FGFR2b胞外段的基因序列、多肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供野生型、S252W突變型和P253R突變型FGFR2b胞外段的基因序列和其分別編碼的多肽，所述多肽的制備體系，包括重組載體、宿主細(xì)胞以及制備方法，F(xiàn)GFR2b胞外段的抗體及其制備方法、以及FGFR2b胞外段與Fc段的融合多肽、拮抗劑等。本發(fā)明還提供FGFR2b胞外段多肽及組合物在治療濕疹、粉刺、銀屑病、皮膚過(guò)敏、脂溢性皮炎或脂溢性脫發(fā)的應(yīng)用，通過(guò)FGFR2b胞外段對(duì)FGF信號(hào)通路進(jìn)行抑制，并抑制炎性皮膚病的紅腫，瘙癢等的癥狀，對(duì)皮脂的分泌也有抑制作用。
【專利說(shuō)明】FGFR2b胞外段的基因序列、多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及FGFR2b胞外段的基因序列和多肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]炎性皮膚病是指皮膚紅腫、出現(xiàn)丘疹、膿皰等，角質(zhì)細(xì)胞增生而突起，有時(shí)伴有瘙癢，給病人帶來(lái)很大的困擾。濕疹是一種常見的由多種內(nèi)外因素引起的表皮及真皮淺層的炎癥性皮膚病，一般認(rèn)為與變態(tài)反應(yīng)有一定關(guān)系(即過(guò)敏反應(yīng))。痤瘡是一種累及毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病，好發(fā)于青春期俗稱“青春痘”。痤瘡多發(fā)生在面部和胸背等皮脂溢出部位，國(guó)外研究表明，12-24歲的青少年痤瘡發(fā)病率高達(dá)85%。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者紛紛研制出治療炎性皮膚病的藥物，包括中藥和西藥。目前臨床上的常用藥物主要有留醇激素類、抗組胺類、抗表皮異常角化類如維甲酸，副作用大，不能根治。
[0003]角質(zhì)形成細(xì)胞是人體最外層細(xì)胞，保護(hù)機(jī)體免受外界損害。在病理狀態(tài)下，角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生特異的免疫活性產(chǎn)物，釋放前炎性細(xì)胞因子，在炎性皮膚病中起著關(guān)鍵性作用。間質(zhì)細(xì)胞與上皮細(xì)胞相互作用時(shí)激活EGF、FGF、IGF等信號(hào)通路，最終導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，但目前具體的機(jī)制還不是很清楚。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于此，本發(fā)明的目的在于提供治療炎性皮膚病的FGFR2b胞外段的基因序列和多肽及其應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0006]本發(fā)明提供一種編碼野生型人體FGFR2b胞外段的核苷酸序列，其具有:
[0007]a) SEQ ID NO:1所述的堿基序列；或
[0008]b)與SEQ ID NO:1的互補(bǔ)配對(duì)序列；或
[0009]c)與a或b的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與a或b的核苷酸序列不同的序列；或
[0010]d)與a)所述序列或b)或c)所述序列至少有80%同源性的序列。
[0011]本發(fā)明還提供一種由上述核苷酸序列(SEQ ID NO:1)編碼的人體FGFR2b胞外段的多肽，其具有SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列，或具有與SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列至少有80%同源性的序列。
[0012]本發(fā)明還提供另一種編碼人體FGFR2b胞外段的核苷酸序列，其具有:
[0013]a) SEQ ID NO:3所述的堿基序列；或
[0014]b)與SEQ ID NO:3的互補(bǔ)配對(duì)序列；或
[0015]c)與a或b的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與a或b的核苷酸序列不同的序列；或
[0016]d)與a)所述序列或b)或c)所述序列至少有80%同源性的序列。[0017]本發(fā)明還提供由上述核苷酸序列(SEQ ID NO:3)編碼的S252W突變型人體FGFR2b胞外段的多肽，其具有序列表中SEQ ID NO:4所述的氨基酸序列，或具有與SEQ ID NO:4所述的氨基酸序列至少有80%同源性的序列。
[0018]本發(fā)明還提供另一種編碼人體FGFR2b胞外段的核苷酸序列，其具有:
[0019]a) SEQ ID NO:5所述的堿基序列；或
[0020]b)與SEQ ID NO:5的互補(bǔ)配對(duì)序列；或
[0021]c)與a或b的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與a或b的核苷酸序列不同的序列；或
[0022]d)與a)所述序列或b)或c)所述序列至少有80%同源性的序列。
