中，用兩種病毒共感染細(xì)胞或一種病毒分別感染細(xì)胞；感染多輪之后，在共感染中被一種病毒感染的細(xì)胞數(shù)與在單獨感染中被一種病毒感染的細(xì)胞數(shù)比較。將U87- CD4 -CXCR4/CCR5按照5X IO4細(xì)胞/孔，鋪于24孔板。分別使用兩種不同熒光標(biāo)記的病毒單獨感染細(xì)胞(MOI=0.005)，同時等量混合，共同感染細(xì)胞，37°C 5% C02,培養(yǎng)24 h。使用PBS清洗三次，去除未和靶細(xì)胞受體結(jié)合病毒，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)直至收集細(xì)胞。
[0008]2、被EGFP或DsR ed2標(biāo)記的HIV-1感染的細(xì)胞定量計數(shù)的方法。
[0009]用倒置廣角熒光顯微鏡Eclipse TE300 (Nikon, Japan)每天監(jiān)控?zé)晒饧?xì)胞的多少。EGFP或DsRed2標(biāo)記的HIV-1感染細(xì)胞5天后熒光信號最強。這時收獲細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀FACSCalibur和Cell Quest Pro Software分析突光細(xì)胞數(shù)。
[0010]3、最后本發(fā)明提供了評價病毒適應(yīng)性的方法。
[0011]適應(yīng)性的計算以在共感染過程中產(chǎn)生的病毒數(shù)與單獨感染產(chǎn)生的病毒數(shù)的比較為基礎(chǔ)。在感染5天后,通過用流式細(xì)胞儀計算被綠色或者紅色熒光病毒感染的細(xì)胞數(shù)來表示產(chǎn)生的病毒數(shù)。在我們的HIV-1競爭實驗體系中，兩種競爭性病毒的最初比例為1:1。帶有DsRed2的熒光重組病毒的適應(yīng)性數(shù)值用b/a表示，帶有EGFP的熒光重組病毒的適應(yīng)性數(shù)值有c/d表示。選用表達(dá)不同熒光蛋白的NL4.3熒光重組病毒作為陽性對照，以最適MOI=0.01感染表達(dá)⑶4及CXCR4和CCR5輔助受體的TZM_bl細(xì)胞，5天后收獲細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀測定單獨感染和共同感染的熒光細(xì)胞陽性率見附圖3。附圖3中，A圖和B圖分別為用不同的重組熒光病毒感染TZM-bl細(xì)胞之后的流式結(jié)果，C圖為共感染之后的流式結(jié)果。研究證實NL4.3熒光重組病毒具有相同的病毒復(fù)制適應(yīng)性而不受不同熒光蛋白標(biāo)簽的影響。在競爭分析中，每種病毒的相對適應(yīng)性值是三次重復(fù)結(jié)果的平均值。用兩種HIV-1毒株的相對適應(yīng)性值的比率表示這兩種毒株之間的適應(yīng)性差異。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果:
本發(fā)明運用DNA同源重組的原理設(shè)計了帶有不同熒光標(biāo)簽的HIV重組病毒。通過流式細(xì)胞儀及相應(yīng)的軟件就可以很容易計算出病毒適應(yīng)性數(shù)值，方便、快捷、花費低、安全和重復(fù)性好。
[0013]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1:HIV-l-EGFP/DsRed2標(biāo)記的熒光重組病毒的構(gòu)建。
[0015]圖2:競爭性實驗示意圖。 [0016]圖3:病毒的相對適應(yīng)性數(shù)值的計算。
[0017]圖4:熒光重組病毒感染U87-⑶4 -CXCR4/CCR5的動力學(xué)曲線。
[0018]圖5:母親、嬰兒重組熒光病毒在U87-⑶4-CCR5細(xì)胞的體外競爭實驗，
注:1084i6-lR:DsRed2標(biāo)記的來自嬰兒的病毒；1084M0_4G:EGFP標(biāo)記的來自母親的病毒；1084M0-4G+1084i6-lR:母、嬰重組病毒共感染U87細(xì)胞。
[0019]圖6 =HIV慢性感染母嬰對熒光重組病毒的相對適應(yīng)性數(shù)值。
[0020]圖7:母親、嬰兒重組熒光病毒置換標(biāo)簽后在U87-⑶4-CCR5細(xì)胞的體外競爭實驗， 注:1084i6-lG: EGFP標(biāo)記的來自嬰兒的病毒；1084M0_4R:DsRed2標(biāo)記的來自母親的
病毒；1084M0-4R+1084i6-lG:母、嬰重組病毒共感染U87細(xì)胞。
