一種通過乳酸菌發(fā)酵合成吡咯喹啉醌的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種通過乳酸菌發(fā)酵合成吡咯喹啉醌的方法，包括以下步驟：將保存于瓊脂繼代培養(yǎng)基的植物乳桿菌Lactobacillus?plantarum?PQQ-1經(jīng)活化培養(yǎng)基活化后，20～40℃靜置培養(yǎng)16～30h成為一級種子，一級種子經(jīng)一級種子培養(yǎng)基繼續(xù)20～40℃擴大靜置培養(yǎng)16～30h成為二級種子，二級種子經(jīng)二級種子培養(yǎng)基繼續(xù)20～40℃擴大靜置培養(yǎng)42～54h后進入發(fā)酵狀態(tài)，在生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中20～40℃厭氧培養(yǎng)54～66h，得到PQQ。所用乳酸菌屬于食品級安全微生物，經(jīng)過發(fā)酵得到PQQ，產(chǎn)率高，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種通過乳酸菌發(fā)酵合成吡咯喹啉醌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種通過乳酸菌發(fā)酵合成吡咯喹啉醌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]批咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,簡稱PQQ)是繼黃素核苷酸和煙酰胺核苷酸之后在細菌脫氫酶中發(fā)現(xiàn)的第三種輔基，它的化學(xué)名稱為4，5- 二氫-4，5- 二氧化-1-氫吡咯(2，3f)醌-2，7，9-三羧酸,又名Methaxatin。自然條件下僅Methylovorus、Deinococcus radiodurans>Gluconobacter oxydans、Klebsiella pneumoniae 等少數(shù)細菌能夠合成(Xiong et al, 2011 ；Magnusson et al, 2007 ；Khairnar et al, 2003 ；Felder etal, 2000)ο
[0003]雖然僅少數(shù)細菌能夠合成PQQ，但在各種植物、動物以及人體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)含有微量PQQ0日本科學(xué)家測定了 26種常見食物中的PQQ含量，發(fā)現(xiàn)I克食物中PQQ含量在3.65-61納克不等，例如，蔬菜中的歐芹、青椒，水果中的奇異果、木瓜，飲品中的綠茶、烏龍茶，以及人們常吃的豆腐。值得注意的是，日本傳統(tǒng)食物納豆當(dāng)中PQQ含量最高，達到61納克/克。這可能是因為納豆是大豆經(jīng)過細菌長期發(fā)酵后制成的食物，其中的細菌不斷分泌PQQ產(chǎn)生了濃縮效應(yīng)。
[0004]美國研究人員檢測 發(fā)現(xiàn)，人乳中PQQ含量竟然高達140-180納克/毫升。任何生理過程都有其必要性和合理性。人類經(jīng)過數(shù)百萬年的長期進化，發(fā)展出了一套適應(yīng)環(huán)境的高效運作機制。母乳中含有如此高濃度PQQ，說明該物質(zhì)對新生嬰幼兒的生長發(fā)育可能起到至關(guān)重要的作用。
[0005]既然PQQ只能由某些細菌合成，那么植物、動物和人體中的PQQ又從何而來？目前，科技界普遍認為，動物和人類腸道中雖然有種類豐富的細菌，但均不能合成PQQ或合成量極少，無法滿足身體需要。因此，動物和人類只能通過飲食途徑獲取PQQ。而植物體內(nèi)的PQQ是從環(huán)境中吸收還是自己合成，或者兩者兼而有之，至今還不明確。
[0006]PQQ作為一種普遍存在于動物和植物組織中的氧化還原酶輔基，雖然含量非常低，但作用重要，不僅是一種新發(fā)現(xiàn)的線粒體呼吸鏈組分，參與催化生物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，還具有非常多樣的生物活性，缺乏時會引起哺乳動物諸多代謝障礙，被認為是一種新型維生素(Misra et al, 2012 ；Rucker et al, 2012 ；Kasahara et al, 2005 ；Rucker et al, 2005 ；Toyama et al, 2005 ；Storms et al, 2003 ；He et al, 2003 ；Bishop et al, 1998)。
[0007]PQQ對哺乳動物的主要生理作用有:
[0008]①全面提高人體免疫功能，作為人類發(fā)育的必要因子，能刺激人體細胞生長，尤其是激活人體B細胞、T細胞，提高人體免疫功能；
[0009]②防治肝損傷，能顯著降低血清膽紅素和谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平，調(diào)理肝損傷，對肝臟疾病有極好療效；
[0010]③減少自由基對人體的傷害，PQQ是一種氧化還原酶輔基，參與生物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，能有效清除體內(nèi)自由基，減少自由基對人體傷害所引發(fā)的各種疾病，如心臟病、癌癥以及各類炎癥；
[0011]④調(diào)理各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，PQQ在人體內(nèi)能促進神經(jīng)因子合成，調(diào)理各種神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?br> [0012]⑤促進氨基酸吸收，PQQ是醌蛋白酶的輔基，參與呼吸鏈電子傳遞，在人體內(nèi)能促進氨基酸吸收；
[0013]⑥能促進生長因子合成，生長因子是人類生長的激素，能刺激人體細胞生長，增加細胞密度，微量PQQ就能提高生物體組織的代謝能力和生長機能；
