一種啟動子及表達外源蛋白的重組表達系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新的啟動子序列，可以應(yīng)用于柄籃狀菌表達系統(tǒng)，實現(xiàn)柄籃狀菌對外源蛋白的表達。本發(fā)明還構(gòu)建了一種新型表達載體，可用于以柄籃狀菌為宿主細胞的轉(zhuǎn)化方法；本發(fā)明還提供了一種表達外源蛋白的新方法，能高效表達黑曲霉（Aspergillus?niger）的植酸酶、特異腐質(zhì)霉（Humicola?insolens）的纖維素內(nèi)切酶、煙曲霉（Aspergillus?fumigatus）的脂肪酶、里氏木霉（Trichoderma?reesei）的木聚糖酶、枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）的果膠酶等多種外源基因，搖瓶發(fā)酵蛋白表達量約為0.3-1.0g/L，酶活約為30-90IU/ml。本發(fā)明提供的表達載體和表達外源蛋白的新方法將有利于實現(xiàn)更多蛋白質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)，從而降低生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種啟動子及表達外源蛋白的重組表達系統(tǒng)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和遺傳工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種啟動子及表達外源蛋白的重組表達系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)有價值的外源性蛋白質(zhì)是當(dāng)今生物技術(shù)研究與開發(fā)的熱點之一。細菌、酵母和絲狀真菌具有生長快、易培養(yǎng)、表達量高以及分子操作簡單的特點，這使得它們已廣泛地開發(fā)應(yīng)用于異源蛋白質(zhì)的表達(張小霞等，2004，國外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊)。目前已有的比較成熟的細菌類表達系統(tǒng)有大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌、假單胞菌和克雷伯氏菌等；而真菌類表達系統(tǒng)有酵母類和絲狀真菌類，其中酵母類有釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、多型漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母和乳酸克魯維酵母；而絲狀真菌類有鐮刀菌、木霉、黑曲霉、粗糙脈孢霉和米曲霉等。但由于受蛋白自身結(jié)構(gòu)、分子大小和翻譯后修飾等影響，不同表達系統(tǒng)中目的蛋白的表達量(活性)往往不一樣，這就需要選擇合適的表達系統(tǒng)。選擇合適的表達系統(tǒng)往往要考慮以下因素:表達量、目的用途、篩選策略、密碼偏愛性、蛋白可溶性、純化回收、宿主的蛋白酶和修飾系統(tǒng)等。尤其是目的蛋白的用途是重要的考慮因素，如藥物篩選要求保持蛋白天然狀態(tài)，抗原蛋白僅需考慮表達量，飼用或食用蛋白需要考慮表達系統(tǒng)的安全性，而工業(yè)應(yīng)用類則需多考慮蛋白的功能。因此，盡管很多研究機構(gòu)和生物企業(yè)開發(fā)了很多表達系統(tǒng)；但是，每個表達系統(tǒng)總有其優(yōu)點和缺點，任何一個表達系統(tǒng)不可能適合表達所有的蛋白。
[0003]下面介紹目前使用的幾種表達系統(tǒng):
[0004]I)大腸桿菌表達系統(tǒng)開發(fā)至今已超過30年、也是應(yīng)用最廣泛的蛋白表達系統(tǒng)；其優(yōu)點是遺傳背景清楚、繁殖快、表達量高(l_5g/l);但是缺點也很明顯，對結(jié)構(gòu)復(fù)雜如二硫鍵的蛋白極易形成無活性的包`涵體，加之胞內(nèi)表達需要破碎細胞、使得下游處理工藝復(fù)雜(Jana, S., and Deb, J.Κ.2005, App1.Microbiol.Biotechnol.)。
[0005]2)德國MoBiTec公司開發(fā)了 B.megaterium和B.subtilis為宿主的表達系統(tǒng)。芽孢桿菌宿主的優(yōu)點是:公認(rèn)的安全菌株、分泌表達、無明顯的密碼偏愛性。其缺點是:分泌大量能降解目的蛋白的胞外蛋白酶。因此，敲除芽孢桿菌的蛋白酶基因是其高效表達的關(guān)鍵步驟之一。
[0006]3)鏈霉菌是革蘭氏陽性原核細菌，它具有發(fā)酵成本低，分泌水平高的特點。但是，鏈霉菌往往不能高水平的表達真核生物的基因。目前，報道最多的是變鉛青鏈霉素(Steptomyces lividans)。加拿大Cangene公司利用該菌生產(chǎn)的巨卩遼細胞集落刺激因子已到 III期臨床水平。
