重組酮還原酶及使用其制備奧拉西坦中間體的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組酮還原酶，編碼所述重組酮還原酶的核苷酸及氨基酸序列，以及使用所述重組酮還原酶催化還原生產奧拉西坦中間體的用途。本發(fā)明還具體提供了一種采用上述重組酮還原酶生物催化法制備4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，該方法反應條件溫和，溶劑用量少，污染和能耗減少，成本大大降低，更加綠色環(huán)保，更加適合工業(yè)化生產。
【專利說明】重組酮還原酶及使用其制備奧拉西坦中間體的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物制備【技術領域】，具體涉及一種奧拉西坦中間體的制備方法，更具體涉及一種重組酮還原酶及其在4-氯-3-羥基丁酸乙酯生產中的應用。
【背景技術】
[0002]奧拉西坦是一種合成的羥基氨基丁酸環(huán)狀衍生物，可以改善老年癡呆和記憶障礙癥患者的記憶和學習功能，臨床上用于治療中度血管性癡呆，老年性癡呆以及腦外傷等癥引起的記憶與智能障礙，因其療效確切、安全性好近年來在國內癡呆藥物市場一直處于領先地位，成為臨床應用中最重要的癡呆治療藥物。目前奧拉西坦合成過程大多是以雙烯酮作為起始原料，經中間體4-氯-3-羥基丁酸乙酯，最終與甘氨酰胺鹽酸鹽經環(huán)合制備。因此4-氯-3-羥基丁酸乙酯成為奧拉西坦的一種重要中間體，開發(fā)其新的生產工藝具有重要意義。
[0003]目前公開的有關4-氯-3-羥基丁酸乙酯的制備方法主要采用化學還原方法，反應條件往往需要低溫或高溫，存在危險性高、環(huán)境污染大、成本高的問題。如專利CN101693684報道利用NaBH4或KBH4催化還原羰基，反應過程中需要消耗大量的醇類溶劑，催化劑的用量也較大，且無法回收利用，反應還需要低溫進行，不僅造成能耗很高，成本無優(yōu)勢還會產生大量廢水。專利CN102633705報道采用金屬銠、釕、鈀作為催化劑，在高溫高壓條件下進行催化還原，不僅耗費大量昂貴的催化劑，而且廢棄的重金屬催化劑還會對環(huán)境造成嚴重污染，另外該反應條件苛刻，同樣造成能耗高和生產成本高的問題。因此研究開發(fā)一種污染小、能耗低、成本低、可規(guī)?；a4-氯-3-羥基丁酸乙酯的技術以替代目前的化學還原工藝成為迫切需要。
[0004]生物催化法的反應條件溫和，具有高效率、低污染、低能耗，更加綠色環(huán)保的特點，越來越受到化學和制藥工業(yè)界的關注，成為當前世界上解決化學法諸多弊端的最佳途徑。但目前未見有關生物法制備4-氯-3-羥基丁酸乙酯的文獻報道。
[0005]本專利公開了一種改進的利用重組酮還原酶生產4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，不僅避免了化學法中存在的種種問題，而且反應條件溫和，有機溶劑使用量少，大大減低了成本，具有重要的工業(yè)應用價值。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的第一個目的是提供一種重組酮還原酶，編碼所述重組酮還原酶的核苷酸及氨基酸序列。
[0007]本發(fā)明第二個目的提供所述重組酮還原酶的制備方法。
[0008]本發(fā)明再一個目的提供所述重組酮還原酶的用途。
[0009]本發(fā)明的最 后一個目的是提供一種奧拉西坦中間體4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法。
[0010]本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的，采用如下技術方案:[0011]重組酮還原酶，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0012]上述重組酮還原酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0013]一種制備上述重組酮還原酶的方法，包括如下步驟:
[0014]將含有酮還原酶基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于35~40°C下?lián)u床活化8~12小時，將活化后得到的培養(yǎng)物接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于35~40°C下?lián)u床擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)至0D600值達到0.6~0.8時，加入誘導劑，于25~33°C下繼續(xù)培養(yǎng)8~12小時，離心，收集沉淀物，加入三乙醇胺緩沖液懸浮，將懸浮液置于冰水浴中超聲破碎8~12分鐘，再離心，上清液即為重組酮還原酶。
[0015]上述制備重組酮還原酶的方法，所述誘導劑為異丙基_β-D-硫代半乳糖苷或乳糖。
[0016]上述重組酮還原酶的用途，將重組酮還原酶用于生物催化還原4-氯乙酰乙酸乙酯制備奧拉西坦中間體4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