[0023]本發(fā)明還提供一種由上述核苷酸序列(SEQ ID NO:5)編碼的P253R突變型人體FGFR2b胞外段的多肽，其具有序列表中SEQ ID NO:6所述的氨基酸序列，或具有與SEQ IDNO:6所述的氨基酸序列至少有80%同源性的序列。
[0024]本發(fā)明還提供一種含有前述任一種核苷酸序列的載體。
[0025]本發(fā)明還提供一種含有上述載體的宿主細(xì)胞。
[0026]優(yōu)選地， 上述宿主細(xì)胞可以是CHO細(xì)胞、大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞中的任一種。
[0027]本發(fā)明還提供一種含有前述任一種人體FGFR2b胞外段多肽的人體FGFR2b_Fc段融合蛋白。
[0028]優(yōu)選地，上述嵌合分子含有與免疫球蛋白表位標(biāo)記序列或Fe區(qū)融合的人體FGFR2b胞外段多肽。
[0029]本發(fā)明還提供上述FGFR2b胞外段的基因序列和多肽等的應(yīng)用。
[0030]具體技術(shù)方案如下。
[0031]上述的任一種核酸序列、上述多肽中任一項(xiàng)用于制備治療濕疹、粉刺、銀屑病、皮膚過(guò)敏、脂溢性皮炎或脂溢性脫發(fā)的藥物中的應(yīng)用。
[0032]上述載體、上述宿主細(xì)胞、上述人體FGFR2b_Fc段融合蛋白在制備治療濕疹、粉刺、銀屑病、皮膚過(guò)敏、脂溢性皮炎或脂溢性脫發(fā)的藥物中的應(yīng)用。
[0033]一種治療濕疹、粉刺、銀屑病、皮膚過(guò)敏、脂溢性皮炎或脂溢性脫發(fā)的藥物，其活性成分包括上述任一項(xiàng)核酸序列，上述任一項(xiàng)多肽，或上述的載體、或上述宿主細(xì)胞、上述人體FGFR2b-Fc段融合蛋白。
[0034]在其中一個(gè)實(shí)施例中，還包括有FGFR2b拮抗劑，所述FGFR2b拮抗劑是FGF7抗體、FGFlO 抗體、FGFR2b 抗體、AZD4547、AP24534、BGJ398、PD173074、NP603、su5402、su6668、PD161570、PD166866、iRNA、microRNA、反義 RNA、spry, MKP3, DUSP, SEF, XFLRT3 中的一種或一種以上。
[0035]本發(fā)明的有益效果，在于利用FGFR2b胞外段多肽或其藥用組合物阻斷如EGF/FGF/VEGF/IGF等生長(zhǎng)因子信號(hào)通路，阻止其激活，從而抑制炎癥的發(fā)生。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明抑制炎性皮膚病的紅腫，瘙癢等癥狀，對(duì)皮脂的分泌也有抑制作用，有助于改善包括濕疹、過(guò)敏性皮炎、皮膚過(guò)敏、脂溢性皮炎、痤瘡等問(wèn)題皮膚的治療修復(fù)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0036]圖1為實(shí)施例1中野生型、S252W突變型、P253R突變型FGFR2b胞外段的SDS-PAGE圖。
[0037]圖2為實(shí)施例1中野生型、S252W突變型、P253R突變型FGFR2b胞外段的westernblotting鑒定圖。
[0038]圖3為實(shí)施例8中FGF7抗體、FGFR胞外段各組小鼠第3、4次激發(fā)后左耳結(jié)痂數(shù)。
[0039]圖4為實(shí)施例8中FGF7抗體、FGFR胞外段各組小鼠各激發(fā)時(shí)期耳部結(jié)痂厚度比較。
【具體實(shí)施方式】
[0040]為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Samtoook等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。
[0041]實(shí)施例1野生型及突變型FGFR2b胞外段多肽基因在大腸桿菌中的表達(dá)
[0042]本實(shí)施例描述野生型和突變型FGFR2b胞外段基因(SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5)的制備方法，以及通過(guò)其在大腸桿菌(E.coli)中的表達(dá)來(lái)制備FGFR2b胞外段多肽(SEQ ID N0.2, SEQ ID N0.4, SEQ ID N0.6)的方法。
[0043]一、FGFR2b胞外段多肽基因的制備:`[0044]1、用Trizol法從人胎盤組織提取野生型FGFR2b胞外段總mRNA，并建立cDNA文庫(kù)；
[0045](I)以 Trizol 法抽提 mRNA:
[0046]細(xì)胞培養(yǎng)到匯合度達(dá)90%時(shí)，加入Trizol溶液以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解；把所得細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至EP管中，加入1/5體積的氯仿，吸取上層無(wú)色水相至新的EP管中，加入l/2Trizol體積的異丙醇；
[0047]離心，在EP管底部可見白色乳膠狀沉淀，再加入75%乙醇，洗滌沉淀；
[0048]涼干后，加入去RNA酶水，用移液槍反復(fù)吹打混勻，讓RNA充分溶解，檢測(cè)RNA濃度及純度。
[0049](2 )以PCR反應(yīng)進(jìn)行mRNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA:
[0050]在PCR管內(nèi)加入樣品mRNA，在PCR儀上進(jìn)行mRNA預(yù)變性，條件為65°C，IOmin。預(yù)變性后立即插入冰中。