[0007]4)酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)點是代時短、生長快，分泌表達和翻譯后修飾系統(tǒng)；所以其表達蛋白多能正確折疊而具活性。由酵母成功表達的蛋白有3000多種，包括以用于臨床的胰島素和乙肝疫苗等。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)應(yīng)用歷史最悠久,廣泛應(yīng)用于釀酒和烘焙；也是第一個用于異源表達的酵母(Strausberg and Strausberg, 2001, Curr.Protoc.Protein Sci)0 S.verevisiae缺點是質(zhì)粒不穩(wěn)定、拷貝數(shù)低和表達蛋白的高度糖基化。目前，已開發(fā)的酵母類表達系統(tǒng)有很多；其中畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統(tǒng)應(yīng)用最廣最成功、蛋白表達量達77mg-20g/l不等；其表達的分子量最大蛋白是β -半乳糖苷酶(117kDa) (Cregg, J.Μ., 2007, Methods Mol.Biol.)。
[0008]5)絲狀真菌具有很高的蛋白質(zhì)分泌能力，能進行各種翻譯后加工，如內(nèi)含子剪切和糖基化修飾等。絲狀真菌如曲霉(Aspergillus)等又是公認(rèn)安全菌株(GRAS);因此絲狀真菌表達生產(chǎn)外源蛋白已經(jīng)廣泛用于工業(yè)酶的生產(chǎn)(唐國敏，1992，真菌學(xué)報；吳其威，1993，生命科學(xué))。已成功工業(yè)化開發(fā)的絲狀真菌表達系統(tǒng)有里氏木霉表達系統(tǒng)，黑曲霉表達系統(tǒng)和米曲霉表達系統(tǒng)等。
[0009]盡管上述表達系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，但仍然不能滿足工業(yè)上對于成本降低的需要，此外，還有很多蛋白因為沒有合適的表達系統(tǒng)，無法實現(xiàn)放大生產(chǎn)和應(yīng)用，因此開發(fā)新型的表達系統(tǒng)，尋找更多、更高效的表達外源蛋白的方法，一直是本領(lǐng)域技術(shù)人員的研究熱點和難點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種新型啟動子及由該啟動子所構(gòu)建的表達外源蛋白的表達系統(tǒng)。 申請人:從柄籃狀菌(Talaromyces stipitatus)中分離得到了 cbhl(纖維素外切酶I)啟動子和終止子序列，構(gòu)建得到一種新型表達載體，并開發(fā)出一種以柄籃狀菌為宿主細胞、以硫胺素作為篩選標(biāo)記的高效表達外源蛋白的方法，從而豐富現(xiàn)有的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)。
[0011]本發(fā)明一方面提供了一種啟動子，其特征在于，所述啟動子包含有:
[0012]a)核苷酸序列為SEQ ID NO:1的啟動子；
[0013]b)與a)中的啟動`子序列相似性不低于90%,且具有a)中啟動子功能的啟動子。
[0014]上述b)中序列相似度優(yōu)選為95%，更優(yōu)為98%.[0015]本發(fā)明另一方面提供了一種含有上述啟動子的表達載體。
[0016]所述表達載體優(yōu)選攜帶有柄籃狀菌cbhl基因的終止子。
[0017]所述終止子，其一種核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
[0018]在表達載體上還包含有篩選標(biāo)記，
[0019]所述的篩選標(biāo)記可以是表達載體中常用的。
[0020]本發(fā)明還提供一種表達系統(tǒng)，其中宿主為柄籃狀菌，表達載體為攜帶有上述啟動子的真核表達載體；
[0021]上述的表達系統(tǒng)中，篩選標(biāo)記優(yōu)選為硫胺素抗性基因(Pyrithiamine ResistanceGene,ptrA)。
[0022]所述的柄籃狀菌宿主優(yōu)選柄籃狀菌VL-1 (Talaromyces stipitatus VL-1),已于2013年12月20日保藏于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCN0:M2013679o
[0023]本發(fā)明還提供了一種表達外源蛋白的方法，包括如下步驟:
[0024]I)外源基因的克隆；
[0025]2)利用上述表達載體，構(gòu)建攜帶步驟I)外源基因的重組表達載體；[0026]3)將重組表達載體轉(zhuǎn)化柄籃狀菌，獲得重組表達外源蛋白的重組菌株。