[0021]圖8 =HIV慢性感染母嬰對置換熒光標(biāo)簽后重組病毒的相對適應(yīng)性數(shù)值。
[0022]圖9:母親、嬰兒重組熒光病毒在PBMC細(xì)胞的競爭實驗，
注:1084i6-lR:DsRed2標(biāo)記的來自嬰兒的病毒；1084iM0_4G:EGFP標(biāo)記的來自母親的病毒；1084M0-4G+1084i6-lR:母、嬰重組病毒共感染PBMC。
[0023]圖10 =HIV慢性感染母嬰對重組病毒在PBMC的Ex vivo適應(yīng)性數(shù)值。
[0024]
【具體實施方式】
[0025]實施例1
通過建立的熒光重組病毒競爭性實驗體系比較HIV母嬰傳播中供體(母親)和受體(嬰兒)來源的HIV病毒的Env對病毒復(fù)制適應(yīng)性的影響。
[0026]一、熒光重組病毒的構(gòu)建
PCR獲得病毒全長基因片段，所用引物序列:EnvB-F (5-AGAAAGAGCAG A AGACAGTGGC AAT GA-3) ；EnvB-R (5-TTGTACTACTTCTATAACCTTATCTGT-3)。 將 NL4.3AEnvEGFP或NL4.3AEnvDsRed2載體，通過Xba I酶切，回收線性片段。使用FuGENE 6(Roche)將上述兩種片段等摩爾轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，由于PCR引物與線性NL4.3 Δ EnvEGFP和NL4.3 Δ envDsRed2 5’及3’端具有相同的核苷酸序列，利用細(xì)胞的重組酶env和NL4.3Λ Env EGFP或NL4.3AEnvDsRed2進(jìn)行同源重組，得到了 HIV熒光重組病毒。培養(yǎng)60 h，收集上清，過0.45 μ m濾膜，得到病毒儲液，保存于-80 °C。
[0027]二、病毒滴度的測定
4倍梯度稀釋病毒儲液，通過感染表達(dá)HIV-⑶4及輔助受體CXCR4和CCR5的TZM_bl細(xì)胞(3個復(fù)孔)，由于HIV-LTR能夠啟動TZM-bl β -gal的表達(dá)，通過底物顯色反應(yīng)及概率統(tǒng)計計算重組病毒TCID50。
[0028]三、重組熒光嵌合病毒復(fù)制動力學(xué)曲線(I)第I天將感染靶細(xì)胞U87-⑶4 -CXCR4/CCR5按照5 X IO4細(xì)胞/孔，鋪于24孔板。
[0029](2)第2天將表達(dá)不同熒光蛋白的重組病毒以三種不同MOI (0.001，0.005,0.01)分別單獨感染和共感染U87- CD4 -CXCR4/CCR5。
[0030](3)分別在感染后的第2，4，6，8，10，12天收獲上清，進(jìn)行病毒滴度測定，病毒滴度以TCID5tl表示。
[0031](4)根據(jù)以上病毒滴度繪制熒光重組病毒體外復(fù)制動力學(xué)曲線見附圖4，以峰值的出現(xiàn)時間作為病毒競爭體系收獲病毒的最佳時間，從附圖4中我們可以得出結(jié)論收獲病毒的最佳時間為5天。 [0032]四、HIV感染母嬰對適應(yīng)性分析系統(tǒng)的建立
(I)選用表達(dá)不同熒光蛋白的NL4.3熒光重組病毒作為陽性對照，以最適MOI感染表達(dá)⑶4及CXCR4和CCR5輔助受體的TZM-bl細(xì)胞，5天后收獲細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定單獨感染和共同感染的細(xì)胞陽性率見附圖3。圖3中，A圖和B圖分別為用不同的重組熒光病毒感染TZM-bl細(xì)胞之后的流式結(jié)果，C圖為共感染之后的流式結(jié)果。公式W(R) = [(b/a) / (c/d+b/a) ] X 2 和 W (G) = [ (c/d) / (b/a+c/d) ] X 2 中 a 為表達(dá) DsRed2 重組病毒單獨感染細(xì)胞的陽性細(xì)胞率，d為表達(dá)EGFP熒光重組病毒單獨感染的陽性細(xì)胞率，b, c分別為兩種競爭病毒共同感染時，分別表達(dá)DsRed2和EGFP的陽性細(xì)胞率。W(R)、W(G)分別表示DsRed2和EGFP重組病毒的相對適應(yīng)性。研究證實NL4.3熒光重組病毒具有相同的病毒復(fù)制適應(yīng)性而不受不同熒光蛋白標(biāo)簽的影響。
[0033](2)選用NL4.3熒光重組病毒作為陽性對照，與來源于病人/感染者樣本的熒光重組病毒進(jìn)行競爭實驗，方法同上所述，根據(jù)已有報道，NL4.3重組病毒具有比病人/感染者C亞型重組病毒更高的適應(yīng)性。我們?nèi)〉昧伺c已有報道一致的結(jié)果。
[0034]來源于病人/感染者樣本的熒光重組病毒的競爭實驗以及相對適應(yīng)性值
