一種糖化酶及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一方面提供一種糖化酶，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1。本發(fā)明的糖化酶的最適作用溫度為50℃，在35℃-60℃范圍內(nèi)能保持60%以上的酶活；最適作用pH為5.5，且在pH3.0-6.5范圍內(nèi)，能保持90%以上的酶活。該糖化酶可廣泛應(yīng)用于葡萄糖的生產(chǎn)中，5h時(shí)，其DE值（還原糖值）達(dá)到最高為95%，反應(yīng)液中葡萄糖的含量高達(dá)85%。本發(fā)明所述糖化酶還可用于甜味劑的生產(chǎn)中或用于生產(chǎn)有機(jī)物的發(fā)酵方法中，所述有機(jī)化合物例如乙醇、檸檬酸、抗壞血酸、氨基酸、抗生素等。
【專利說明】一種糖化酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及功能基因篩選領(lǐng)域，具體涉及一種糖化酶及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]糖化酶,又稱葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase),它能把淀粉從非還原性末端水解α -1，4葡萄糖苷鍵產(chǎn)生葡萄糖。糖化酶的底物專一性較低，它除了能從淀粉鏈的非還原性末端切開α-1，4鍵處，也能緩慢切開α_1，6糖苷鍵。因此，它能很快的把直鏈淀粉從非還原性末端依次切下葡萄糖單位，在遇到1，6鍵時(shí)，先將α-1，6鍵分割，再將α-1，4鍵分割，從而使支鏈淀粉水解成葡萄糖。
[0003]糖化酶用途廣泛，用于以葡萄糖作發(fā)酵培養(yǎng)基的各種抗生素、有機(jī)酸、氨基酸、維生素的發(fā)酵，還可用于生產(chǎn)各種規(guī)格的葡萄糖。凡對(duì)淀粉、糊精必需進(jìn)行酶水解的工業(yè)上，都可適用。糖化酶對(duì)設(shè)備沒有腐蝕，使用安全，且工藝簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定，利用糖化酶對(duì)淀粉進(jìn)行水解比較安全，還有利于實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)機(jī)械化和文明生產(chǎn)。
[0004]目前常用的糖化酶均是來(lái)自黑曲霉。自70年代中期開始，中科院微生物所篩選獲得了高產(chǎn)糖化酶菌株AS.3.4309。該菌株國(guó)內(nèi)許多大型抗生素制藥廠、酒精廠、釀酒廠進(jìn)行了生產(chǎn)規(guī)模試驗(yàn)，均獲得成功。該項(xiàng)目的成功為我國(guó)發(fā)酵行業(yè)節(jié)約了大量的糧食，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。市場(chǎng)越來(lái)越密切關(guān)注高轉(zhuǎn)化率糖化酶，這使得克隆和表達(dá)高轉(zhuǎn)化率糖化酶成為研究的熱點(diǎn)之一。蛋白表達(dá)系統(tǒng)是黑曲霉，其產(chǎn)酶量(蛋白量)較高，但是受到糖化酶本身性質(zhì)的影響，黑曲霉表達(dá)糖化酶的比活比較低，不能適應(yīng)市場(chǎng)的需求。因此，開發(fā)性能優(yōu)良 、比活高的糖化酶越來(lái)越受到各方的關(guān)注。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種新型糖化酶及其應(yīng)用，本發(fā)明從繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)克隆得到一種新型的糖化酶基因，并將其轉(zhuǎn)入里氏木霉(Trichodermareesei)中，構(gòu)建得到高效表達(dá)該糖化酶的重組菌株，顯著提高了糖化酶的產(chǎn)量，有利于糖化酶的廣泛應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明一方面涉及一種糖化酶，其特征在于，所述糖化酶包括:
[0007]a)其氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的酶；
[0008]b)其氨基酸序列與SEQ ID NO: 1相似性高于95%以上，且具有糖化酶功能的酶。
[0009]所述糖化酶的編碼基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
[0010]本發(fā)明另一方面涉及攜帶有上述糖化酶基因的表達(dá)載體。
[0011]一種工程菌株，其攜帶有上述表達(dá)載體。
[0012]所述工程菌為里氏木霉(Trichoderma reesei)。
[0013]本發(fā)明還涉及上述糖化酶的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明的糖化酶的最適作用溫度為50°C，在35°C _60°C范圍內(nèi)能保持60%以上的酶活；最適作用pH為5.5，且在pH3.0-6.5范圍內(nèi)，能保持90%以上的酶活。該糖化酶可廣泛應(yīng)用于葡萄糖的生產(chǎn)中，5h時(shí)，其DE值(還原糖值)達(dá)到最高為95%，反應(yīng)液中葡萄糖的含量高達(dá)85%。本發(fā)明所述糖化酶還可用于甜味劑的生產(chǎn)中或用于生產(chǎn)有機(jī)物的發(fā)酵方法中，所述有機(jī)化合物例如乙醇、檸檬酸、抗壞血酸、氨基酸、抗生素等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1:本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體質(zhì)粒圖譜。