[0027]其中步驟3)所述轉(zhuǎn)化方法可選用電擊轉(zhuǎn)化法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法中的任意一種。
[0028]步驟3)所述轉(zhuǎn)化方法優(yōu)選原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。
[0029]所述原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法包括柄籃狀菌原生質(zhì)體的制備、轉(zhuǎn)化和篩選步驟，
[0030]所述柄籃狀菌原生質(zhì)體的制備方法，包括:將柄籃狀菌接種至YEG培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為26-32°C，優(yōu)選28°C ;轉(zhuǎn)速為200_250rpm，優(yōu)選200rpm ;培養(yǎng)時間為20-36小時，優(yōu)選24小時；加入去細胞壁的酶，可選自溶壁酶，蝸牛酶和/或纖維素酶，優(yōu)選裂解酶，其工作濃度為5-20mg/ml，優(yōu)選10mg/ml，作用2-4小時。
[0031]所述轉(zhuǎn)化方法選用的融合試劑為聚乙二醇(PEG)，優(yōu)選PEG4000。
[0032]所述篩選方法中選用的篩選標(biāo)記優(yōu)選硫胺素抗性基因(PyrithiamineResistance Gene, ptrA),其工作濃度為 0.4-1.4 μ g/ml。
[0033]本發(fā)明提供了一種新的啟動子序列，可以應(yīng)用于柄籃狀菌表達系統(tǒng)，實現(xiàn)柄籃狀菌對外源蛋白的表達。本發(fā)明還構(gòu)建了一種新型表達載體，可用于以柄籃狀菌為宿主細胞的轉(zhuǎn)化方法；本發(fā)明還提供了一種表達外源蛋白的新方法，能高效表達黑曲霉(Aspergillus niger)的植酸酶、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的纖維素內(nèi)切酶、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)的脂肪酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)的木聚糖酶、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的果膠酶等多種外源基因，搖瓶發(fā)酵蛋白表達量約為0.3-1.0g/L，酶活約為30-90IU/ml。本發(fā)明提供的表達載體和表達外源蛋白的新方法將有利于實現(xiàn)更多蛋白質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)，從而降低生產(chǎn)成本。`【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1:柄籃狀菌野生型和突變體菌落形態(tài)比較。
[0035]圖2:表達質(zhì)粒pTS-phyA的質(zhì)粒圖譜，
[0036]其中，Pcbhl為啟動子序列(SEQ ID NO: l)，phyA指被表達的植酸酶基因，Tcbhl為終止子序列(SEQ ID NO:2)，Amp為氨芐青霉素抗性標(biāo)記，ColE ori為質(zhì)粒復(fù)制起始位點。
[0037]圖3:陽性轉(zhuǎn)化子TS-1的搖瓶發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳圖，其中，泳道I為蛋白maker ;泳道2為宿主陰性對照；泳道3為陽性轉(zhuǎn)化子TS-1發(fā)酵上清液，箭頭所指處蛋白條帶即為重組表達的外源植酸酶。
[0038]圖4:陽性轉(zhuǎn)化子發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳圖，其中泳道1，2，3分別為獲得的三個陽性轉(zhuǎn)化子發(fā)酵上清液，箭頭所指處蛋白條帶即為重組表達的外源纖維素內(nèi)切酶。
【具體實施方式】
[0039]本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook,2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(AusubeI, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。而不僅限于實施例所記載的具體方法、實驗方案和試劑，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可在本發(fā)明技術(shù)方案的基礎(chǔ)上選擇其它常規(guī)方法。
