一種檢測TP53Pro72Arg位點突變的方法及引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因突變檢測領域，具體涉及一種高敏感性TP53Pro72Arg位點突變的檢測方法，它包括：(i)特異性引物對：SEQNO1及SEQNO2；(ii)特異性檢測探針：SEQNO3、SEQNO4，且將MGB基團修飾于兩條探針的3端，以增加特異性。本發(fā)明具有檢測周期短，特異性高，準確度高，靈敏度高，條件依賴少，污染風險低等優(yōu)點。
【專利說明】—種檢測TP53Pro72Arg位點突變的方法及引物
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因突變檢測領域，具體涉及一種高敏感性的TP53Pro72Arg位點突變檢測方法。
【背景技術】 [0002]TP53基因(tumor protein p53)是目前發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關性最高的一種抑癌基因，且常與其他的基因協(xié)同作用，是多種腫瘤的分子標志物。TP53位于人類染色體17pl3上，編碼擁有393個氨基酸的蛋白，該蛋白包括3個主要的結構域:N末端反式激活位點中間的DNA結合區(qū)域和C末端寡聚位點，該基因的蛋白產(chǎn)物是細胞生長、增殖和損傷修復的重要調節(jié)因子，當細胞受到各種理化或生物因素的影響致使DNA受損時，TP53使細胞停止于G1/S期，讓細胞修復損傷而重新進入細胞周期，如損傷未能修復則促進細胞凋亡。
[0003]TP53基因存在多個突變位點，如國內(nèi)外研究熱點Pro72Arg點突變。該位點位于TP53的第72個密碼子，突變發(fā)生在DNA結合位點的氨基酸上，可使TP53蛋白關鍵性的DNA接觸位點消失而失活。突變的TP53蛋白可通過“負顯性效應”阻礙野生型TP53基因的抑制生長功能。野生型蛋白可激活鄰近TP53蛋白一DNA結合位點上p21基因的表達，突變型TP53蛋白則喪失這一活性；突變型蛋白與野生型蛋白結合形成幾乎沒有結合DNA能力的寡聚蛋白復合物，從而不能控制這些位點的基因轉錄，這些位點可能包括抑制細胞或癌變的基因，這樣突變型蛋白將導致腫瘤進一步生長。
[0004]目前，國內(nèi)外諸多研究顯示TP53Pro72Arg突變與肺癌的發(fā)生和預后均有一定相關性。顏麗莉指出Pro72Arg的Arg/Pro和Pro/Pro型與亞洲人群的肺癌易感性相關；同樣,Sakiyama及Fan也得出了相似的結論,等位基因Pro攜帶者的肺癌患病風險較高；孫寧等發(fā)現(xiàn)攜帶72P/R基因型的晚期NSCLC病人較72P/P型病人對鉬類藥物化療的敏感性趨向于降低，而72R/R型病人較攜帶72P/P型病人對化療的敏感性卻趨向于增高，Bergamaschi及Sullivan也指出攜帶野生型Tp53基因72R的病人對順鉬、阿霉素等抗癌藥的敏感性明顯高于攜帶72P者，生存期及無病進展期也長。
[0005]此外，已有的文獻也指出Pro72Arg突變與白血病AML及CML患者的預后存在相關性，例如Camelo等研究了 R72P突變與伊馬替尼治療CML效果的相關性，實驗中共收集85例CML患者樣本，其中27例為Arg/Arg型，Pro/Pro型12例，其余為Arg/Pro型。當使用伊馬替尼后，Arg/Arg型患者的治療失敗率顯著高于其余兩種型，且Arg/Arg型中高于40歲的患者，其失敗的風險更高；而針對AML患者的預后，Shi等研究結果顯示，當AML患者經(jīng)過化療后，Pro72Arg突變的Arg/Arg型患者獲得的治療效果最差。
[0006]因此，了解患者的TP53Pr072Arg基因型情況，將有助于相關疾病的預后判斷及治療方案的制定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于，提供一種高效靈敏的檢測TP53Pro72Arg位點突變的寡核苷酸，包括PCR擴增引物，所述的PCR擴增引物為SEQ NOl和SEQ N02:
[0008]SEQ NOl:CGGACGATATTGAACAATGGTTC ；
[0009]SEQ N02: CGTAGCTGCCCTGGTAGGTT ；
[0010]進一步地，還包括檢測探針為SEQ N03和SEQ N04:
[0011]SEQ N03: FAM-AGGCTGCTCCCCCCGT-MGB ；
[0012]SEQ N04:HEX-AGGCTGCTCCCCGCGT-MGB。
[0013]進一步地，SEQ N03能結合野生型TP53的擴增產(chǎn)物。
[0014]進一步地，SEQ N04能結合突變型TP53的擴增產(chǎn)物。