[0014]⑦防治老年癡呆癥，PQQ具有修復(fù)神經(jīng)纖維、活化神經(jīng)元、激活休眠神經(jīng)細胞的能力，能有效防治老年癡呆癥和改善記憶力；
[0015]⑧促進谷胱甘肽合成，谷胱甘肽具有重要抗氧化作用和整合解毒作用，PQQ能促進機體谷胱甘肽合成，防止白內(nèi)障發(fā)生和肝臟膽紅素積累；
[0016]⑨極強的抗癌功能，激活自然殺傷細胞(NK)細胞為ANK細胞，使其具有殺腫瘤作用；使NK細胞等免疫細胞聚集，更有效地殺滅腫瘤細胞；封閉腫瘤細胞載鐵蛋白受體，阻斷其功能，抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移；破壞腫瘤細胞脂質(zhì)雙層，使腫瘤細胞溶解死亡；阻止腫瘤細胞DNA復(fù)制，促其凋亡。
[0017]對具有合成PQQ能力的典型菌Klebsiella pneumoniae代謝途徑的研究表明(Magnusson et al，2007)，合成PQQ所必需的基因共有6個，命名為pqqABCDEF，但具體途徑不清楚，只知道PqqC催化最后一步合成步驟，將3a_ (2-amino-2_carboxyethyl) _4，5_dioxo-4, 5, 6, 7, 8, 9-hexahydroquinoline-7, 9-dicar boxylic acid(AHQQ)轉(zhuǎn)化為 PQQ。定量測定 PQQ 的 HPLC 等色譜方法已經(jīng)建立(Noji N, Nakamura T, Kitahata N, et al.Simpleand sensitive method forpyrroloquinoline quinone(PQQ)analysis in various foodsusing liquid chromatography/e`Iectrospray-lonization tandem mass spectrometry.JAgri Food Chem, 2007，55(18):7258-7263)。
[0018]PQQ作為一種新型維生素和功能強大豐富的生物活性因子，目前仍然處于基礎(chǔ)研究階段，尚無法實施其規(guī)?；a(chǎn)，主要障礙在于具有合成PQQ能力的微生物產(chǎn)率低下且都不屬于食品級安全微生物，合成途徑也不清楚，而可能具備PQQ合成潛力的植物也都產(chǎn)率低下且合成途徑更是一無所知。盡管如此，近年來仍然開展了微生物發(fā)酵合成PQQ的研究并取得一定進展。Xiong等(2011)用Methylovorus sp.MP688發(fā)酵合成PQQ,產(chǎn)率達到125mg/L (Xiong XH, Zhao Y, Ge X,et al.Production and Radioprotective Effects ofPyrroloquinoline Quinone.1nter J Mol Sci,2011，12(12):8913-8923) ;Yang 等(2010)將Gluconobacter oxydans的pqqABCDE基因簇轉(zhuǎn)化入E.coli,使其發(fā)酵液中PQQ濃度達至Ij 6mM (Yang XP, Zhong GF, Lin JP, et al.Pyrroloquinoline quinone biosynthesis inEscherichia coli through expression of the Gluconobacter oxydans pqqABCDE genecluster.J Indust Microbiol Biotechnol, 2010, 37 (6): 575-580)。但遺憾的是，目前發(fā)現(xiàn)的或重組構(gòu)建的具有PQQ合成能力的細菌均非食品級安全微生物，因此，為實現(xiàn)PQQ的規(guī)?；a(chǎn)，急需選育PQQ產(chǎn)率高、生產(chǎn)性能好的食品級安全微生物。乳酸菌不僅為公認安全的食品級微生物，而且種屬繁多，基因資源豐富，選育高產(chǎn)PQQ的乳酸菌不僅有充分可行性，而且是實現(xiàn)PQQ規(guī)?；a(chǎn)的首選途徑。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]本發(fā)明提供了一種通過乳酸菌發(fā)酵合成吡咯喹啉醌的方法，所用乳酸菌為植物乳桿菌Lactobacillus plantarum PQQ-1,屬于食品級安全微生物，經(jīng)過發(fā)酵得到PQQ,產(chǎn)率聞。
[0020]一種通過乳酸菌發(fā)酵合成吡咯喹啉醌的方法，包括以下步驟:
[0021]將保存于瓊脂繼代培養(yǎng)基(A)的植物乳桿菌Lactobacillus pi ant arum PQQ-1經(jīng)活化培養(yǎng)基(B)活化后，20°C~40°C靜置培養(yǎng)16h~30h成為一級種子，一級種子經(jīng)一級種子培養(yǎng)基(Cl)繼續(xù)20°C~40°C擴大靜置培養(yǎng)16h~30h成為二級種子，二級種子經(jīng)二級種子培養(yǎng)基(C2)繼續(xù)20°C~40°C擴大靜置培養(yǎng)42h~54h后進入發(fā)酵狀態(tài)，在生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基(D)中20°C~40°C厭氧培養(yǎng)54h~66h，得到PQQ。
[0022]瓊脂繼代培養(yǎng)基(A)用于保存植物乳桿菌Lactobacillus pi ant arum PQQ-1,活化培養(yǎng)基(B)用于植物乳桿菌Lactobacillus pi ant arum PQQ-1活化增殖,一級種子培養(yǎng)基(Cl)和二級種子培養(yǎng)基(C2)分別用于植物乳桿菌Lactobacillus pi ant arum PQQ-1逐級增殖形成高密度種子，然后接入生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基(D)開始合成PQQ。