[0017]一種使用上述重組酮還原酶生物催化制備奧拉西坦中間體4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，以重組酮還原酶為生物催化劑、以NAD/NADH或NADP/NADPH為輔因子，以葡萄糖為氫供體，以葡萄糖脫氫酶為輔因子再生體系，在25~30°C條件下，在pH6.5~7.0的水相緩沖液或水相緩沖液-乙酸正丁酯兩相體系中進行還原反應生成4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
[0018]上述制備奧拉西坦中間體4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，所述還原反應在反應起始時的反應體系中，底物濃度以g/ml計為14~18%，重組酮還原酶用量為底物4-氯乙酰乙酸乙酯質量的I~5%，輔因子用量為底物質量的0.01~0.03%，葡萄糖脫氫酶用量為底物質量的0.2~0.3%，葡萄糖用量與底物的物質的量的比為1.2~1.5:1。
[0019]上述制備奧拉西坦中間體4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述的水相緩沖液為磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖溶液或三乙醇胺-鹽酸緩沖溶液，所述的水相緩沖液-乙酸正丁酯兩相體系中水相緩沖液與乙酸正丁酯的體積比為1:0.4~0.7。
[0020]上述制備奧拉西坦中間體4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述的輔因子為 NADP/NADPH。
[0021]上述制備奧拉西坦中間體4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述的還原反應在pH為7.0的水相緩沖液體系中進行。
[0022]所述的制備方法的實施過程如下:在反應容器中依次加入底物4-氯乙酰乙酸乙酯，水相緩沖液或水相緩沖液-乙酸正丁酯，葡萄糖，攪拌均勻，繼續(xù)加入重組酮還原酶，葡萄糖脫氫酶和輔因子，在25~30°C下，攪拌反應，用NaOH或KOH或Na2CO3溶液滴定保持恒定pH6.5~7.0，利用GC檢測反應進程，待轉化率達99%以上時，過濾，濾液加入乙酸正丁酯多次萃取或將濾液靜置分層取水相加入乙酸正丁酯萃取，合并有機相并蒸發(fā)脫去溶劑，即得4-氯-3-羥基丁酸乙酯廣品。
[0023]本發(fā)明技術方案中所用到的材料、試劑等，除重組酮還原酶外均可由商業(yè)途徑購
買獲得。 [0024]本發(fā)明的有益結果在于:
[0025]本發(fā)明的重組的酮還原酶，能在水相緩沖液或水相緩沖液-乙酸正丁酯兩相體系中保持較高的活性，可以高效率、快速催化還原4-氯乙酰乙酸乙酯制備奧拉西坦的重要中間體4-氯-3-羥基丁酸乙酯，能在較短時間內達到99%以上的轉化率；并且本發(fā)明采用改進的工藝，使得反應條件溫和，有機溶劑用量少，減少了能耗和污染、大大降低了生產成本，更加綠色環(huán)保，更加適合工業(yè)化生產。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]本發(fā)明的重組酮還原酶催化還原4-氯乙酰乙酸乙酯生成4-氯-3-羥基丁酸乙酯氣相色譜圖。
[0027]圖1.為實施例五反應O時樣品峰圖。
[0028]保留時間為7.672min的峰是底物4_氯乙酰乙酸乙酯。
[0029]圖2為實施例五反應中間時的樣品峰圖。
[0030]保留時間為7.675min的峰是底物4_氯乙酰乙酸乙酯；
[0031]保留時間為8.050min的峰是產物4_氯_3_羥基丁酸乙酯。
[0032]圖3為實施例五反應結束時樣品峰圖。
[0033]保留時間為8.036min的峰是產物4_氯_3_羥基丁酸乙酯。
[0034]序列說明
[0035]SEQ ID N0.1
[0036]含有酮還原酶基因的重組大腸桿菌
[0037]重組酮還原酶的核苷酸序列
[0038]ATGTTAAGTCTTGGTTTGGAAGATAAAGTAATCGTGGTCACCGGCGGCAATCGGGG CATCGGCGCGGCGATCGTGAAATTACTCCAGGAAATGGGGGTCAAAGTAGCTTTTACCG ATTTAGCTACGGACGGGGGTAATACTGAAGCCCTGGGGGTGGTGGCCAACGTCACCGAT TTGGAATCCATGTCGGCGGCGGCAGCGGAAATCACCGATAAGCTGGGCCCCGTTTACGG TGTGGTGGCCAATGCCGGTATCACCAAAGACAACTTTTTCCCAAAATTAACCCCCGCCG ATTGGGAAGCAGTGTTGAACGTTAACTTGAAAGGGGTAGCCTACAGCATTAAGCCTTTC ATCGAAGGCATGTATGAACGGAAAGCCGGCTCCATTGTGGCCATTAGTTCCATCTCCGGG GAGCGGGGTAACGTCGGTCAAACTAACTATTCCGCCACTAAAGCTGGGGTAATTGGCAT GATGAAATCCCTGGCTCGGGAAGGGGCCCGGTATGGAGTGCGGGCCAATGCAGTAGCC CCTGGTTTCATTGACACCGATATGACTTTGGCGATCCGGGAAGATATTCGGGAAAAAATT ACCAAGGAAATCCCCTTCCGCCGTTTTGGTAAACCGGAGGAAATTGCCTGGGCGGTGGC CTTTTTACTTTCCCCCGTAGCCAGTAGCTATGTCACCGGCGAAGTATTACGGGTAAATGG GGCCCACCACACCTAA