[0015]本發(fā)明還提供了一種檢測TP53Pro72Arg位點突變的方法，包括:
[0016](I)樣本 DNA 提取；
[0017](2) Real-time PCR擴增反應，以DNA為模板，依據(jù)所述的特異性擴增引物和特異性檢測探針，將所有引物及探針加入同一PCR反應管中進行Real-time PCR擴增，其中:PCR擴增引物為SEQ NOl和SEQ N02，分別是:
[0018]SEQ NOl:CGGACGATATTGAACAATGGTTC ；
[0019]SEQ N02: CGTAG CTGCCCTGGTAGGTT ；
[0020]檢測探針為SEQ N03和SEQ N04,分別是:
[0021]SEQ N03: FAM-AGGCTGCTCCCCCCGT-MGB ；
[0022]SEQ N04: HEX-AGGCTGCTCCCCGCGT-MGB ；
[0023](3)結果分析,根據(jù)Real-time PCR結果來分析樣本的Pro72Arg突變型。
[0024]進一步地，總Real-time PCR 擴增體系為 25ul:包括 2*qPCR MIX12.5ul、引物 SEQNOl 和 SEQ N02 各 0.8ul、探針 SEQ N03 和 SEQ N04 各 0.4ul、滅菌水 8.1ul、DNA 模板 2ul。
[0025]進一步地，Real-timePCR 反應程序:95°C 5min 預變性；95°C 15s，62°C 30s。
[0026]進一步地，結果分析中，若樣本只產(chǎn)生一條擴增曲線，則根據(jù)相對應的探針判斷其突變型；若樣本產(chǎn)生兩條擴增曲線，則判定樣本為雜合突變型。
[0027]本發(fā)明的有益效果:目前，對于檢測TP53Pro72Arg突變型的常用方法為DNA測序，但該法檢測周期需要1-2天，且操作復雜，容易污染；而本發(fā)明的檢測周期只需半天，相對于前者縮短了 I倍多，且全程為閉管檢測，因此具有較短的檢測周期和理想的污染控制。本發(fā)明通過特異性引物及MGB探針擴增目標序列，并直接根據(jù)Real-time PCR結果圖譜分析該位點基因型，可在同一 PCR反應管中檢測純合突變型，雜合型，野生型，避免了臨床漏檢，同時將本發(fā)明檢測結果與DNA測序結果對比，發(fā)現(xiàn)兩者結果一致(見附圖2~7)，說明本發(fā)明具有較高的準確性。因此，本發(fā)明具有操作簡單、檢測周期短、特異性高、準確度高、條件依賴少和污染風險低等優(yōu)點。檢測結果將有助于臨床醫(yī)生更好地根據(jù)個體差異進行相關疾病的預后判斷及治療方案的制定。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1是TP53的4號外顯子標準序列，其中Pro72Arg位點已方框標記。
[0029]圖2是樣本A的Real-time PCR結果。由于只產(chǎn)生一條擴增曲線，且對應探針SEQN03,因此A樣本為野生型，即Pro/Pro型。
[0030]圖3是樣本B的Real-time PCR結果。由于只產(chǎn)生一條擴增曲線，且對應探針SEQN04，因此B樣本為純合突變型，即Arg/Arg型。
[0031]圖4是樣本C的Real-time PCR結果。由于產(chǎn)生兩條擴增曲線，因此C樣本為雜合突變型，即Arg/Pro型。
[0032]圖5~7是樣本A、B、C的sanger測序圖譜。目的是為驗證圖2~4的結果，最終發(fā)現(xiàn)與Real-time PCR檢測結果一致。
【具體實施方式】
[0033]下面結合 具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應當注意的是，實施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規(guī)采用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0034]實施例1
[0035]檢測TP53Pro72Arg位點突變的寡核苷酸，包括PCR擴增引物和探針。所述的PCR擴增引物(SEQ NOl，SEQ N02)和檢測探針(SEQ N03, SEQ N04)為:
[0036]SEQ NOl: CGGACGATATTGAACAATGGTTC ；
[0037]SEQ N02: CGTAGCTGCCCTGGTAGGTT ；
[0038]SEQ N03: FAM-AGGCTGCTCCCCCCGT-MGB ；
[0039]SEQ N04:HEX-AGGCTGCTCCCCGCGT_MGB。
[0040]其中在SEQ N03和SEQ N04的3端標記了 MGB，用于增強檢測特異性。SEQ N03能結合野生型TP53的擴增產(chǎn)物，SEQ N04能結合突變型TP53的擴增產(chǎn)物。