[0016]圖2:里氏木霉工程菌發(fā)酵上清液的SDS-PAGE電泳分析圖，其中箭頭所指為重組表達(dá)的糖化酶。
[0017]圖3:本發(fā)明所述糖化酶作用溫度-相對(duì)酶活曲線圖。
[0018]圖4:糖化酶VL-2和VL-3作用溫度_相對(duì)酶活曲線圖。
[0019]圖5:本發(fā)明所述糖化酶作用pH-相對(duì)酶活曲線圖。
[0020]圖6:糖化酶VL-2和VL-3作用pH-相對(duì)酶活曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook,2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻(xiàn)提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。
[0022]除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通計(jì)數(shù)人員通常所理解的相同含義。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY, 3nd Ed.(Singleton et al., 2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY(Hale etal.，2003)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所`使用的許多術(shù)語(yǔ)的一般性解釋。
[0023]除非另作說明，核酸是按5,至3,方向從左至右書寫；氨基酸是按氨基至羧基的方向從左至右書寫。
[0024]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重組”當(dāng)被用于指代細(xì)胞、核酸、蛋白或載體時(shí)，表示該細(xì)胞、核酸、蛋白或載體已通過導(dǎo)入異源核酸或蛋白或者通過改變天然核酸或蛋白而被修飾。因此，例如，重組細(xì)胞是表達(dá)在天然(非重組)形式的該細(xì)胞中不曾發(fā)現(xiàn)的基因，或者表達(dá)天然基因。
[0025]術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文中可以互換使用。本文使用氨基酸殘基的傳統(tǒng)的單字母或三字母代碼。
[0026]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因”指參與生產(chǎn)多肽的DNA片段，包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，以及各編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內(nèi)含子)。
[0027]術(shù)語(yǔ)“核酸”包括DNA、RNA,單鏈或雙鏈的，以及它們的化學(xué)修飾物。
[0028]術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互換使用。
[0029]術(shù)語(yǔ)“載體”指被設(shè)計(jì)用來(lái)將核酸導(dǎo)入一種或多種細(xì)胞類型的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌粒、序列盒以及類似物。
[0030]術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”表示包含DNA序列的DNA構(gòu)建物，所述DNA序列被可操縱的連接于能夠影響該DNA在合適宿主中表達(dá)的合適的控制序列。此類控制序列可以包括完成轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、可選的控制轉(zhuǎn)錄的操縱子序列、編碼mRNA上合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、增強(qiáng)子以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。
[0031]與另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比較這兩個(gè)序列時(shí)所述百分比的堿基或氨基酸殘基是相同的。
[0032]由于遺傳密碼是簡(jiǎn)并的，所以可以使用一種以上的密碼子來(lái)編碼特定的氨基酸，本發(fā)明包括編碼特定的氨基酸序列的多核苷酸。
[0033]術(shù)語(yǔ)“宿主菌株”或“宿主細(xì)胞”是指表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物的合適宿主，所述表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物包含本發(fā)明的編碼脂肪酶的多核苷酸。具體而言，宿主菌株優(yōu)選地是絲狀真菌細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是野生型絲狀真菌宿主細(xì)胞或者經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“宿主菌株”或“宿主細(xì)胞”指由絲狀真菌菌株細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞核原生質(zhì)體。