(I)將U87-⑶4 -CXCR4/CCR5按照5 X IO4細(xì)胞/孔，鋪于24孔板。分別使用兩種不同熒光標(biāo)記的病毒單獨感染細(xì)胞(MOI=0.005)，同時等量混合，共同感染細(xì)胞，37 V 5% C02,培養(yǎng)24 h。使用PBS清洗三次，去除未和靶細(xì)胞受體結(jié)合病毒，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)直至收集細(xì)胞。
[0035](2)感染病毒5天后，收集細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀，進(jìn)行測定。病毒復(fù)制適應(yīng)性的計算見附圖3，通過病毒單獨感染作為自身對照，對于競爭實驗，起始病毒量為1:1。通過最終病毒的產(chǎn)量，即可得到病毒復(fù)制適應(yīng)性的量化指標(biāo)見附圖5和附圖6，Env來自嬰兒的病毒復(fù)制適應(yīng)性要高于來自母親病毒的復(fù)制適應(yīng)性。
[0036]五、熒光重組病毒競爭體系的驗證
(I)為進(jìn)一步驗證傳播病毒復(fù)制適應(yīng)性與非傳播病毒的不同是由于病毒本身所致，而并非由于不同熒光蛋白標(biāo)簽的作用，須將熒光重組病毒的熒光蛋白標(biāo)簽進(jìn)行互換，進(jìn)一步進(jìn)行病毒競爭實驗，步驟同上見附圖7和附圖8，說明熒光蛋白標(biāo)簽不影響病毒的復(fù)制適應(yīng)性。
[0037](2)進(jìn)一步明確傳播病毒復(fù)制適應(yīng)性與非傳播病毒的不同是否存在細(xì)胞特異性，來自健康獻(xiàn)血者的PBMC作為感染靶細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行病毒競爭實驗見附圖9和附圖10，表明傳播病毒適應(yīng)性與非傳播病毒的不同不存在細(xì)胞特異性。
【權(quán)利要求】
1.表達(dá)EGFP或DsRed2熒光蛋白重組HIV-1病毒的構(gòu)建方法，通過PCR方法擴增得到基因，使用限制性內(nèi)切酶Xba I酶切NL4.3 Δ EnvEGFP或NL4.3 Δ EnvDsRed2載體使 NL4.3 Δ EnvEGFP 或 NL4.3 Δ EnvDsRed2 線性化，使用 FuGENE 6 (Roche,Indianapolis, IN)將相同分子數(shù)的PCR擴增產(chǎn)物env片段與線性化的NL4.3 Δ EnvEGFP或NL4.3 Δ EnvDsRed2載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，2.5 X 106個細(xì)胞/10cm培養(yǎng)皿，根據(jù)PCR引物與線性NL4.3 Δ Env EGFP或NL4.3 Δ Env DsRed2的5’及3’端具有相同的核苷酸序列，利用細(xì)胞重組酶將e/^和NL4.3ΛEnvEGFP或NL4.3ΛEnv DsRed2進(jìn)行同源重組，得到HIV突光重組病毒。
2.利用權(quán)利要求1所述方法構(gòu)建的熒光重組病毒通過生長競爭實驗的方法來評價病毒的復(fù)制適應(yīng)性，該方法用流式細(xì)胞儀計數(shù)綠色或紅色重組熒光病毒感染的細(xì)胞數(shù)，分別表示重組熒光病毒產(chǎn)生的子代病毒數(shù)；用公式(1)和公式(2)計算出病毒的適應(yīng)性數(shù)值，
W (R) = [ (b/a) / (c/d+b/a) ] X 2(1) 和 W(G) =[(c/d) / (b/a+ c/d) ] X 2 (2) 其中，W(R)、W(G)分別表示DsRed2和EGFP重組病毒的適應(yīng)性，a為表達(dá)DsRed2重組病毒單獨感染的陽性細(xì)胞率，d為表達(dá)EGFP熒光重組病毒單獨感染的陽性細(xì)胞率，b、c分別為兩種競爭病毒共同感染時，分別表達(dá)DsRed2和EGFP的陽性細(xì)胞率； 在這里選用表達(dá)紅色或綠色不同熒光蛋白的NL4.3熒光重組病毒作為陽性對照，通過流式細(xì)胞儀測定單獨感染和共同感染時帶有不同熒光的細(xì)胞陽性率，將這些數(shù)值帶入公式(1)和公式(2)即可得出病毒 的適應(yīng)性數(shù)值。
【文檔編號】C12N15/66GK103695450SQ201310707633
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】孔曉紅, 劉暢, 趙學(xué)潮, 劉彬, 沈文遠(yuǎn) 申請人:南開大學(xué)