[0041]實施例2
[0042]檢測TP53Pro72Arg位點突變的試劑盒，包括紅細胞裂解液、DNA提取液、PCR試劑、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品，其中:
[0043]qPCR 試劑為 2*qPCR MIX、50*R0X、擴增引物 SEQ NOl 和 SEQ N02、探針 SEQ N03 和SEQ N04、滅菌水，其中:
[0044]SEQ NOl:CGGACGATATTGAACAATGGTTC ；
[0045]SEQ N02: CGTAGCTGCCCTGGTAGGTT ；
[0046]SEQ N03:FAM-AGGCTGCTCCCCCCGT-MGB ；
[0047]SEQ N04:HEX-AGGCTGCTCCCCGCGT_MGB。
[0048]陽性對照品:含有TP53序列的溶液。
[0049]陰性對照品:無TP53序列的溶液。
[0050]空白對照品:2 ill生理鹽水或不加任何物質。
[0051]所述試劑盒的使用方法包括如下步驟:
[0052](i )提取樣本中的DNA
[0053](ii)以DNA為模板，依據(jù)所述的特異性擴增引物(SEQ NOU SEQ N02)、檢測探針(SEQ N03、SEQ N04)進行 Real-time PCR 擴增；
[0054](iii)根據(jù)Real-time PCR結果來分析樣本的Pro72Arg突變型。
[0055]通過幾百例臨床受檢樣本用本試劑盒中的引物和探針(SEQ NOU SEQ N02、SEQN03、SEQ N04)進行Real-time PCR擴增，發(fā)現(xiàn)其具有較高的穩(wěn)定性、特異性、靈敏度；同時使用Sanger測序法對相同的受檢樣本進行測序，結果兩類方法的檢測結果完全一致，說明本方法具有極高的檢測準確性。
[0056]實施例3:
[0057]檢測TP53Pro72Arg位點突變的方法，包括
[0058]1、DNA 提取
[0059](I)抽取300uL血液加入900uL紅細胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，期間再顛倒混勻幾次。1000Orpm離心I分鐘(若離心機最高轉速不允許,可3000rpm離心5min),吸去上清，留下白細胞沉淀，加200uL緩沖液GA，振蕩至徹底混勻。
[0060](2)加入20 μ I蛋白酶K溶液，混勻后加入200 μ I緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置10分鐘，溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0061](3)加人200 μ I無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0062](4)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm(13, 400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
[0063](5)向吸附柱CB3中加入500 μ I緩沖液⑶(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，OOOrpm(13, 400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0064](6)向吸附柱CB3中加入700 μ I漂洗液PW (使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，OOOrpm(13, 400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0065](7)向吸附柱083中加入50(^1漂`洗液1^，12，000印111(13，400\8)離心30秒，倒掉廢液。
[0066](8)將吸附柱CB3放回收集管中，12，OOOrpm(13, 400Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
[0067](9)將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100 μ I洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12，OOOrpm(13, 400 X g)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。