[0039]SEQ ID N0.2
[0040]含有酮還原酶基因的重組大腸桿菌
[0041]重組酮還原酶的氨基酸序列
[0042]MLSLGLEDKVIVVTGGNRGIGAAIVKLLQEMGVKVAFTDLATDGGNTEALGVVANVT DLESMSAAAAEITDKLGPVYGVVANAGITKDNFFPKLTPADWEAVLNVNLKGVAYSIKPFIE GMYERKAGSIVAISSISGERGNVGQTNYSATKAGVIGMMKSLAREGARYGVRANAVAPGFI DTDMTLAIREDIREKITKEIPFRRFGKPEEIAffAVAFLLSPVASSYVTGEVLRVNGAHHT
【具體實施方式】
[0043]本發(fā)明的反應式如下:
[0044]
【權利要求】
1.重組酮還原酶，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組酮還原酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.一種制備權利要求1或2所述的重組酮還原酶的方法，其特征在于，包括如下步驟: 將含有酮還原酶基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于35~40°C下?lián)u床活化8~12小時，將活化后得到的培養(yǎng)物接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于35~40°C下?lián)u床擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)至0D600值達到0.6~0.8時，加入誘導劑，于25~33°C下繼續(xù)培養(yǎng)8~12小時，離心，收集沉淀物，加入三乙醇胺緩沖液懸浮，將懸浮液置于冰水浴中超聲破碎8~12分鐘，再離心，上清液即為重組酮還原酶。
4.根據(jù)權利要求3所述的制備重組酮還原酶的方法，其特征在于，所述誘導劑為異丙基-β -D-硫代半乳糖苷或乳糖。
5.權利要求1或2所述的重組酮還原酶的用途，其特征在于，將重組酮還原酶用于生物催化還原4-氯乙酰乙酸乙酯制備奧拉西坦中間體4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
6.一種使用權利要求1或2所述的重組酮還原酶生物催化制備奧拉西坦中間體4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，以重組酮還原酶為生物催化劑、以NAD/NADH或NADP/NADPH為輔因子，以葡萄糖為氫供體，以葡萄糖脫氫酶為輔因子再生體系，在25~30度條件下，在ρΗ6.5~7.0的水相緩沖液或水相緩沖液-乙酸正丁酯兩相體系中進行還原反應生成4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
7.根據(jù)權利要求6所述的制備奧拉西坦中間體4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述還原反應在反應起始時的反應體系中，底物的濃度以g/ml計為14~18%,重組酮還原酶用量為底物4-氯乙酰乙酸乙酯質量的I~5%，輔因子用量為底物質量的0.01~0.03%，葡萄糖脫氫酶用量為底物質量的0.2~0.3%，葡萄糖用量與底物的物質的量的比為1.2 ~1.5:1。
8.根據(jù)權利要求7所述的制備奧拉西坦中間體4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述的水相緩沖液為磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖溶液或三乙醇胺-鹽酸緩沖溶液，所述的水相緩沖液-乙酸正丁酯兩相體系中水相緩沖液與乙酸正丁酯的體積比為1:0.4~0.7。
9.根據(jù)權利要求8所述的制備奧拉西坦中間體4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述的輔因子為NADP/NADPH。
10.根據(jù)權利要求9所述的制備奧拉西坦中間體4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述的還原反應在pH為7.0的水相緩沖液體系中進行。
【文檔編號】C12R1/19GK103695379SQ201310716599
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月20日 優(yōu)先權日:2013年12月20日
【發(fā)明者】王金戌, 高志峰, 張 育, 鄭雪清, 楊英梅, 周杰, 王晨光 申請人:石藥集團歐意藥業(yè)有限公司