[0051]逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:總體積為20 μ L,并按照以下用量繼續(xù)添加:
[0052]
【權(quán)利要求】
1.一種編碼人體FGFR2b胞外段的核酸序列，其具有: a)SEQ ID NO:1所述的堿基序列；或 b)與SEQID NO:1的互補(bǔ)配對(duì)序列；或 c)與a或b的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與a或b的核苷酸序列不同的序列；或 d)與a)所述序列或b)或c)所述序列至少有80%同源性的序列。
2.由權(quán)利要求1所述核苷酸序列編碼的人體FGFR2b胞外段多肽，其具有SEQID NO:2所述的氨基酸序列；或具有與SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列至少有80%同源性的序列。
3.一種編碼人體FGFR2b胞外段的核酸序列，其具有:
a)SEQ ID NO:3所述的堿基序列；或 b)與SEQID NO:3的互補(bǔ)配對(duì)序列；或 c)與a或b的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與a或b的核苷酸序列不同的序列；或 d)與a)所述序列或b)或c)所述序列至少有80%同源性的序列。
4.由權(quán)利要求3所述核苷酸序列編碼的S252W突變型人體FGFR2b胞外段多肽，其具有SEQ ID NO:4所述的氨基酸序列；或具有與SEQ ID NO:4所述的氨基酸序列至少有80%同源性的序列。
5.一種編碼人體FGFR2b胞外段的核酸序列，其具有: a)SEQ ID NO:5所述的堿基序列；或 b)與SEQID NO:5的互補(bǔ)配對(duì)序列；或 c)與a或b的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與a或b的核苷酸序列不同的序列；或 d)與a)所述序列或b)或c)所述序列至少有80%同源性的序列。
6.由權(quán)利要求5所述的核苷酸序列編碼的P253R突變型人體FGFR2b胞外段的多肽，其具有序列表中SEQ ID NO:6所述的氨基酸序列；或具有與SEQ ID NO:6所述的氨基酸序列至少有80%同源性的序列。
7.一種含有權(quán)利要求1、3、5中任一項(xiàng)所述核酸序列的載體。
8.一種含有權(quán)利要求7所述載體的宿主細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8中所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞、大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞中的任一種。
10.一種含有根據(jù)權(quán)利要求2、4、6中任一項(xiàng)所述人體FGFR2b胞外段多肽的人體FGFR2b-Fc段融合蛋白。
11.權(quán)利要求1、3、5任一項(xiàng)所述的核酸序列、權(quán)利要求2、4、6任一項(xiàng)所述多肽用于制備治療濕疹、粉刺、銀屑病、皮膚過(guò)敏、脂溢性皮炎或脂溢性脫發(fā)的藥物中的應(yīng)用。
12.權(quán)利要求8所述的載體、權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞、或權(quán)利要求10所述的人體FGFR2b-Fc段融合蛋白在制備治療濕疹、粉刺、銀屑病、皮膚過(guò)敏、脂溢性皮炎或脂溢性脫發(fā)的藥物中的應(yīng)用。
13.一種治療濕疹、粉刺、銀屑病、皮膚過(guò)敏、脂溢性皮炎或脂溢性脫發(fā)的藥物，其特征在于，其活性成分包括權(quán)利要求1、3、5任一項(xiàng)所述的核酸序列,或權(quán)利要求2、4、6任一項(xiàng)所述多肽，或權(quán)利要求8所述的載體、權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求10所述的人體FGFR2b-Fc段融合蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物，其特征在于，還包括有FGFR2b拮抗劑，所述FGFR2b拮抗劑是 FGF7 抗體、FGFlO 抗體、FGFR2b 抗體、AZD4547、AP24534、BGJ398、PD173074、NP603、su5402、su6668、PD161570、PD166866、iRNA、microRNA、反義 RNA、spry, MKP3, DUSP, SEF,XFLRT3中的一種或一種以上。
15.FGF7 抗體、FGFlO 抗體、FGFR2b 抗體、AZD4547、AP24534、BGJ398、PD173074、NP603、su5402、su6668、PD161570、PD166866、iRNA、microRNA、反義 RNA、spry, MKP3, DUSP, SEF,XFLRT3中的一種或一種以上在制備治療濕疹、粉刺、銀屑病、皮膚過(guò)敏、脂溢性皮炎或脂溢性脫發(fā)的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK103757026SQ201310714120
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】汪炬, 王宜 申請(qǐng)人:廣州圣露生物技術(shù)有限公司