[0034]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0035]實(shí)施例1基因克隆與表達(dá)載體構(gòu)建
[0036]1.1總DNA的提取
[0037]將繩狀青霉(購(gòu)自中國(guó)普通微生物囷種保減管理中心，囷株編號(hào)3.3791)過夜培養(yǎng)，取適量菌體置于離心管中，13000rpm離心5min，棄上清；加入400 μ 1抽提緩沖液(100mMTris-HCl, 100mM EDTA, 250mM NaCl, 1%SDS);然后加lOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打儀劇烈振蕩 2min 左右；65°C水浴 20min 后，加入 200 μ 110Μ NH4AC,冰浴 lOmin ；13000rpm 離心lOmin,取上清；加入2倍體積的無(wú)水乙醇,_20°C放置30min ;13000rpm離心lOmin,棄上清；用70%乙醇洗漆2次；晾干,加入水溶解,于_20°C保存。
[0038]1.2基因克隆
[0039]以1.1中提取的基因組總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下:
[0040]上游弓| 物:ATGACCGTTACAACTGCGCTCG[0041 ]下游引物:TTATTGCCACGAGTCGTTAATG
[0042]PCR 擴(kuò)增條件為 94°C 3min ；94°C 30S ；58°C 30S，72°C 2min30 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。連接T載體后，送至北京華大基因研究中心進(jìn)行測(cè)序分析。將擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果根據(jù)三連體密碼子原則進(jìn)行翻譯，獲得所述擴(kuò)增產(chǎn)物編碼的氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
[0043]經(jīng)NCBI Blast序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，SEQ ID NO: 1編碼的蛋白屬于糖苷水解酶第15家族，與Talaromyces marneffei的糖化酶氨基酸序列相似性最高，為92%,為一新的等位基因。
[0044]將所述糖化酶的氨基酸序列SEQ ID NO: 1按照里氏木霉的密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，其編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:2，由上海生工生物工程股份有限公司合成。在起始密碼子ATG前端加ΚρηΙ酶切位點(diǎn)，在終止密碼子ΤΑΑ后端加Xbal酶切位點(diǎn)，用于表達(dá)載體的構(gòu)建；將合成的核苷酸序列連接于PUC57載體，命名為pU-Glu9298。
[0045]將質(zhì)粒pU_Glu9298進(jìn)行Κρη I和Xba I雙酶切，回收所需目的條帶即糖化酶基因。同樣，對(duì)木霉表達(dá)質(zhì)粒pTG也進(jìn)行Κρη I和Xba I雙酶切；用T4連接酶將糖化酶基因和表達(dá)載體進(jìn)行22°C連接過夜；最后，把連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5a ;相應(yīng)陽(yáng)性克隆表達(dá)質(zhì)粒命名為pKVL-glu9298，質(zhì)粒圖譜如圖1所示。
[0046]實(shí)施例2里氏木霉工程菌株的構(gòu)建
[0047]接種里氏木霉菌絲于PDA平板上生長(zhǎng)4天；切取直徑約3cm的菌落置于約60mlYEG (0.5%酵母粉、1%葡萄糖)的液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；多層紗布過濾收集菌絲；將菌絲置于盛有20ml裂解酶液(0.2g/10ml,0.7M NaCl溶解，Sigma L1412)酶解2小時(shí)；取出酶解液，輕輕搖晃，倒于三層滅菌擦鏡紙過濾，收集濾液，3000rpm，離心lOmin ；棄上清，加5ml溶液2懸浮，然后3000rpm，離心lOmin ;加適量溶液2懸浮分裝(200 μ 1/管，108 個(gè)/ml)。
[0048]取pKVL-glu9298DNA加入到200 μ 1原生質(zhì)體中，接著加入50 μ 125%PEG溶液輕輕混勻，冰浴20min ;然后加入2ml25%PEG，輕輕混勻，室溫靜置5min，把原生質(zhì)體加到50ml左右熔化后冷卻至45-55°C的上層半固體培養(yǎng)基(0.l%MgS04, 1%KH2P04, 0.6%(NH4)2S04, 1%葡萄糖，18.3%山梨醇，0.35%瓊脂糖)，輕輕混勻后倒入含100 μ g/ml潮霉素下層基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板(2% 葡萄糖，0.5%(NH4)2S04, 1.5%KH2P04, 0.06%MgS04, 0.06%CaCl2,1.5% 瓊脂)，30°C黑暗培養(yǎng)數(shù)天至轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。