[0068]2、PCR 擴增
[0069]一例樣本的總 Real-time PCR 體系為 25ul:2*qPCR MIX12.5ul、引物 SEQ NOl 和SEQ N02 各 0.8ul、探針 SEQ N03 和 SEQ N04 各 0.4ul、滅菌水 8.lul.DNA 模板 2ul。
[0070]Real-time PCR 反應程序:95°C 5min 預變性；95°C 15s，62°C 30s。
[0071]3、結果分析，具體為:若樣本只產(chǎn)生一條擴增曲線，則根據(jù)相對應的探針判斷其突變型；若樣本產(chǎn)生兩條擴增曲線，則判定樣本為雜合突變型。
[0072]實施例4:臨床樣本檢測
[0073]取待檢的臨床樣本A、B、C，按實施例3的方法提取DNA、配制溶液并檢測。
[0074]樣本A的Real-time PCR結果如圖2所示，由于只產(chǎn)生一條擴增曲線，且對應探針SEQ N03,因此A樣本為野生型，即Pro/Pro型。
[0075]樣本B的Real-time PCR結果如圖3所示，由于只產(chǎn)生一條擴增曲線，且對應探針SEQ N04，因此B樣本為純合突變型，即Arg/Arg型。
[0076]樣本C的Real-time PCR結果如圖4所示，由于產(chǎn)生兩條擴增曲線，因此C樣本為雜合突變型，即Arg/Pro型。
[0077]為了驗證圖2~4的結果,對樣本A、B、C進行sanger測序，圖5~7是樣本A、B、C的sanger測序圖譜，表明sanger檢測結果 與本發(fā)明所述的檢測結果一致。這一結果表明本發(fā)明具有操作簡單、檢測快速，靈敏度高，有助于臨床醫(yī)生更好地進行預后判斷。
【權利要求】
1.檢測TP53Pro72Arg位點突變的寡核苷酸，包括PCR擴增引物，所述的PCR擴增引物為 SEQ NOl 和 SEQ NO 2:
SEQ NOl: CGGACGATATTGAACAATGGTTC ；
SEQ N02:CGTAGCTGCCCTGGTAGGTT。
2.如權利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，還包括檢測探針為SEQN03和SEQN04:
SEQ N03: FAM-AGGCTGCTCCCCCCGT-MGB ；
SEQ N04:HEX-AGGCTGCTCCCCGCGT-MGB。
3.如權利要求2所述的寡核苷酸，其特征在于，SEQN03能結合野生型TP53的擴增產(chǎn)物。
4.如權利要求2所述的寡核苷酸，其特征在于，SEQN04能結合突變型TP53的擴增產(chǎn)物。
5.一種檢測TP53 Pro72Arg位點突變的方法，包括: (1)樣本DNA提??； (2)Real-time PCR擴增反應，以DNA為模板，依據(jù)所述的特異性擴增引物和特異性檢測探針，將所有引物及探針加入同一 PCR反應管中進行Real-time PCR擴增，其中:PCR擴增引物為SEQ NOl和SEQ NO 2，分別是:
SEQ NOl: CGGACGATATTGAACAATGGTTC ；
SEQ N02: CGTAGCTGCCCTGGTAGGTT ； 檢測探針為SEQ N03和SEQ N04，分別是:
SEQ N03: FAM-AGGCTGCTCCCCCCGT-MGB ；
SEQ N04: HEX-AGGCTGCTCCCCGCGT-MGB ； (3)結果分析，根據(jù)Real-timePCR結果來分析樣本的Pro72Arg突變型。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，總Real-timePCR擴增體系為25ul:包括2*qPCR MIX 12.5ul、引物 SEQ NOl 和 SEQ N02 各 0.8ul、探針 SEQ N03 和 SEQ N04 各 0.4ul、滅菌水 8.1ul、DNA 模板 2 ul。
7.如權利要求6所述的方法,其特征在于，Real-timePCR反應程序:95°C 5min預變性；95°C 15s，62。。30s。
8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，結果分析中，若樣本只產(chǎn)生一條擴增曲線，則根據(jù)相對應的探針判斷其突變型；若樣本產(chǎn)生兩條擴增曲線，則判定樣本為雜合突變型。
【文檔編號】C12N15/11GK103740818SQ201310715004
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月20日 優(yōu)先權日:2013年12月20日
【發(fā)明者】陳奕磊, 李文靜, 王淑一 申請人:廣州艾迪康醫(yī)學檢驗所有限公司