[0040]除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通計數(shù)人員通常所理解的相同含義。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY, 3nd Ed.(Singleton et al.，2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY(Hale etal.，2003)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所使用的許多術(shù)語的一般性解釋。
[0041]除非另作說明，核酸是按5,至3,方向從左至右書寫；氨基酸是按氨基至羧基的方向從左至右書寫。
[0042]如本文所用，術(shù)語“重組”當(dāng)被用于修飾細胞、核酸、蛋白或載體時，表示該細胞、核酸、蛋白或載體已通過導(dǎo)入異源核酸或蛋白或者通過改變天然核酸或蛋白而被修飾。因此，例如，重組細胞是表達在天然(非重組)形式的該細胞中不曾發(fā)現(xiàn)的基因，或者表達天然基因。
[0043]術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文中可以互換使用。本文使用氨基酸殘基的傳統(tǒng)的單字母或三字母代碼。
[0044]如本文所用，術(shù)語“基因”指參與生產(chǎn)多肽的DNA片段，包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，以及各編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內(nèi)含子)。
[0045]術(shù)語“核酸”包括DNA、RNA,單鏈或雙鏈的，以及它們的化學(xué)修飾的衍生物。
[0046]術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互換使用。
[0047]術(shù)語“載體”指被設(shè)計用來將核酸導(dǎo)入一種或多種細胞類型的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌粒、序列盒以及類似物。
[0048]術(shù)語“表達載體”表示包含目的DNA序列的DNA構(gòu)建物，所述DNA序列被可操縱的連接于能夠影響該DNA在合適宿主中表達的合適的控制序列。此類控制序列可以包括完成轉(zhuǎn)錄的啟動子、可選的控制轉(zhuǎn)錄的操縱子序列、編碼mRNA上合適的核糖體結(jié)合位點的序列、增強子以及控制轉(zhuǎn)錄和翻 譯的終止的序列。
[0049]術(shù)語“啟動子”表示參與結(jié)合RNA聚合酶以啟動基因轉(zhuǎn)錄的的調(diào)控序列。啟動子可以是誘導(dǎo)型啟動子或組成型啟動子。
[0050]術(shù)語“終止子”表示DNA分子中終止轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。
[0051]與另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比較這兩個序列時所述百分比的堿基或氨基酸殘基是相同的。
[0052]由于遺傳密碼是簡并的，所以可以使用一種以上的密碼子來編碼特定的氨基酸，本發(fā)明包括編碼特定的氨基酸序列的多核苷酸。
[0053]術(shù)語“篩選標(biāo)記”表示抗生素抗性標(biāo)記基因，如紅霉素、氯霉素等抗性標(biāo)記基因。依據(jù)原理是負(fù)篩選，即未轉(zhuǎn)化細胞被抗生素殺死，而轉(zhuǎn)化細胞因攜帶抗生素抗性基因而存活，從而將含有外源基因的轉(zhuǎn)化細胞和不含外源基因的非轉(zhuǎn)化細胞分開。
[0054]術(shù)語“宿主菌株”或“宿主細胞”是指表達載體或DNA構(gòu)建物的合適宿主，所述表達載體或DNA構(gòu)建物包含本發(fā)明的編碼脂肪酶的多核苷酸。具體而言，宿主菌株優(yōu)選地是絲狀真菌細胞。該宿主細胞可以是野生型絲狀真菌宿主細胞或者經(jīng)遺傳修飾的宿主細胞。術(shù)語“宿主菌株”或“宿主細胞”指由絲狀真菌菌株細胞所產(chǎn)生的細胞核原生質(zhì)體。
[0055]如本文所用，術(shù)語“柄籃狀菌”，拉丁文名“Talaromyces stipitatus”,本發(fā)明所述柄籃狀菌還涉及柄籃狀菌的亞種，以及以該菌株為野生型獲得的突變型。
[0056]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的方法進行詳細的描述。
[0057]實施例1柄籃狀菌(Talaromyces stipitatus)的活化[0058]本發(fā)明選用的柄籃狀菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌株編號CGMCC3.4299。