[0049]將轉(zhuǎn)化子接種于YEG (0.5%酵母粉、1%葡萄糖)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜培養(yǎng)，取適量菌體置于離心管中，13000rpm離心5min，棄上清；加入400 μ 1抽提緩沖液(lOOmMTris-HCl, lOOmM EDTA, 250mM NaCl, 1%SDS);然后加lOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打儀劇烈振蕩 2min 左右；65°C水浴 20min 后，加入 200 μ 110Μ NH4AC,冰浴 lOmin ；13000rpm 離心lOmin,取上清；加入2倍體積 的無(wú)水乙醇,_20°C放置30min ;13000rpm離心lOmin,棄上清；用70%乙醇洗漆2次；晾干,加入水溶解,于_20°C保存。
[0050]以上述提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，利用如下引物擴(kuò)增目的基因驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。[0051 ]上游引物:ATGACCGTTACAACTGCGCTCG ；
[0052]下游引物:TTGCCACGAGTCGTTAATGCAAG，
[0053]PCR 擴(kuò)增條件為 94。。3min ；94°C 30S ；58°C 30S，72°C 90S30 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將獲得的陽(yáng)性工程菌命名為里氏木霉 K-VL9298 (Trichoderma reesei K-VL9298)。
[0054]實(shí)施例3發(fā)酵和酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定
[0055]將上述里氏木霉工程菌K-VL9298接種于MM發(fā)酵培養(yǎng)基(1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，
2.5% 玉米漿，0.44%(NH4)2S04,0.09%MgS04, 2%KH2P04,0.04%CaCl2，0.018% 吐溫 _80，0.018%微量元素，0.018%聚丙二醇-2000)，28°C培養(yǎng)48小時(shí)，然后25°C乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)48小時(shí)，取發(fā)酵上清液，進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖2所示，其中箭頭所指處為重組表達(dá)的糖化酶，說明本發(fā)明的糖化酶基因在里氏木霉工程菌K-VL9298中得到表達(dá)，利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其蛋白表達(dá)量約為0.32g/L。
[0056]糖化酶酶活測(cè)定方法
[0057]甲、乙兩支50mL比色管，分別加入25mL的2%可溶性淀粉溶液和5mL的0.1M乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH4.6);于40±0.2°C的恒溫水浴中預(yù)熱5~lOmin。在甲管中加入酶制備液2.0mL搖勻并立即記時(shí)；反應(yīng)lh后，立即在甲、乙兩管各加0.2mL的20%氫氧化鈉溶液，立即搖勻并將兩管取出迅速用水冷卻；然后于乙管中補(bǔ)加酶制備液2.0mL(作為對(duì)照)。取兩管中上述反應(yīng)液各5mL放入碘量瓶中，準(zhǔn)確加入0.1N碘液10mL，再加0.1N氫氧化鈉溶液15mL (邊加邊搖晃)，放置暗處15min，加入2N硫酸2mL ;最后用0.05N硫代硫酸鈉溶液滴定至無(wú)色為終點(diǎn)。
[0058]酶活X = (A-B) XNX90.05Xn[0059]其中:X——酶活力單位，μ /g (mL);
[0060]A—空白試驗(yàn)消耗硫代硫酸鈉溶液的毫升數(shù)；
[0061]B——樣品消耗硫代硫酸鈉溶液的毫升數(shù)；
[0062]N——硫代硫酸鈉溶液的當(dāng)量濃度；
[0063]η-稀釋倍數(shù)；
[0064]90.05——lmLIN硫代硫酸鈉相當(dāng)葡萄糖毫克數(shù)；
[0065]按照上述方法測(cè)定上述搖瓶發(fā)酵上清液的酶活為527U/mL，說明本發(fā)明的糖化酶基因在里氏木霉工程菌中得到高效表達(dá)。
[0066]實(shí)施例4酶學(xué)性質(zhì)分析
[0067]為了進(jìn)一步分析本發(fā)明獲得的新型糖化酶的酶學(xué)性質(zhì)，對(duì)該酶的最適作用溫度和pH值進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)分別與 申請(qǐng)人:2012年申請(qǐng)的兩項(xiàng)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)柗謩e為201210491553.2和201210500500.2)中涉及的兩種糖化酶進(jìn)行了比較。