[0023]本發(fā) 明中，植物乳桿菌Lactobacillus pi ant arum PQQ-1系從雪蓮菌(Tibetkefir，一種由乳酸菌、醋酸菌、酵母等組成的共生益生菌群)中分離得到，屬于食品級安全微生物。具體分離過程是:向雪蓮菌(Tibet kefir，一種由乳酸菌、醋酸菌、酵母等組成的共生益生菌群)加適量無菌水，將雪蓮菌顆粒在碾磨中碾碎后，稀釋，涂布含小鼠抗PQQ IgGl單抗的MRS固體平板培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)48h~72h，菌落周圍形成沉淀圈者，為產(chǎn)吡咯喹啉醌(PQQ)菌，經(jīng)鑒定，獲得的產(chǎn)PQQ菌為植物乳桿菌Lactobacillus plantarum,命名為Lactobacillus plantarum PQQ-1。植物乳桿菌Lactobacillus plantarum PQQ-1 系食品級安全微生物，可采用市售產(chǎn)品，購自嘉興元科生物科技有限公司，商品號為YK-S-003。小鼠抗PQQ IgGl單抗可采用市售產(chǎn)品，購自嘉興元科生物科技有限公司，商品號為YK-Ab-013。
[0024]進一步，所述的瓊脂繼代培養(yǎng)基(A)以IL計，包括以下重量的組分:
[0025]
【權(quán)利要求】
1.一種通過乳酸菌發(fā)酵合成吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，包括以下步驟: 將保存于瓊脂繼代培養(yǎng)基的植物乳桿菌Lactobacillus plantarum PQQ-1經(jīng)活化培養(yǎng)基活化后，20°C~40°C靜置培養(yǎng)16h~30h成為一級種子,一級種子經(jīng)一級種子培養(yǎng)基繼續(xù)20°C~40°C擴大靜置培養(yǎng)16h~30h成為二級種子，二級種子經(jīng)二級種子培養(yǎng)基繼續(xù)20°C~40°C擴大靜置培養(yǎng)42h~54h后進入發(fā)酵狀態(tài)，在生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中20°C~40°C厭氧培養(yǎng)54h~66h，得到PQQ。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過乳酸菌發(fā)酵合成吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，所述的瓊脂繼代培養(yǎng)基以IL計，包括以下重量的組分:
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過乳酸菌發(fā)酵合成吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，該瓊脂繼代培養(yǎng)基用酸堿緩沖液調(diào)節(jié)pH至6.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過乳酸菌發(fā)酵合成吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，所述的活化培養(yǎng)基以IL計，包括以下重量的組分:
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的通過乳酸菌發(fā)酵合成吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，該活化培養(yǎng)基用酸堿緩沖液調(diào)節(jié)pH至6.8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過乳酸菌發(fā)酵合成吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，所述的一級種子培養(yǎng)基以IL計，包括以下重量的組分:
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的通過乳酸菌發(fā)酵合成吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，該一級種子培養(yǎng)基用酸堿緩沖液調(diào)節(jié)pH至6.8。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過乳酸菌發(fā)酵合成吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，所述的二級種子培養(yǎng)基以IL計，包括以下重量的組分: 全粒大麥粉30g; 酵母抽取物7.5g; 水余量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的通過乳酸菌發(fā)酵合成吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，該二級種子培養(yǎng)基用酸堿緩沖液調(diào)節(jié)pH至6.8。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的通過乳酸菌發(fā)酵合成吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，所述的生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基以IL計，包括以下重量的組分: 全粒大麥粉30g; 酵母抽取物7.5g; 水余量。
【文檔編號】C12R1/25GK103740780SQ201310710586
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】阮暉, 胡慧雯, 梁瑩, 徐娟, 李青青, 于驊, 陳功, 諸文穎, 林永華, 徐薇薇, 吳淵, 紀曉燚 申請人:浙江大學(xué)