[0059]配制PDA固體平板:稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000ml煮沸半個小時，紗布過濾，再加20g葡萄糖和15g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，115°C滅菌30分鐘后，備用；
[0060]菌種活化:將上述柄籃狀菌接種至PDA固體平板上進行菌種活化，培養(yǎng)溫度為28℃。
[0061]實施例2表達質(zhì)粒的構(gòu)建
[0062]2.1柄籃狀菌基因組DNA的提取
[0063]從PDA固體平板上刮取上述柄籃狀菌菌絲，放入2ml的印pendorf管中，加入500 μ 1 的 2XCTAB 緩沖液(100mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 20mmol/LEDTA, 1.4mol/L NaCl,2%(w/v)CTAB，40mmol/L巰基乙醇)和 500 μ 1 酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)溶液，37°C，220rpm振蕩1-1.5h，然后離心13200rpmX15min ;取上清液并加入等體積的異丙醇，-20°C沉淀0.5-2小時，然后離心12000rpmX IOmin ;最后，用75%乙醇洗滌沉淀I次、待沉淀干燥后加入30-50 μ 1含有RNase的去離子水；提取的DNA作為PCR反應(yīng)模板。
[0064]2.2cbhl啟動子序列的克隆
[0065]以實施例2.1中提取的柄籃狀菌基因組DNA為模板，利用引物proF和proR進行PCR擴增。
[0066]proF:CTGAAGCAAAGCAACAGCTC
[0067]proR:ACATGCATTGTGTCGTTTGCTTCTATTC ；
[0068]其中ATGCAT為Sph I酶切位點。
[0069]PCR 擴增條件是:95 °C 4min ；94 °C 40S ；55 °C 30S，72 °C 1.5min30 個循環(huán)；72°C7min。擴增產(chǎn)物凝膠回收后，克隆至pMD18_T simple載體(購自TaKaRa)，獲得質(zhì)粒pTPcbh，將質(zhì)粒進行測序分析，結(jié)果顯示克隆得到的cbhl基因的啟動子序列為SEQ IDNO:1。
[0070]NCBI Blast序列比對結(jié)果顯示，本發(fā)明克隆得到的cbhl基因的啟動子序列SEQID NO:1與現(xiàn)有序列的相似性最高僅為47.7%，該啟動子并沒有在現(xiàn)有技術(shù)文獻中報道過，為一新型的啟動子。
[0071]2.3cbhl終止子序列的克隆
[0072]以實施例2.1中提取柄籃狀菌的基因組DNA為模板，利用引物terF和terR進行PCR擴增。
[0073]
【權(quán)利要求】
1.一種啟動子，其特征在于，所述啟動子包含有: a)核苷酸序列為SEQID NO:1的啟動子； b)與a)中的啟動子序列相似性不低于90%，且具有a)中啟動子功能的啟動子。
2.一種表達載體，包括有啟動子和終止子，其特征在于所述的啟動子為權(quán)利要求1所述的啟動子。
3.如權(quán)利要求2所述的表達載體，其特征在于所述的終止子的核苷酸序列為SEQIDNO:2。
4.如權(quán)利要求2或3所述的表達載體，其特征在于所述的表達載體上還包含有篩選標(biāo)記。
5.如權(quán)利要求4所述的表達載體，其特征在于所述的篩選標(biāo)記為硫胺素抗性基因PtrA0
6.一種外源蛋白表達系統(tǒng)，包含有宿主和表達載體，其特征在于，所述的宿主為柄籃狀菌，表達載體為權(quán)利要求2所述的表達載體。
7.如權(quán)利要求6所述的外源蛋白表達系統(tǒng)，其特征在于，所述的外源蛋白表達系統(tǒng)的篩選標(biāo)記為硫胺素抗性基因。
8.如權(quán)利要求6所述的外源蛋白表達系統(tǒng)，其特征在于，所述的柄籃狀菌為柄籃狀菌VL-1，保藏編號為 CCTCC N0:M2013679o
9.一種表達外源蛋白的方法，包括如下步驟: 1)外源基因的克隆； 2)利用權(quán)利要求2所述的表達載體，構(gòu)建攜帶步驟I)外源基因的重組表達載體； 3)將重組表達載體轉(zhuǎn)化柄籃狀菌，獲得重組表達外源蛋白的重組菌株。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述的步驟3)中的轉(zhuǎn)化柄籃狀菌，所述的轉(zhuǎn)化為電擊轉(zhuǎn)化法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法中的任意一種。
【文檔編號】C12R1/645GK103757019SQ201310717119
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】王華明, 黃亦鈞, 趙倩, 許韡, 張慧丹, 劉士成 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司