[0068]將發(fā)明專利201210491553.2中所述糖化酶命名為糖化酶VL-2;
[0069]將發(fā)明專利201210500500.2中所述糖化酶命名為糖化酶VL-3;
[0070]4.1最適作用溫度分析
[0071]在ρΗ5.0 條件下，分別在 30°C、35°C、40°C、45°C、5(TC、55°C、6(rC、65°C、70°C、75°C條件下測(cè)定本發(fā)明所述里氏木霉工程菌K-VL9298發(fā)酵上清液的酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。結(jié)果如圖3所示，本發(fā)明所述糖化酶的最適作用溫度為50°C，在35°C _60°C范圍內(nèi)能保持60%以上的酶活。
[0072]按照上述同樣方法分別檢測(cè)糖化酶VL-2和糖化酶VL-3的酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。結(jié)果如圖4所示，糖化酶VL-2和VL-3的最適作用溫度為70°C，在55°C _75°C能保持60%以上的酶活性。
[0073]4.2最適作用pH分析
[0074]在50°C條件下，分別用 pH 為 2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0、
7.5,8.0的緩沖液稀釋本發(fā)明所述里氏木霉工程菌K-VL9298發(fā)酵上清液，測(cè)定酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。結(jié)果如圖5所示，本發(fā)明所述的最適作用pH為5.5，且在PH3.0-6.5范圍內(nèi)，能保持90%以上的酶活。
[0075]按照上述同樣方法分別檢測(cè)糖化酶VL-2和糖化酶VL-3的酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。結(jié)果如圖6所示，糖化酶VL-2的最適作用pH為5.0，糖化酶VL-3的最適作用pH為5.5，在pH3.5-6.0范圍內(nèi)能保持80%以上的酶活水平。
[0076]綜上，與糖化酶V·L-2和VL-3相較，本發(fā)明獲得的新型糖化酶作用溫度略低，屬于中溫糖化酶，作用pH范圍更寬泛，因此，本發(fā)明所述新型糖化酶的應(yīng)用領(lǐng)域更寬泛。
[0077]實(shí)施例5本發(fā)明新型糖化酶的應(yīng)用
[0078]糖化酶能從糖鏈的非還原端高效分解α-l，4-糖苷鍵，可廣泛應(yīng)用于葡萄糖的生產(chǎn)。在生產(chǎn)中，先利用淀粉酶將淀粉液化，液化淀粉的pH約為5.5，降溫至55°C，然后加入糖化酶進(jìn)行后續(xù)的糖化過程。
[0079]取10ml液化淀粉，加入1.5ml本發(fā)明的重組糖化酶(1000U/mL) ;55°C作用3h后，測(cè)定反應(yīng)液的DE值(還原性糖值)，達(dá)到91% ;5h時(shí)，其DE值達(dá)到最高為95%，反應(yīng)液中葡萄糖的含量為85%。結(jié)果表明，本發(fā)明的糖化酶專一性強(qiáng)，能高效分解α-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)物中葡萄糖的含量高達(dá)85%。
[0080] 本發(fā)明的重組糖化酶還可用于甜味劑的生產(chǎn)中或用于生產(chǎn)有機(jī)物的發(fā)酵方法中，所述有機(jī)化合物例如乙醇、檸檬酸、抗壞血酸、氨基酸、抗生素等。
【權(quán)利要求】
1.一種糖化酶，其特征在于，所述糖化酶包括:a)其氨基酸序列為SEQID N0:1的酶；b)其氨基酸序列與SEQID NO: 1相似性高于95%以上，且具有糖化酶功能的酶。
2.一種基因，其特征在于，所述的基因編碼權(quán)利要求1所述的糖化酶。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列為SEQID N0:2。
4.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的重組表達(dá)載體攜帶有權(quán)利要求2所述的基因。
5.一種工程菌，其特征在于，所述的工程菌為攜帶有權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體的菌株。
6.如權(quán)利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述的菌株為里氏木霉。
7.權(quán)利要求1所述的糖化酶在葡萄糖、甜味劑或有機(jī)物生產(chǎn)中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的有機(jī)物為乙醇、檸檬酸、抗壞血酸、氨基酸或抗生素。`
【文檔編號(hào)】C12N1/15GK103667212SQ201310717049
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】劉士成, 吳佳鵬, 朱倩倩, 黃亦鈞, 張慧丹 申請(qǐng)人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司, 山東蔚藍(lán)生物科技有限公司